淀粉酶及其同工酶

淀粉酶及其同工酶1.分类血清淀粉酶同工酶分成S(唾液型)型和P(胰型)。2.关于淀粉酶同工酶的研究除了胰腺、腮腺疾病外还有一些疾病如胆囊炎、小肠梗阻、消化道溃疡穿孔、异位妊娠、恶性肿瘤等也可出现血清淀粉酶活性增高，可能的原因之一就是这些患病组织含有淀粉酶，在炎症时通过各种途径入血引起血清淀粉酶活性增高。但至今国内外对于各种人体组织淀粉酶含量的研究报告甚少。我们收集了部分正常人体组织，经匀浆后测出匀浆上清液中的总淀粉酶(Amy)活性，并用抑制法测定唾液型和胰型淀粉酶同工酶(S-Amy和P-Amy)，从而为探讨临床上血清淀粉酶增高机制提供了实验依据。1材料1.1仪器Beckman Clinical System 700型生化分析仪。高速台式离心机，KD-300组织匀浆器。1.2试剂淀粉酶活性测定采用上海长征公司淀粉酶试剂盒(PNPG4法)。淀粉酶抑制物，为小麦唾液淀粉酶抑制蛋白，由上海长征医院临床酶学研究室纯化和提供1。1.3材料和样品采集意外死亡的正常人3名，2名男性分别为25岁、28岁，1名女性55岁，于死亡后6 h内采集样品，取胰腺、腮腺、胃、空肠、回肠、输卵管、子宫、肺、胆囊、骨骼肌和睾丸组织，各取20 g左右。2方法2.1组织匀浆液的制备每种组织重复取样6次，每次取500 mg，先用生理盐水清洗，加入pH 7.4的0.01 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液2 ml后置组织匀浆器中进行匀浆。匀浆器转速为15 000 r/min，时间为30 s4次。将匀浆液3 000 r/min离心10 min。离心完毕后，吸取上清液进行总淀粉酶和淀粉酶同工酶测定。此步可使95%以上的细胞破碎并释放出淀粉酶2。2.2淀粉酶及其同工酶测定3。2.2.1测定参数温度37C，波长405 nm，延迟时间60 s，测定时间120 s，因数7000。2.2.2淀粉酶总活性测定50 l生理盐水加10 l匀浆上清液加500 l底物液，按上述测定参数测定，如果总淀粉酶活性1 000 U/L，则用生理盐水稀释后再进行测定。2.2.3胰淀粉酶活性(P-Amy)50 l抑制剂加10 l匀浆上清液，37C温育10 min，再加入500 l底物液，按上述参数测定，得剩余Amy活性(R-Amy)。结果计算及校正：总Amy(U/L)=7000A/min。R-Amy(U/L)=7000抑制后A/min(U/L)。由于该抑制剂对S-Amy的抑制率为97.5%，对P-Amy的交叉抑制率为20%，故P-Amy(U/L)=1.29R-Amy0.0323总Amy。S-Amy(U/L)=总AmyP-Amy。3结果与讨论结果见表1与表2。表1各脏器组织淀粉酶及其同工酶活性(s)脏器总Amy(U/g)P-Amy(U/g)S-Amy(U/g)P-Amy/总Amy(%)胰腺(2.10.4)106(2.10.4)1060100腮腺(6.60.6)1060(6.60.6)1060骨骼肌(6.71.9)1020(6.71.9)1020输卵管(2.50.7)1020(2.50.7)1020子宫(1.70.5)1020(1.70.5)1020睾丸(3.70.8)103(3.70.8)1030100空肠(6.31.8)102(5.61.4)102(6.51.8)1089.73.2回肠(3.20.5)102(2.40.5)102(7.70.8)1076.05.6胃(8.31.5)1020(8.31.5)1020胆囊(4.71.2)102(2.10.7)102(2.60.9)10242.58.6肺(2.70.9)1020(2.70.9)1020血清(U/ml)0.0860.0200.0270.0650.0590.01833.06.9表2人组织相对于血清中淀粉酶的活性倍数组织相对倍数组织相对倍数胰腺2.5107腮腺8.2107胃9.6103空肠7.3103胆囊5.5103回肠3.7103睾丸4.3104输卵管3.1103子宫1.7103骨骼肌0.78肺3.1103本文测定的11种脏器中，以腮腺、胰腺单位重量内所含淀粉酶活性最高，均达正常人血清中含量107倍以上。曾有人认为血清中淀粉酶几乎来源于这两种脏器，但实际上胃、胆囊、输卵管、子宫、脾、空肠、回肠的淀粉酶含量虽较胰腺、腮腺内的含量少10 000倍，但仍达正常人血清淀粉酶含量的1 000倍。因此，当这些脏器炎症、损伤时也会引起血清淀粉酶增高，但增高幅度应该与胰腺炎时有较大差别，腮腺、胰腺的炎症引起的血清淀粉酶活性增高要远远超过其它脏器的疾患。骨骼肌所含淀粉酶含量在正常人血清淀粉酶以下，临床未见骨骼肌损伤引起血清淀粉酶增高的报道。不同脏器所含淀粉酶同工酶的类型不一，胰腺和睾丸是仅含有P-Amy的脏器，而空肠、回肠、胆囊均含有P-Amy和S-Amy，只是空肠、回肠以P-Amy为主，含量均占总淀粉酶70%以上，胆囊的S-Amy含量较P-Amy要高，其它如腮腺、肺、胃、输卵管、子宫、骨骼肌都只含有S-Amy。由此可见，当不同组织患病时可反映在血清中总淀粉酶升高，但酶增高的水平会有所差别，同工酶类型可能不同。此外肠梗阻引起淀粉酶升高有可能因肠道阻塞，淀粉酶从肠道排出受阻反流入血，但胰型同工酶水平与胰腺炎时应会有所差别。3.意义血清淀粉酶除来源于胰腺外，还来源于唾液腺及许多其他组织，所以在淀粉酶活性升高时，同工酶的测定有助于疾病的鉴别诊断。P-同工酶升高或降低时，说明可能有胰腺疾患;S-同工酶的变化可能是源于唾液腺或其他组织。当血清淀粉酶活性升高而又诊断不清时，应进一步测定同工酶以助鉴别诊断。有许多方法可以测定同工酶，琼酯糖和醋纤膜电泳法都是比较常用的方法。使用免疫抑制法检测-淀粉酶同工酶胰腺淀粉酶(P-AMY)，以评价其诊断急性胰腺炎的临床价值。方法对急性胰腺炎，急性胆囊炎的血清和尿液-AMY总活性及P-AMY活性和P/比值进行了对比研究。结果血清和尿液P-AMY的参考范围为6-46UL和58-398UL，急性胰腺炎组血清P-AMY P及尿液，P-AMY均较急性胆囊炎组病人有高度显著性差异(P0.05)。急性胆囊炎病人血清P-AMY，P及尿液，P-AMY较正常键康人无显著性差异(P0.05)但两组病人尿液P比值有显著性差异(P005)。在136例病人中，急性胰腺炎病人血清P-AMY的诊断特异性效率最高，分别为926和89。结论谈方法检测P-AMY准确特异快速可作为急性胰腺炎的诊断和鉴别诊断的重要依据4.淀粉酶同工酶的发展前景面包焙烤工业，作为保鲜剂。淀粉的液化作用和糖化作用，-淀粉酶的主要市场是淀粉水解的产物，如葡萄糖和果糖。由于他们的高甜度，被用于饮料工业中软饮料的甜味剂。这个液化过程就用到在高温下热稳定性好的-淀粉酶淀粉酶。纤维脱浆，淀粉脱浆可以利用-淀粉酶，它能有选择性的去除淀粉浆而不伤害纱线纤维，还能随机的使淀粉降解为易溶于水的糊精，因而容易被洗掉。造纸工业，淀粉酶在造纸工业中的用途主要是改良纸张涂层淀粉。自然界的淀粉浓度对于纸张上浆来说太高，可以利用-淀粉酶部分降解淀粉来调节。除垢剂中的应用，酶在除垢剂中最大的功能就是使除垢剂更温和无害。-淀粉酶从1975年就被应用于洗衣粉。-淀粉酶对Ca2+过于敏感，在低Ca的环境下稳定性很差，这限制了-淀粉酶在除垢剂中的应用。并且，大多数野生型菌株所产生的-淀粉酶对作为除垢剂原料之一的氧化剂也过于敏感。除家用除垢剂中，这个局限可以通过增加一些工艺步骤得到改善。最近，两家主要除垢剂酶的生产厂家Novozymes and Gcncncore International已经利用蛋白质工艺改善淀粉酶的漂白稳定性。他们用亮氨酸替代地衣芽孢杆菌-淀粉酶蛋白第197位上的蛋氨酸，导致酶对氧化剂成分的抵抗能力大大增强，提高了其氧化稳定性，使酶在储存过程中的稳定性更好。制药和临床化学分析，随着生物工程的不断发展，淀粉酶的应用涉及到许多其他领域，比如临床，制药和分析化学。-淀粉酶已经成为工业应用中最为重要的酶之一，并且大量的微生物可以用以高效生产淀粉酶，但是酶的大规模商业化生产仍然局限于几种特定的真菌和细菌中。对于高效的-淀粉酶的需