甾体激素类药物的分析

第十五章,甾体激素类药物的分析,基本结构：环戊烷骈多氢菲,A,B,C,D,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,第一节 基本结构与分类：,甾体激素,肾上腺皮质激素,性激素,雄性激素及蛋白同化激素,孕激素,雌激素,一 肾上腺皮质激素,天然的皮质激素-氢化可的松,醋酸地塞米松,醋酸地塞米松为地塞米松C21位上的羟基所形成的醋酸酯，肌注延长时间,曲安西龙,地塞米松磷酸钠是地塞米松C21位羟基与磷酸成酯后，又成盐，增大脂溶性。,一、结构与性质,1. 肾上腺皮质激素,21个碳，A环又共扼，17位位有-醇铜， 9-有F，16 有羟基。,二 雄性激素与蛋白同化激素,丙酸睾酮,酯化吸收减慢，作用时间长。,17位加甲基作用更强,蛋白同化激素,苯丙酸诺龙-,2. 雄性激素及蛋白同化激素,雄性激素母核有19个碳原子，蛋白同化激素在碳10位上一般无角甲基， 18个碳原子。,三 孕激素,黄体酮,醋酸甲地孕酮,三. 孕激素,四 雌激素,炔雌醇,炔雌醇,雌二醇,炔雌酮,炔诺孕酮,四. 雌激素,第二节 鉴别试验一 化学鉴别法,（一）与强酸的呈色反应 母核的反应，机制不明。,甾体激素类药物,呈色,H2SO4 H3PO4 HClO4 HCl,与硫酸显色反应,显 色 荧光 加水稀释,泼尼松龙 深红 絮状灰,泼尼松 橙 黄蓝绿,炔雌醚 橙红 黄绿 红色,炔雌醇 橙红 黄绿 絮状玫红,醋酸可的松 黄或微 褪色并澄 带橙 清,与硫酸成色操作简便，依颜色与荧光可区别，反应灵敏，为各国药典所用。 如中国药典：氢化可的松，2 mg，硫酸2 mg溶解，5分钟后现棕黄至红，并显绿色荧光，此液倾入10ml水中，变黄色至橙黄，有少量絮状沉淀生成。,(二) 官能团的反应,肾上腺皮质激素药物,呈色,四氮唑盐OH,1 C17 醇酮基,还原性,A. 呈色反应,例如中国药典中醋酸泼尼松的鉴别方法：本品1 mg，加乙醇2ml溶解，10 % 2滴。氯化三苯四氮唑试液1ml，显红色。,肾上腺皮质激素药物,Cu2O橙红色,碱性酒石酸铜,B. 酮基沉淀反应,Ag黑色,氨制硝酸银,多伦试剂,斐林试剂,甾酮类激素药物,呈色,羰基试剂,2. C3酮基和C20酮基,常用的羰基试剂：2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼,异烟腙（黄色）,睾酮,黄体酮,异烟双腙（黄色）,例如黄体酮的鉴别：取供试品 0.5 mg，与小试管中，加异烟肼1 mg，甲醇 1mg 溶解，显黄色。,具有甲酮基或活泼亚甲基的甾体激素类药物,呈色,亚硝基铁氰化钠间二硝基酚芳香醛,3. 甲酮基的成色反应,黄体酮,蓝紫色,亚硝基铁 氰化钠,其他甾体,淡橙色不显色,亚硝基铁氰化钠是黄体酮专属而灵敏的反应,黄体酮,蓝紫色,雌激素类药物,红色偶 氮染料,重氮苯磺酸,4. 酚羟基的成色反应,含炔基的甾体激素,银盐沉淀,硝酸银,5. 乙炔基的沉淀反应,炔雌醇,白,有机氟,F,有机破坏,有机氯,Cl,6. 有机卤素的反应,茜素氟蓝 硝酸亚铈,硝酸硝酸银,AgCl,呈色,茜素氟蓝,蓝紫色,F-,铈,药典规定地噻米松磷酸钠用氧瓶燃烧法处理，在 pH4.3条件下与硝酸亚铈反应成蓝紫。,脂肪链上的氯可水解脱落。中国药典规定氯倍他索，取少许，加乙醇加热，加硝酸2 ml，加硝酸银数滴，成白色沉淀。 氯在母核上（丙酸倍氯米松）不易脱落，要用氧瓶燃烧法处理。,香,7 酯的反应,特臭,特臭,不少药物是C17或C21上羟基的酯类。可根据羧酸的性质来鉴别，如是醋酸酯可用上述方法鉴别。,二 制备衍生物测定m.p.繁琐，但专属性强,（一）,羰基和氨基缩合后再测熔点，苯丙酸诺龙的鉴别方法： 取本品50 mg，加甲醇2 ml溶解。加盐酸氨基脲，4 ml，加热回流，30min，水浴浓缩，过滤，洗，干燥。M.p. 182 。,（二）酯的水解,（三） 其他羰基与羟胺成肟,KOH,羟基与酰氯成酯,-3-酮 240nm,苯环 280nm,（三） UV法,4 3 酮型,1，4 3酮 型,1，6 3酮 型,用最大吸收波长的吸光度的绝对值或两波长吸光度之比值进行鉴别。如中国药典规定：丙酸倍氯米松的乙醇液（20 ug/ml）在239nm处的最大吸收为0.57-0.60。239与263之比值为2.25-2.45。,33003000cm-1,30002700cm-1,19001650cm-1,16501450cm-1,1000650cm-1,（三） IR法,37503300cm-1,结构特征：酚羟基、C17 OH C17 乙炔基,炔雌醇,1505cm-1,3505cm-,3300cm-1,1590cm-1,3610cm-,酚羟基,醇羟基,1615cm-1,苯环的骨架振动,醋酸可的松,结构特征：43酮、C17 OHC20 酮基、 C11 酮基、醋酸酯,1630cm-1,3420cm-,亚甲基、角甲基吸收带,1750cm-1,1232cm-1,1052cm-1,结构特征：43酮、C17 OH C17乙炔基,炔孕酮,1650cm-1,3300cm-,3270cm-1,1615cm-1,五 TLC法,主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别,方法：对照品法 要求供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对照品溶液的主斑点相同。,炔诺酮TLC图,六 HPLC法,主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别（如：醋酸曲安奈德软膏、醋酸氟轻松软膏）,方法：对照品法 要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的tR与对照品峰的tR一致。,第三节、 杂质检查,（一）其他甾体,定义 与标示药物结构不同的甾体化合物都称为“其他甾体”,特点 （1）可能存在多个甾体杂质 （2）结构类似,2. 来源 原料、中间体、异构体、降解产物,4. 方法（具有一定分离能力） TLC法（高低浓度对比法） HPLC法（类似高低浓度对比法）,（一）TLC法（高低浓度对比法）,判定方法： 规定杂质斑点数目 规定杂质斑点颜色,氢化可的松检查其他甾体 取本品加氯仿-甲醇（9 ：1）制成3.0mg/ml作为供试液，精密量取适量，加氯仿-甲醇（9 ：1）稀释成0.06mg/ml作为对照液；照薄层色谱法，各取5l，分别点于同一硅胶G板上，展开后晾干，在105干燥10分钟，放冷，喷以碱性四氮唑蓝试液，,立即检视，供试品溶液如显杂质斑点，不得多于3个，其颜色与对照液的主斑点比较，不得更深。,1,2,特点： （1）简便易行，不需特殊的仪器； （2）需对照品； （3）只能控制单个杂质的限量； （4）要求杂质与主成分的显色灵敏度接近。,（二）HPLC法（高低浓度对比法）,判定方法： 规定杂质峰数目 规定杂质峰面积,取本品适量，精密称定，以甲醇为溶剂，配制成每1ml含1mg的溶液（1）与每1ml含0.02mg的溶液（2），用含量测定项下的方法和溶液，取5l注入液相色谱仪，调整仪器灵敏度，使主成分峰高度达记录仪的满量程。再分别取溶液（1）,黄体酮检查其他甾体,和溶液（2）各10l，进样。记录至主成分峰保留时间的1.5倍。溶液（1）显示的杂质峰数不得超过1个，各杂质峰面积及其总和分别不得大于溶液（2）主峰面积的3/4。,供试溶液：溶液（1）1mg/ml,对照溶液：溶液（2）0.02mg/ml,特点： （1）需特殊的仪器； （2）不需对照品； （3）可以控制杂质的总量；,剧毒,方法,醋酸氟轻松 检查硒 取本品50mg，照氧瓶燃烧法进行破坏后，将吸收液转移至100ml容量瓶中，用水15ml冲洗燃烧瓶及铂丝，并入吸收液中，用水加至刻度。取硒对照液（0.05ug/ml）和上述供试品溶液分别用氨试液调节pH值至2.0 0.2后，转移至分液漏斗中，用水,少量分次洗涤烧杯，洗液并入分液漏斗中，使成60ml，各加盐酸羟胺溶液（12）1ml，摇匀后，立即精密加二氨基奈试液5ml，摇匀，在室温下放置100分钟，精密加环己烷5ml，强烈振摇2，静置分层，取环己烷脱水后，测A378nm。 规定 A供A对。,（三）有机溶剂残留量检查-甲醇和丙酮,（灵敏度法）,甲醇 不得出峰 检测限= 3.1ng,丙酮 5.0% 内标法 + 校正因子,GC法,地塞米松磷酸钠检查甲醇和丙酮 精密量取甲醇10l(7.9mg)与丙酮100l(79mg)置100ml量瓶中，精密加内标溶液20ml，加水至刻度，作为对照液。精密称取本品0.16g，置10ml量瓶中，精密加内标溶液2ml，加水稀释至刻度，作为供试液；照气相色谱法测定，含丙酮不得过5.0%，并不得出现甲醇峰。,四 游离磷酸盐 对照品法,地塞米松磷酸钠氢化可的松磷酸钠倍他米松磷酸钠氢化泼尼松磷酸钠,原理：,方法：,地塞米松磷酸钠 检查 游离磷酸,精密称取本品20mg，置25ml量瓶中，加水15ml溶解，精密加钼酸铵硫酸试液2.5ml与1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液1ml，加水至刻度，摇匀，在20放置3050分钟，照分光光度法，在740nm处测定吸收度，与对照液4.0ml同法处理的吸收度比较，不得更大。,（对照液 0.0035%KH2PO4）,第四节 、含量测定（一）HPLC法 USP、BP、JP均采用 RPHPLC（大多内标法）（甾体激素类药物常含有结构相似的其他甾体杂质，对利用结构特征设计的比色法有干扰）特点 用样量少，灵敏度高，分离效果好，测定速度快。,二 UV法,-3-酮 240nm（）,肾上腺皮质激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素,苯环 280nm（）,雌激素,一、炔孕酮的含量测定 取本品，精密称定，加无水乙醇溶解并定量稀释制成每1ml约含10g的溶液,照分光光度法，在240nm的波处测定吸光度，按炔孕酮的吸收系数为390计算，即得。 本法以无水乙醇为溶剂配制供试品溶液。在最大吸收波长240nm处测定吸收度后，按已知的吸收系数计算含量，即采用吸收系数法计算,2.醋酸地塞米松片的含量测定醋酸地塞米松在240nm处有最大吸收（见图10-5），中国药典采用紫外分光光度法测定醋酸地塞米松片的含量取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于醋酸地塞米松不5哪），置沐叩叫量瓶中，加乙攀7侧，箕SQ戈一60弋的水攀冲保温l0min，并时时振摇使醋酸地塞米松溶解，放冷至室温，加乙醉稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液劲汕，置势二，加耐量瓶中，加艺薛室刻度，摇匀，吞240nm的波长处测定吸收度，按C24 H31拍韵瞬雌不数（武篡）为357计算，,三 比色法 （一）异烟肼比色法1 原理 ：C3酮基和某些位置上的酮基能在酸性条件下与羰基试剂异烟肼缩合,异烟腙（黄色）,2. 方法对照品法,暗45,3.讨论（1）溶剂的选择,异烟肼盐酸盐甲醇、乙醇,无水甲醇无水乙醇,酸、异烟肼的量,(2),盐酸 : 异烟肼 = 2 : 1,样品 : 异烟肼 = 1 : 8 ,t ,（3）水分、 温度、O2与光线的影响,含水量腙水解A%,不挥发溶剂、不吸收水分时 O2与光线无影响,（4）关于反应的专属性反应速度,C3= O C17= O 、 C20= O C11= O 不反应,对C3酮基最敏感。,三苯甲瓒深红,（二）四氮唑比色法 1 种类,氯化三苯四氮唑（TTC）红四氮唑（RT）,蓝四氮唑（BT）,双甲瓒（暗蓝）,2 原理 肾上腺皮质激素类药物的含量测定方法。C17 -醇酮基，具强还原性，四氮唑盐成有色的甲瓒。,O,OH-,分子重排,反应机制,醋酸泼尼松龙软膏含量测定对照液：精密称取醋酸泼尼松龙对照品20mg，置100ml量瓶中，加无水乙醇振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。,3. 方法 对照品法,供试液：精密称取本品4g（约相当于醋酸泼尼松龙20mg），置烧杯中，加无水乙醇约30ml，置水浴上加热，充分搅拌，使醋酸泼尼松龙溶解，再置冰浴中冷却，滤过，滤液置100ml量瓶中，同法提取,三次，滤液并入量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。测定法：精密量取上述溶液各1ml，分别置干燥具塞试管中，各精密加无水乙醇9ml与氯化三苯四氮唑试液2ml，摇匀，再各精密加氢氧化四甲基铵试液1ml，摇匀，在25暗处放置4050分钟，照分光光度法，在485nm的波长处分别测定吸收度，计算，即得。操作应避光。,4. 讨论,（1） 基团对反应速度的影响,C11= O C11OH,C21OH C21-酯,C16无论何种取代基,（2） 溶剂、水分的影响,含水量5%,含水10%A10%含水30%几无反应, 无水乙醇,（3）碱的种类及加入顺序,反应应在强碱性（pH13.75）条件下进行以氢氧化四甲基铵的结果最佳,加入顺序：,（4） O2与光线的影响,反应过程反应产物,怕光,避光、快速,O2影响颜色强度和稳定性,隔绝空气、 快速、充N2,（5） 温度与时间,t甲瓒分解%,4. 特点： 缺点 影响因素太多 优点 测定结果能指示药品 的稳定性（氧化及降解产物无此反应）,1. 原理 雌激素与硫酸乙醇反应呈色,（三）Kober反应比色法,2. 特点： 优点 较高的灵敏度 具有一定的选择性 缺点 非化学计量反应 反应控制条件、注意平行原则,1、熟悉本类药物的分类，掌握其结构 特征与分析方法的关系2、掌握红外光谱鉴别法及某些官能团 的呈色反应，了解其他鉴别方法3、掌握本类药物中其他甾体的检查方 法，了解其他特殊杂质的检查,第十章 复习内容,4、掌握四氮唑比色法、异烟肼比色法的原理、方法及测定条件。了解UV法、Kober反应比色法及HPLC法在其含量测定中的应用,参 考 习 题,甾体激素类药物的结构中能和 四氮唑盐发生显色反应的基团 A. 酚羟基 B. 活泼次甲基 C. 甲酮基 D. C17 -醇酮基 E. 酮基,用异烟肼比色法测定甾体激素药物含量时，其溶液的环境是 A强酸性 B中性 C强碱性 D弱碱性 E以上都不对,A维生素B1 B醋酸地塞米松 C两者皆是 D两者皆不是 31. 异烟肼比色法 32. 硫色素反应 33. 紫外分光光度法 34. 羟肟酸铁反应 35. 绿奎宁（Thaciaquin）反应,B,A,C,D,D,可用于氢化可的松鉴别的试剂有 A氨制硝酸银 B异烟肼 C红四氮唑 D硫酸 E重氮苯磺酸,可用于甾体激体类药物的测定方法有 A高效液相色谱法 B四氮唑盐法 C紫外分光光度法 D异烟肼比色法 EKober反应比色法,能与亚硝基铁氰化钠反应生成兰紫色的药物是 A雌二醇 B黄体酮 C醋酸可的松 D苯丙酸诺龙 E以上都不对,各国药典对甾体激素类药物常用HPLC或GC法测定其含量，主要原因是A. 它们没有特征紫外吸收，不能用 紫外分光光度法 B. 不能用滴定分析法进行测定 C. 由于“其它甾体”的存在，色谱法 可消除它们的干扰 D. 色谱法比较简单，精密度好 E. 色谱法准确度优于滴定分析法,异烟肼比色法测定甾体激素类药物时，药物的呈色基团是 A. 酮基 B. 酚羟基 C. 活泼次甲基 D. 炔基 E. 甾体母核,四氮唑比色法可用于下列哪个药物的含量测定 A. 可的松 B. 睾丸素 C. 雌二醇 D. 炔雌醇 E. 黄体酮,可适用的药物： A. 可的松 B. 雌二醇 C. 两者均可 D. 两者均不可亚硝酸钠滴定法高效液相色谱法能与羰基试剂缩合可用铁酚试剂比色法测定可用四氮唑比色法测定,D,C,A,B,A,Kober反应是 A. 雌性激素与硫酸乙醇共热呈色 B. 皮质激素与硫酸一乙醇共热呈色 C. 雌性激素与硫酸乙醇共热呈色， 用水或稀硫酸稀释后加热颜色改变 D. 维生素A与无水三氯化锑的无醇氯 仿溶液呈色 E. 异丙嗪于酸性条件下与钯离子呈色,黄体酮在酸性溶液中可与下列哪些试剂反应呈色 A. 2,4-二硝基苯肼 B. 三氯化铁 C. 硫酸苯肼 D. 异烟肼 E. 四氮唑盐,Kober反应适用于哪一药物的含量测定 A. 黄体酮 B. 雌二醇