肿瘤的免疫细胞疗法

肿瘤的免疫细胞疗法 摘要 摘要 随着人们寿命的增加 癌症逐渐成为了人类死亡的主要原因之一 针对 癌症的治疗也一直是全球的研究热点 传统治疗肿瘤的手术疗法 放疗 化疗 并不能从根本上消灭肿瘤细胞 往往有很高的复发率 而肿瘤的免疫疗法为治 愈癌症带来了新的希望 本文对免疫疗法发展过程中出现的各种细胞疗法进行 了介绍 关键词 免疫疗法关键词 免疫疗法 LAK TIL CIK DC CIK CAR T 根据世界卫生组织 2014 年世界癌症报告 癌症是全球主要原因死亡原因之 一 2012 年约新增癌症病例 1400 万 癌症相关死亡病例 820 万 面对严峻的 形势 全球投入了大量的人力和资源研究肿瘤产生机制以及预防和治疗的方法 一直以来 肿瘤的临床治疗手段主要是手术 放疗和化疗 虽然有一定的效果 但很难从根本上达到治疗和控制肿瘤转移和复发的目的 近年来 肿瘤的免疫 疗法的发展为解决这一难题带来了希望 免疫疗法的根源可以上溯到 1897 年 化学治疗的建立者 Paul Ehrlich 提出 魔术子弹 概念 magic bullet concept 1 他认为 靶向药物理论上能够有效地 攻击病原体而对健康的组织无害 并且提出免疫系统能够防止肿瘤发生 抗体 是一种能确定目标而不伤害机体的 魔术子弹 然而他并没在肿瘤细胞上找 到特定的免疫原性受体 因此癌症的研究也没有成为他的主要工作 Ehrlich 提 出的靶向治疗理念并不是严格上的免疫疗法 因为很多化学药物对于生物分子 或细胞也有靶向的作用 直到 1875 年 杂交瘤 制备单克隆抗体技术的发明 2才 奠定了免疫疗法的基础 免疫疗法的另一基石是 Burnet 和 Thomas 提出 免疫 监视 immune surveillance 概念 他们认为免疫系统一直在监视着体内的各 种细胞 一旦出现癌变就会启动杀伤功能 而肿瘤的发生是免疫系统失调造成 的 3 然而裸鼠模型的研究发现 免疫系统缺陷的小鼠肿瘤发生率并未显著提高4 这一发现打击了 免疫监视 概念 也使得免疫疗法的发展出现了停滞 但随 着众多肿瘤特异性抗原的发现和 T 细胞受体 T cell receptor TCR 5 共刺激 因子 6 抗原提呈细胞 antigen presenting cell APC 7等免疫作用机制的发现是 免疫治疗的研究再次得到发展 临床上第一次利用单克隆抗体治疗肿瘤是 1980 年 通过对非霍奇金淋巴瘤患者静脉注射单抗 肿瘤细胞的生长暂时被抑制 8 自 1997 年第一个抗肿瘤抗体药物 Rituximab9被批准上市后 目前已有约 250 种 药物上市或临床在研 10 除了直接注射抗体 细胞因子等激活人体自身免疫系统外 还有一类免疫 疗法通过直接向病人输入激活的免疫细胞来治疗癌症 又称为 免疫细胞疗法 或 细胞疗法 免疫细胞疗法到目前为止至少有以下五种类型 淋巴因子激活的杀伤细胞 淋巴因子激活的杀伤细胞 lymphokine activated killer cells LAK cells 疗法 疗法 LAK 细胞首次发现是通过肿瘤患者外周淋巴细胞在含有高剂量的白介素 2 interleukin 2 IL 2 的培养液中短期培养诱导产生 能够杀伤新鲜分离的实 体瘤细胞和体外培养的瘤细胞 11 LAK 是一种 T 细胞和自然杀伤细胞 natural killer cells NK cells 组成的混合物 在体外实验中 这两种细胞都表现出了 对于广谱肿瘤细胞的非主要组织相容性复合体限制性 non major histocompatibility complex restricted non MHC restricted 的细胞毒性 12 将癌 症病人的外周淋巴细胞体外诱导扩增成 LAK 细胞回输后 肿瘤出现消退 13 L AK 细胞杀伤肿瘤细胞的机制一般认为有三种 与靶细胞结合释放后通过分泌 细胞释放毒颗粒 直接杀伤肿瘤细胞 通过 LAK 细胞表面的杀伤分子直接杀伤 肿瘤细胞 通过分泌细胞因子引发免疫反应杀伤肿瘤细胞 14 LAK 杀伤机制十 分复杂 甚至不同克隆的 LAK 细胞的机制也不完全相同 这位它的应用带来了 限制 此外 LAK 细胞在体内虽然有一定的杀伤肿瘤的作用 但也有很大的副 作用 如血管渗漏 严重低血压 1516 目前这一方法已基本被淘汰 肿瘤浸润淋巴细胞 肿瘤浸润淋巴细胞 tumor infiltrating lymphocytes TIL 疗法 疗法 1863 年 Rudolf Virchow 首次在肿瘤组织中发现淋巴细胞 17 Zettergren 第一次从肿瘤组 织中分离出淋巴细胞 18 从多种小鼠肿瘤中分离培养的淋巴细胞被证明有体内 抗肿瘤活性 19 TIL 细胞具有良好的肿瘤特异性 主要作用于 CD3 CD56 CD8 的细胞 只能杀死自体同源的肿瘤细胞而对于不同 MHC 的肿瘤没有效果 对 黑色素瘤病人的临床试验表明 TIL 比 LAK 具有更好的抗肿瘤活性 20 利用自 体同源的 TIL 细胞的治疗能够在黑色素瘤病人体内产生持久完整的应答 这一 效应与前期的治疗无关 21 过去十年间 TIL 疗法的作用机制得到了很好的阐明 尤其是宿主淋巴缺 失的条件 22 输入的 TIL 细胞存活因子 IL 2 的作用23以及回输细胞的最优佳质 量与数量 24 然而这一疗法的应用仍大部分局限于黑色素瘤 此外 困难的体 外扩增和较低的体内抗肿瘤活性也限制了这一疗法的发展和应用 细胞因子诱导的杀伤细胞 细胞因子诱导的杀伤细胞 cytokine induced killer cells CIK cells 疗法 疗法 CIK 细胞是是一类体外诱导产生的异质细胞 兼具 T 细胞的抗肿瘤活性和 NK 细胞非特异性杀瘤特点 通过刺激和恢复免疫系统对肿瘤细胞识别和杀伤 25 与 LAK 细胞类似 CIK 细胞也是通过体外培养外周血淋巴细胞产生 除了添加 IL 2 外 CIK 细胞的诱导还添加了一些其他因子 如 IL 1 IFN Ab anti CD326 相对于 LAK 细胞和 TIL 细胞 CIK 细胞具有更好的抗肿瘤性 更小的 副作用 更好的体外扩增性 更广谱杀瘤性 CIK 细胞抗肿瘤的机制目前认为 有以下几点 1 直接杀伤作用 CIK 对靶细胞的杀伤可能有两种途径 一是 CIK 在淋 巴细胞功能相关抗原 1 lymphocyte function associated antigen 1 LFA 1 的识 别结构的激活下引发细胞质毒颗粒依赖的溶细胞作用 另一种是 CIK 表面的 CD3 样受体被结合后引发细胞质毒颗粒依赖的溶细胞作用 27 2 分泌细胞因子 CIK 细胞能分泌 IFN TNF IL 2 等多种细胞因子 这些细胞因子可通过调节免疫系统或直接抑制肿瘤细胞 针对慢性淋巴白血病 的治疗发现 CIK 细胞分泌的 IFN 能促进肿瘤细胞 ICAM 1 的表达 从而增 强 CIK 的识别和杀伤能力 28 3 诱导肿瘤细胞凋亡 有研究表明 在 CIK 培养过程中表达的 Fas 配体 能抵抗 FasL 肿瘤细胞的诱导凋亡 同时能够诱导肿瘤细胞的凋亡 29 针对胃 癌的研究中也发现 CIK 能够下调 P53 C myc 和 Bcl 2 的表达 上调 Bax 的表 达 从而早期诱导肿瘤细胞凋亡 晚期诱导肿瘤细胞坏死 30 CIK 细胞疗法存在的问题是对于不同类型的肿瘤很难有相同的疗效 目前也没 有一种可靠的方法来预测其有效性 此外 这种疗法仍然存在移植物抗宿主的 问题 较为复杂和昂贵的制备条件使其还是一种辅助的疗法 树突状细胞树突状细胞 细胞因子诱导的杀伤细胞 细胞因子诱导的杀伤细胞 dendritic cells and cytokine induced killer cells DC CIK 联合疗法 联合疗法 DC CIK 疗法是 CIK 疗法的一种优化 将 DC 于 CIK 细胞共同培养产生 DC 细胞是目前已知的功能最强大的专职抗原提呈 细胞 可以表达的 MHC I MHC II 以及 CD1 分子提呈肿瘤抗原 有效对抗肿 瘤细胞的免疫逃逸 同时能够分泌 IL 2 激活 T 细胞的免疫应答 31 DC 同时也 是一种具有抗肿瘤能力的细胞 其作用机制为 诱导产生大量效应 T 细胞后引 导效应 T 细胞迁移到肿瘤部位 并维持效应 T 细胞在肿瘤部位的长期存在 DC 同时能够分泌 IL 12 TNF 等细胞因子促进肿瘤杀伤 此外 DC 还能够抑 制肿瘤血管的生成 进而抑制肿瘤的生长 32 虽然 DC 和 CIK 细胞都具有抗肿瘤作用 但临床试验发现效果并不理想 DC 能够识别抗原 引发获得性免疫应答并激活效应 T 细胞杀伤肿瘤细胞而 CIK 能够发挥自身细胞毒性同时分泌细胞因子杀伤肿瘤细胞 于是有人设想将 两种细胞联合起来协同治疗恶性肿瘤 实验研究显示 DC CIK 共培养的抗肿 瘤性显著高于单独的 CIK 细胞 33 CD CIK 联合疗法具有以下特点 CIK 细胞 在 DC 的刺激下抗肿瘤活性显著提高 CIK 细胞的增殖能力显著提高 CIK 细 胞能够促进 DC 细胞的成熟 DC 与 CIK 共培养可减少 CIK 细胞群中免疫抑制 T 细胞的数量 降低肿瘤的免疫抑制作用 34 目前针对肺癌 白血病 肾癌 胰腺癌等多种恶性肿瘤的临床研究显示 DC CIK 都是患者病情得到不同程度 的缓解 35 虽然 DC 与 CIK 细胞共培养提高了细胞的增殖速度和抗肿瘤活性 但目前缺乏可靠的大规模的临床病例来证明其疗效 相关研究还在进行 值得 一提的是 CIK 疗法和 DC CIK 疗法相关的临床研究研究和实验大多在中国进 行 36 嵌合抗原受体嵌合抗原受体 T 细胞细胞 chimeric antigen receptor T cell CAR T 免疫疗法 免疫疗法 CAR T 疗法近几年突飞猛进 逐渐进入大众的眼中 甚至有报道说 从此治愈 癌症不是梦 很多人认为这是一项新的治疗技术 实际上 早在 1989 年 Gross 等人在研究中用抗体的一条重链 VH 和一条轻链 VL 替换了 T 细胞 受体 T cell receptor TCR 的 链和 链 形成了抗体 TCR 嵌合分子 他们讲 这个分子的编码基因转入到 T 细胞中后发现其获得了抗体的特异识别能力 这 种编码基因被称为嵌合 T 细胞受体 chimeric T cell receptor TcR 37 这一结构 也是 CAR T 中嵌合抗原受体 chimeric antigen receptor CAR 结构的雏形 在这一结构的基础上 CAR 结构不断被优化 目前 经典的 CAR 结构包含五 个部分 单链可变区 single chain variable fragment scFv 铰链区 跨膜区 共刺激区和 T 细胞活化区 其中 scFv 能够识别指定的抗原 目前 CAR T 已经发展出了四代 第一代 CAR T 就是 Gross 等人在 TcR 基础上改造的将 scFv 与免疫细胞 FcR 链或 CD3 链融合形成 38 这种 T 细胞 虽然能够接到肿瘤杀伤 但无法转导增殖信号 诱导产生细胞因子 在体内作 用时间不长 随后发展出的第二代 CAR T 技术引入了一个共刺激因子 39 这些 共刺激因子能够发挥不同的作用 如诱导增殖 产生细胞因子等 延长了 CAR T 细胞的体内作用时间 目前进行临床研究的多位第二代 第三代 CAR T 技术在第二代的基础上将共刺激区增加为两个 40 进一步延长了 CAR T 的作用 时间和抗肿瘤活性 第四代 CAR T 在原有基础上 增加了表达能够招募免疫系 统其他成分的细胞因子 如 IL 1241 从而放大抗肿瘤免疫效应 CAR T 疗法的主要特点是通过基因工程的方法使 T 细胞表达识别肿瘤特异 性抗原的受体 从而使 T 细胞对肿瘤有高亲和性 同时在对肿瘤特异性识别后 引发细胞内的通路释放细胞因子杀伤肿瘤 此外 CAR T 细胞在输入体内后能 够主动迁移到肿瘤部位 能自我增殖 能释放细胞因子 能发生溶瘤作用以及 能作为记忆细胞长期存在的特性使其能够成为一种成功地继承性细胞免疫疗法 CAR T 治疗具体包括以下几个步骤 1 从病人外周血中获得充足的 T 细胞 2 利用安全而有效的遗传学材料将 CAR 基因转入 T 细胞 3 转入 CAR 基因 的 T 细胞体外扩增到足够的数量 4 回输 CAR T 细胞 5 严密监视不良反 应 前三代的 CAR T 疗法需要对患者进行清髓治疗 一般为大剂量化疗 以清 除免疫抑制细胞 这一过程往往给患者带来很大的伤害 第四代 CAR T 技术通 过分泌 IL 12 解决了这一问题 42 避免了清髓治疗的毒副作用 虽然 CAR T 疗法在抗肿瘤性上很强大 但同时也带来了同样大的风险和副 作用 由于 CAR T 本身的强大杀伤能力 最大的风险因素就是脱靶效应 由于 绝大多数的 CAR 定向抗原并非肿瘤特有的 一般选择抗原在肿瘤细胞中高表达 但在正常组织细胞中也有不同程度的表达 CAR T 很可能会损伤这些正常组织 针对这一问题 可能的解决方法是找到只在肿瘤中表达的抗原或者通过使用两 种不同的 CAR 只有同时结合抗原才能引起免疫应答来避免只表达部分抗原的 正常组织受损 43 此外 这一疗法产生的 细胞因子风暴 是需要严密监视的 副作用 由于 CAR 结构中引入了共刺激因子 治疗过程中多种细胞因子会释放 到循环系统中 引起恶心 头痛 高烧 低血压等体征 严重的可导致死亡 44 由于这一过程目前不可避免 只能采取控制输入 CAR T 细胞数量 输入后严密 监控病人状态来减小这一效应带来的危险 目前 CAR T 的治疗主要是以血液瘤为主 对于实体瘤的研究虽然有很多 但进展并不顺利 其主要原因是实体瘤不是游离的 CAR T 必需侵入实体瘤内 部发挥作用 而肿瘤所处的微环境具有强烈的免疫抑制作用 不利于 CAR T 的 生存和维持 CAR T 的进一步发展需要找到更具有特异性的抗原 加强 CAR T 向肿瘤部位的迁移能力 同时要优化其安全性 此外 还可以将 CAR 结构运用 于其他的免疫细胞 通过多种免疫细胞的联合作用加强抗肿瘤性 肿瘤治疗最大的两个问题是药物的靶向性和肿瘤的免疫抑制性 免疫细胞 疗法的发展逐渐解决了靶向问题 只需找到合适的抗原 而肿瘤的免疫抑制 性需要通过有效的药物对肿瘤细胞相关的通路进行阻断 将两者结合起来 治 愈癌症的梦想一定能够实现 1 Strebhardt K Ullrich A Paul Ehrlich s magic bullet concept 100 years of progress Nat Rev Cancer 2008 8 6 473 480 2 K hler G Milstein C Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity Nature 1975 256 5517 495 497 3 Burnet M Cancer A biological approach I The processes of control Br Med J 1957 1 779 786 4 Stutman O Tumor development after 3 methylcholanthrene in immunologically deficient athymic nude mice Science 1974 183 534 536 5 McIntyre B W Allison J P The mouse T cell receptor structural heterogeneity of molecules of normal T cells defined by xenoantiserum Cell 1983 34 739 746 6 June CH Ledbetter JA Gillespie MM Lindsten T Thompson CB T cell proliferation involving the CD28 pathway is associated with cyclosporine resistant interleukin 2 gene expression Mol Cell Biol 1987 7 4472 4481 7 Jenkins M K Schwartz R H Antigen presentation by chemically modified splenocytes induces antigen specific T cell unresponsiveness in vitro and in vivo J Exp Med 1987 165 302 319 8 Nadler LM Stashenko P Hardy R et al Serotherapy of a patient with a monoclonal antibody directed against a human lymphoma associated antigen Cancer Res 1980 40 9 3147 3154 9 Maloney GD Grillo L pez AJ White CA et al IDEC C2B8 Rituximab anti CD20 monoclonal antibody therapy in patients with relapsed low grade non Hodgkin s lymphoma Blood 1997 90 6 2188 2195 10 陈雪静 抗肿瘤抗体药物的研究进展 中国生物制品学杂志 2015 28 1 84 90 11 Grimm EA Mazumder A Rosenberg S A The human Il 2 induced killer cell phenomenon lysis of Nk resistant fresh solid tumor cells by Il 2 activated Pbl Fed Proc 1982 41 957 12 Phillips JH Lanier LL Dissection of the lymphokine activated killer phenomenon Relative contribution of peripheral blood natural killer cells and T lymphocytes to cytolysis J Exp Med 1986 164 814 825 13 Rosenberg SA Lotze MT Muul LM et al Observations on the systemic administration of autologous lymphokine activated killer cells and recombinant interleukin 2 to patients with metastatic cancer N Engl J Med 1985 313 1485 1492 14 陈国友 LAK 细胞识别 结合及杀伤肿瘤细胞分子机制的研究进展 国外医学免疫学 分册 1994 3 123 127 15 Atkins MB Gould JA Allegretta M et al Phase I evaluation of recombinant interleukin 2 in patients with advanced malignant disease J Clin Oncol 1986 4 1380 1391 16 Thatcher N Dazzi H Johnson RJ et al Recombinant interleukin 2 rIL 2 given intrasplenically and intravenously for advanced malignant melanoma A phase I and II study Br J Cancer 1989 60 770 774 17 Virchow R 1863 Cellular Pathology Philadelphia 18 Zettergren JG Luberoff DE Pretlow 2nd TG Separation of lymphocytes from disaggregated mouse malignant neoplasms by sedimentation in gradients of ficoll in tissue culture medium J Immunol 1973 111 836 840 19 Rosenberg SA Spiess P Lafreniere R A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumorinfiltrating lymphocytes Science 1986 233 1318 1321 20 Rosenberg SA Yannelli JR Yang JC Topalian SL Schwartzentruber DJ Weber JS et al Treatment of patients with metastatic melanoma with autologous tumor infiltrating lymphocytes and interleukin 2 J Natl Cancer Inst 1994 86 1159 21 Rosenberg SA Yang JC Sherry RM Kammula US Hughes MS Phan GQ et al Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy Clin Cancer Res 2011 17 4550 22 Gattinoni L Finkelstein SE Klebanoff CA et al Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor specific CD8 T cells J Exp Med 2005 202 907 912 23 Yao X Ahmadzadeh M Lu YC et al Levels of peripheral CD4 FoxP3 regulatory T cells are negatively associated with clinical response to adoptive immunotherapy of human cancer Blood 2012 119 5688 5696 24 Chacon JA Sarnaik AA Chen JQ et al 2015 Manipulating the tumor microenvironment ex vivo for enhanced expansion of tumor infiltrating lymphocytes for adoptive cell therapy Clin Cancer Res 2005 21 611 621 25 Ma Y Xu YC Tang L Zhang Z Wang J Wang HX Cytokine induced killer CIK cell therapy for patients with hepatocellular carcinoma efficacy and safety Exp Hematol Oncol 2012 1 11 26 Schmidt Wolf IG Negrin RS Kiem HP et al Use of a SCID mouse human lymphoma model to evaluate cytokine induced killer cells with potent antitumor cell activity J J Exp Med 1991 174 1 139 149 27 Mehta BA Schmidt Wolf IG Weisman IL et al Two pathways of exocytosis of cytoplasmic granule contents and target cell killing by cytokine induced CD3 CD56 killer cells Blood 1995 86 9 3493 3499 28 Kornacker M Moldenhauer G Herbst M et al Cytokine induced killer cells against autologous CLL direct cytotoxic effects and induction of immune accesory molecules by interferon gamma Int J Cancer 2006 119 6 1377 1382 29 Verneris MR Kornacker M Mail nder V et al Resistance of ex vivo expanded CD3 CD56 T cells to Fas mediated apoptosis Cancer Immunol Immunother 2000 49 6 335 45 30 Sun S Li XM Li XD Yang WS Studies on inducing apoptosis effects and mechanism of CIK cells for MGC 803 gastric cancer cell lines Cancer Biother Radiopharm 2005 20 2 173 80 31 Bancher J Steinman RM Dendritic cell and the control of immunity Nature 1998 392 66 245 252 32 Gabrilovich D Mechanisms and functional significance of tumor induced dendritic cell defects Nat Rev Immunol 2004 4 941 95 33 Ge W Li CH Zhang W et al Coculture of dendritic cell with cytokine induced killer results in a significant increase in cytotoxic activity of CIK to tumor cells in vitro and in vivo Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi 2004 25 5 277 280 34 孟凡东 隋成光 王晓华 等 体外培养的树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞相 互作用的研究 中国老年学杂志 2006 26 818 820 35 何立香 DC CIK 治疗恶性肿瘤的研究进展 医学综述 2013 19 1 59 62 36 Xiao Dong Li Bin Xu Jun Wu Review of Chinese clinical trials on CIK treatment for malignancies Clin Transl Oncol 2012 14 102 108 37 Gross G Waks T Eshhar Z Expression of immunoglobulin T cell receptor chimeric molecules as functional receptors with antibody t