一起食源性感染暴发的病原学分析及其分子分型.doc

一起食源性感染暴发的病原学分析及其分子分型 短篇论著一起食源性感染暴发的病原学分析及其分子分型朱艳贾宇驰郭文学祁伟天津医科大学第二医院感染科天津市感染性疾病研究所通信作者祁伟，电话-【摘要】目的分析腹泻病患者粪便培养出的猪霍乱沙门菌病原学特征及其分子分型，确定一起食源性感染发生的性质，并了解该致病菌的致病特点和耐药性。 方法收集年月日至日天津医科大学第二医院肠道门诊聚集就诊的例腹泻患者粪便标本，进行细菌培养及鉴定、抗菌药物敏感试验、脉冲场凝胶电泳（，）基因分型，以及毒力基因检测。 结果株菌株经鉴定均为猪霍乱沙门菌，具有相同的抗菌药物敏感谱并携带相同的毒力基因。 分析显示株猪霍乱沙门菌高度同源，具有明确的流行病学相关性。 结论确认此次猪霍乱沙门菌引起的食源性感染为一次暴发事件。 -沙门菌是引起我国食源性疾病的重要病原菌之一。 夏季是沙门菌感染的高发季节，在我国，沙门菌食物中毒多年来居细菌性食物中毒的首位。 在公共卫生应急事件中，食物中毒占有相当大的比重，针对食源性感染的实验室检测及其处置方案尤为重要。 本研究对聚集出现的例腹泻患者粪便标本进行细菌培养及鉴定、抗菌药物敏感试验、脉冲场凝胶电泳（，）基因分型，以及毒力基因检测，了解此次食源性感染发生的性质，为进一步判断和追踪传染源提供理论依据。 对象与方法 一、研究对象收集年月日至日天津医科大学第二医院肠道门诊聚集就诊的例腹泻患者粪便标本。 收集患者的临床信息，包括年龄、性别、临床表现、粪便常规和培养结果、临床诊断、就餐时间和地点、共同就餐者的发病情况、疑似食物等资料。 本研究通过医院伦理委员会审核批准。 二、研究方法细菌培养及鉴定将患者粪便标本接种在木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂糖培养基中，孵育，挑取无色透明、菌落中心为黑色的菌落，使用-全自动微生物鉴定药物敏感测试系统（美国公司）进行细菌鉴定，并经过沙门菌属多价血清及分型血清（泰国公司）进行细菌分型。 抗菌药物敏感试验采用纸片扩散法对菌株进行药物敏感试验。 药物敏感试验结果根据美国实验室标准化研究院（，）版标准判定。 基因分型按美国-公司标准操作。 制备胶块挑取培养皿上新鲜菌落悬浊于细胞悬浮液中混匀，使浊度调整到约个麦氏单位。 将的细菌悬浊液、的蛋白酶和的十二烷基硫酸钠琼脂糖凝胶混匀，将混合液加入模具孔中凝固制成胶块。 细菌细胞裂解每细胞裂解液加入的蛋白酶，使其终浓度为，水浴摇床，转速为，震荡幅度为，孵育以上。 洗胶块灭菌蒸馏水洗次，缓冲液洗次。 酶切切下约宽度的胶块浸入酶体系中，含酶Xba，酶切。 加样梳子放入槽中后倒入，室温凝固成型，将胶块塞入胶孔。 电泳仪（美国-公司）设置参数、脉冲时间、电泳时间。 图像获取电泳结束后用溴乙锭染液胶块染色，蒸馏水脱色次，每次。 采用凝胶成像分析仪软件拍摄成像。 电泳图谱应用软件进行指纹分析，计算出各菌株带型之间的相似度。 菌株间流行病学相关性的判定标准依据等的方法。 细菌毒力基因检测制备菌株的样本，对其中种毒力基因invA、sitC、hilA、sifA、mgtC、siiE、spvB、ProtE、pefA进行检测，阴性质控菌为大肠埃希菌，阳性质控菌为天津市感染性疾病研究所保留的分离自临床患者的肠炎血清型沙门菌。 引物序列见表。 反应参数设置为预变性、，变性、，退火温度见表、，延伸、，终末延伸、，循环次。 结果 一、临床资料例患者中例患者为单位聚餐，就餐某连锁烧烤店，一同就餐的人在餐后数小时至次日先后出现不同程度腹痛、呕吐、腹泻、发热等症状；另例患者就餐于同一连锁烧烤店，进食后次日发病。 对患者进食菜单就餐经过比较和分析，疑为进食被污染的生肉。 见表。 中华传染病杂志年月第卷第期，表1种猪霍乱沙门菌毒力基因引物序列毒力基因引物核苷酸序列（）扩增片段长度（）退火温度（）毒力位点invA正向引物g沙门菌毒力岛-反向引物sitC正向引物g沙门菌毒力岛-反向引物hilA正向引物g沙门菌毒力岛-反向引物sifA正向引物g沙门菌毒力岛-反向引物mgtC正向引物g沙门菌毒力岛-反向引物siiE正向引物g沙门菌毒力岛-反向引物spvB正向引物g毒力质粒反向引物ProtE正向引物g毒力质粒反向引物pefA正向引物g毒力质粒反向引物注为毒力基因聚合酶链反应退火温度表2例腹泻患者临床资料编号就诊日期年龄性别临床表现粪便常规结果粪便培养结果临床诊断就餐时间就餐地点月日女腹泻（次）稀便、猪霍乱沙门菌细菌性痢疾月日某连锁烧烤店月日男腹泻（次）脓血便、猪霍乱沙门菌细菌性痢疾月日某连锁烧烤店月日男腹泻（次）、脐周痛水样便、猪霍乱沙门菌急性胃肠炎月日某连锁烧烤店月日男腹泻（次）、发热槝、恶心水样便、猪霍乱沙门菌急性胃肠炎月日某连锁烧烤店月日女腹泻（次）、下腹痛稀便、猪霍乱沙门菌急性胃肠炎月日某连锁烧烤店月日女腹泻（次）、发热槝、腹痛稀便、猪霍乱沙门菌急性胃肠炎月日某连锁烧烤店注为白细胞计数；为高倍视野 二、细菌培养鉴定结果菌株经培养、生物化学试验和血清型鉴定均为猪霍乱沙门菌。 三、抗菌药物敏感试验结果分离的株猪霍乱沙门菌具有相同的药物敏感谱，对所测试的种抗菌药物中的头孢曲松、庆大霉素、阿卡米星、四环素、环丙沙星、诺氟沙星、氯霉素均敏感，对氨苄青霉素不敏感。 四、基因分型结果株猪霍乱沙门菌经Xba酶酶切后在脉冲场中电泳成像显示，菌株带型一致，为同一克隆株（图）。 经指纹图谱软件分析显示，菌株菌谱型彼此间相似性达，证实为同源性菌株（图）。 五、细菌毒力基因检测结果株猪霍乱沙门菌分别扩增种代表性基因invA、sitC、hilA、sifA、mgtC、siiE及毒力质粒基因pefA、protE、spvB，其扩增结果显示，种代表性基因检出率为，毒力质粒编码基因spvB、pefA、protE未检出。 注、分别为菌株号图1株猪霍乱沙门菌的脉冲场凝胶电泳成像中华传染病杂志年月第卷第期，图2株猪霍乱沙门菌的指纹图谱讨论在各类细菌所致的食源性疾病中，沙门菌引起的感染位列第一。 猪霍乱沙门菌为非伤寒沙门菌感染的重要病原菌，侵袭力强，极易引起菌血症，在导致人类沙门菌感染常见的血清型中层第位。 在美国，猪霍乱沙门菌影响着约至万人，每年造成至人死亡。 年至年中国台湾大学医院的种非伤寒沙门菌分离株中，猪霍乱沙门菌占。 年至年深圳市例腹泻患者中猪霍乱沙门菌感染占，并呈多地持续流行和扩散趋势-。 因此控制猪霍乱沙门菌所致食源性感染的暴发已成为一个重要的公共卫生问题。 中国在年将食源性疾病暴发定义为一次因进食同一食物而导致人以上发生相同疾病的事故，将非伤寒沙门菌引起的暴发描述为潜伏期至，通常至，临床症状有腹泻，常伴发热和腹绞痛，并有例以上患者粪便和（或）可疑食物中检出相应血清型的病原菌。 分型是目前一种灵敏且稳定的基因分型方法，被称为细菌分子分型的金标准。 通过菌株之间的同源性分析，探讨菌株间的流行病学相关性，判断和追踪传染源。 本研究中，菌株的同源性分析显示株菌株的图谱达到的高度相似性，提示为同源性菌株。 追溯此次事件发生的原因为患者均同一连锁餐厅，并且均食用了疑似被沙门菌污染的动物肉类，结合患者的就餐经过和临床症状，可以认为本次猪霍乱沙门菌感染为一次食源性感染暴发，但因未对疑似食物进行采样，因此无法准确对病原微生物进行溯源追寻。 随着抗菌药物的广泛使用，细菌耐药性的问题已成为临床医师关注的热点，特别是近年来非伤寒沙门菌对氟喹诺酮类抗菌药物的耐药性不断增加。 本研究对菌株进行了种临床常用抗菌药物的药物敏感试验，结果显示株猪霍乱沙门菌具有相同的药物敏感特征，对所测试的种抗菌药物除氨苄青霉素外均敏感，与其他报告相似。 因沙门菌在肠道定居、侵入上皮组织，以及刺激肠液外渗等都与其所携带的毒力质粒和毒力岛密切相关。 毒力基因携带情况的不同有助于判断菌株致病性的强弱。 本研究的株菌株所携带的毒力基因相同，患者发病过程和临床表现也相似。 综上所述，通过对株猪霍乱沙门菌的分析，结合临床和流行病学资料，可判定此次食源性感染为一次暴发事件，株菌株具有相同的抗菌药物敏感谱并携带相同的毒力基因。 利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突作者贡献声明朱艳基础实验、文献、临床数据分析；贾宇驰操作技术支持；郭文学菌株及临床资料收集；祁伟统筹设计与理论支持参考文献沈美萍，吴晓燕，王良平-年浙江省平湖市沙门菌临床感染血清型及耐药性分析疾病监测，（）-朱超，许学斌沙门菌属血清型诊断上海同济大学出版社，-，-，（）-张成龙非伤寒沙门氏菌临床株毒力基因初步分析天津天津医科大学，-Salmonella，（）-，Salmonella，（）-，Salmonella enterica（），（）-陈飞，成大荣，王丽芳，等禽沙门氏菌毒力岛标志基因研究与基因序列分析江苏农业科学，（）-，?，Salmonella-，（）-，salmonella-，（）-，（）-，-Salmonella enterica，（）-陈琴，张瑞中，郭少燕腹泻病人沙门菌的血清分布类型和耐药性状况解析护理研究，（）-中华传染病杂志年月第卷第期，-罗铭，顾桂敏，景春梅，等猪霍乱沙门菌在全球的流行和耐药特征疾病监测，（）-何永频，丁晓沧，徐大麟美国年推荐的食源性疾病暴发判别指南国外医学卫生学分册，（）-，-spa-，Staphylocous aureus，（）-郭仲辉，陈冬雅，黎毓光，等沙门菌的检测及耐药性分析实验与检验医学，（）-（-）（本文金昱）磷霉素联合不同抗菌药物对多重耐药鲍曼不动杆菌的体外药物敏感试验研究贾宇驰吴晓妹张利娟祁伟天津医科大学第二医院感染科天津市感染性疾病研究所通信作者祁伟，电话-【摘要】目的评价磷霉素分别与亚胺培南、米诺环素、阿米卡星、头孢哌酮舒巴坦、替加环素、多黏菌素联合用药，对于临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌的体外联合抗菌效应。 方法分离多重耐药鲍曼不动杆菌临床株株，采用微量肉汤稀释棋盘法测定不同浓度组合的抗菌药物单用及联合应用对株耐药鲍曼不动杆菌的最低抑菌浓度（，），并计算分数抑菌浓度指数（，）判定联合效应。 结果磷霉素分别与亚胺培南、米诺环素、阿米卡星、头孢哌酮舒巴坦、替加环素、多黏菌素联合应用后，的菌株分别占（）、（）、（）、（）、（）和（）；，且分别占（）、（）、（）、（）、（）和（）；，且分别占、（）、（）、（）和（）；的菌株比例均为。 亚胺培南、米诺环素、阿米卡星和头孢哌酮舒巴坦分别与磷霉素联合后，最低抑菌浓度（）分别下降为单用时的、；最低抑菌浓度（）分别下降为单用时的、。 替加环素与多黏菌素联用磷霉素后值均未见明显改变。 结论磷霉素可以不同程度降低所联合应用抗菌药物的，以亚胺培南和米诺环素最为明显，阿米卡星、头孢哌酮舒巴坦次之。 替加环素与多黏菌素因本身敏感性较高，协同和叠加作用不明显。 以上联合实验均未出现拮抗反应。 -近年来，耐药鲍曼不动杆菌的流行趋势愈演愈烈，已成为全球抗感染领域的挑战，亦是我国院内感染的主要致病菌之一。 由于鲍曼不动杆菌在自然环境、医院环境的广泛存在，以及在住院患者中多部位定植，使得临床医师在不动杆菌感染的诊治和防控等方面面临诸多困难。 鲍曼不动杆菌耐药机制复杂，几乎包括了所有已知的常见耐药机制，且具有快速获得和传播耐药性的能力。 磷霉素是目前临床使用较少的一种抗菌药物，其作用机制独特，自成一类。 因与其他种类抗菌药物作用机制和作用靶点不同，理论上不会产生交叉耐药，从而可减少耐药菌的选择性扩增。 磷霉素主要通过破坏细菌外层结构利于药物进入细菌体内富集，可与多种抗菌药物表现出良好的协同作用。 本研究采取体外药物敏感方法，针对多重耐药鲍曼不动杆菌（Aciobacter baumannii，）进行以磷霉素为主的联合药物敏感试验，以期找到合适的联合药物，为临床提供更好的针对