11-金黄色葡萄球菌PFGE方案

金黄色葡萄球菌脉冲场凝胶电泳标准操作程序金黄色葡萄球菌脉冲场凝胶电泳标准操作程序 第一天第一天 1 菌悬液的制备 1 在 Falcon 2054 管上标记样品名称和空白对照 分别加入约 1 2mlCSB 缓 冲液 2 在 1 5ml eppendorf 管上标记好对应样品的名称 3 用棉棒从培养皿上刮取适量细菌 悬浊于 CSB 中 用 eppendorf 分光光度 计测其 OD 值 调整至 5 5 6 5 之间 注 如果样品数量多 调完 OD 后先存放 于 4 4 取 250 l 菌悬液于相应的 1 5ml eppendorf 管中 5 加入 2 l 溶葡萄球菌酶 1mg ml 用移液枪充分吹打 不需振荡摇匀 2 胶块的制备 1 准备 10ml 的 1 SKG 称取 0 1g SKG 溶于 TE 用微波炉加热至完全溶解 放在 53 56 水浴中 2 取 250 l 预热 53 56 的 SKG 与 250 l 菌悬液混合 用移液枪轻 轻吹打 5 次左右至液体混匀 避免产生气泡 混合前菌悬液可在水浴里预热 10 秒 并摇匀 3 将混合物立即加入模具 避免产生气泡 在室温下凝固 10 15 分钟或置 于 4 冰箱 5 分钟 3 细胞的裂解 1 在 50ml 的 screw cap tube 上做好标记 编号PN SOP 11 执行日期 2010 年12 月15 日 2 配制细胞裂解液 CLB 参见表 1 蛋白酶 K 原液须放在冰上或冰盒里 表 1 样本数量 CLB 蛋白酶 K 20mg ml 14ml30 l 1040 ml300 l 3 每个管子加入 4ml 蛋白酶 K CLB 混合液 保证胶块在液面下而不在管壁 上 4 将管子放在 54 水浴摇床中孵育 2 小时 转速约 170 转 分钟 5 将纯水和 TE 放在 54 水浴中预热 4 洗胶块 1 从水浴摇床中拿出 screw cap 管 盖上绿色的 screened cap 轻轻倒掉 CLB 2 每管中加入 15ml 预热的纯水 确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上 放回 54 水浴摇床中 摇 15 分钟 3 倒掉水 加入 15ml 预热的 TE 在 54 的水浴摇床中重复洗 3 次 时间 分别为 15 分钟 15 分钟 30 分钟 4 倒掉 TE 加入 5ml TE 放在 4 冰箱保存备用 第二天第二天 5 胶块内 DNA 的酶切 1 准备 30 和 37 水浴 在 1 5ml eppendorf 管上标记好相应样品的名称 2 按照表 2 配制 SmaI 的稀释缓冲液 混匀 注意 须带手套操作 缓冲 液和 BSA 置于冰上 表 2 3 按照表 3 配置 XbaI 的稀释缓冲液 注意 须带手套操作 缓冲液和 BSA 置于冰上 表 3 4 在每 个 1 5ml eppendorf 管中加入 200 l 稀释缓冲液 5 用刀片切下 2mm 宽的胶块放入 1 5ml eppendorf 管中 确保胶块在液面下 面 将剩余的胶块放回原来的 TE 中 试剂 Takara l 胶块 l 7 胶块 l 12 胶块 纯水 160 l1120 l1920 l 10 T Buffer20 l140 l240 l BSA 0 1 20140240 总体积 200 l1400 l2400 l 试剂 Promega l 胶块 l 3 胶块 纯水 178 l534 l Buffer D20 l60 l BSA 10mg ml 26 总体积 200 l600 l 6 用同样的方法处理标准株 H9812 的胶块 放入 XbaI 缓冲液中 7 将 XbaI 管子放在 37 水浴中 SmaI 管子放在 30 水浴中孵育 10 15 分 钟 8 在用稀释缓冲液孵育的过程中 按照以下的比例配制酶切缓冲液 混匀 表 4 表 5 9 孵 试剂 Takara l 胶块 l 7 胶块 l 12 胶块 纯水 155 l1085 l1860 l 10 T Buffer20 l140 l240 l BSA 0 1 20140240 SmaI53560 总体积 200 l1400 l2400 l 试剂 Promega l 胶块 l 3 胶块 纯水 173 l519 l Buffer D20 l60 l BSA 10mg ml 26 XbaI515 总体积 200 l600 l 育完 用移液枪吸出液体 吸液时枪头应贴到管底 注意避免破坏胶块 10 每管加入 200 l 内切酶混合液 确保胶块在液面的下面 11 将 XbaI 管子放在 37 SmaI 管子放在 30 水浴中孵育 3 4 小时 6 制备 1 胶 1 称取 1g SKG 溶于 100ml 0 5 TBE 缓冲液中 15 孔模具需配制 150ml 体 积的胶 2 微波炉加热约 2 分钟 每 20 妙混匀 直至完全溶解 3 放在 53 56 水浴 5 6 分钟 7 加样 1 调整梳子的高度 使梳子齿与胶槽的底面相接触 用水平仪调整胶槽使其 水平 2 从 37 水浴中取出胶块 平衡到室温 用枪头吸出酶切混合液 枪头应 贴至管底 避免损伤或吸出胶块 3 每管加入 200 l 0 5 TBE 用枪头冲洗胶块 4 把梳子平放在胶槽上 把胶块加在梳子齿上 如果用的是 10 个齿的梳子 把标准菌株 H9812 加在第 1 5 10 个齿上 若为 15 个齿的梳子则放在第 1 5 10 15 个齿上 5 把梳子放入胶槽 确保所有的胶块在一条线上 并且胶块与胶槽的底面相 接触 从胶槽的下部中央缓慢到入 100ml 熔化的在 53 56 平衡的 1 SKG 避免气泡的生成 如果有 用枪头消除 在室温下凝固 30 分钟左右 8 电泳 设置电泳参数 大 小胶均用此参数 Initial switch time 4 0 seconds Final switch time 40 0 seconds 14cm 宽 13cm 长的胶电泳时间为 19 小时 启动 Start Run 第三天第三天 9 图像的获取 1 取出胶 放在盛放 400ml EB 溶液的托盘内 EB 储存液浓度为 10mg ml 1 10 000 稀释 即在 400ml 水中加入 40 l 储存液 摇 30 分钟 注意 EB 是致畸剂 储存在棕色瓶中的 EB 稀释液可以用 5 次 废弃的 EB 溶液 应妥善处理 2 用纯水冲洗胶即可读取图象 3 电泳图像通常用 BIO RAD 的 GEL DOC 2000 或其它成像系统来获取 图像 需为 IBM 兼容的未压缩的 TIFF 格式