生物反应工程基础

2.1酶催化反应概论2.1.1 酶的基本概念 酶是酶是生物体产生，起特殊功能的生物大分子，具有催化功能，因此也叫它生物催化剂。 酶虽来源于生物体，但它可以脱离生物体而独立存在。2.1.2 酶的稳定性及应用特点 酶是以活力、而不是以质量购销的。 酶有不同的质量等级：工业用酶、食品用酶、医药用酶。酶的实际应用中应注意，没有必要使用比工艺条件所需纯度更高的酶。,经典酶学研究中，酶活力的测定是在反应的初始短时间内进行的，并且酶浓度、底物浓度较低，且为水溶液，酶学研究的目的是探讨酶促反应的机制。 工业上，为保证酶促反应高效率完成，常需要使用高浓度的酶制剂和底物，且反应要持续较长时间，反应体系多为非均相体系，有时反应是在有机溶剂中进行。,2.1.3 酶的催化反应特点高效的催化活性：比非催化高1081020倍比非酶催化高1071013倍酶的催化作用可使反应速度提高106 1012倍。例如：过氧化氢分解 2H2O2 2H2O + O2用Fe+ 催化，效率为6*10-4 mol/mol.S，而用过氧化氢酶催化，效率为6*106 mol/mol.S。用-淀粉酶催化淀粉水解，1克结晶酶在65C条件下可催化2吨淀粉水解。,高度的专一性：对底物及其催化的反应,酶反应常需要辅因子的参与：酶的催化活性可被调控：浓度、激素、修饰,如抑制剂调节、共价修饰调节、反馈调节、酶原激活及激素控制等。,某些酶催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关。,酶易变性和失活：南极假丝酵母脂肪酶在80-90度、pH3-4仍有很强的催化活性,简单酶酶结合酶辅酶 （与蛋白质部分结合较松）辅因子辅基（与蛋白质部分结合较紧）全酶脱辅基酶蛋白,酶的组成,2.1.4 酶的活性中心活性中心,必需基团：两类接触残基、辅助残基、结构残基、非贡献残基结合部位和催化部位,2.1.5 酶的催化反应机制酶作用专一性机制：三点结合、锁匙学说和诱导契合学说,(a)“三点结合”的催化理论,认为酶与底物的结合处至少有三个点，而且只有一种情况是完全结合的形式。只有这种情况下，不对称催化作用才能实现。,（b）锁钥学说：,认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样,（c）诱导契合学说,该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状.,酶作用高效性机制： 广义的酸碱催化；共价催化；邻近及定向效应；扭曲变形和构象变化效应；多元催化与协同效应。 酶是生物为提高其生化反应效率而产生的生物催化剂。 国际生物化学协会（IUB）根据催化反应的类型，可将酶分为六大类：,氧化还原酶类 Oxidoreductases转移酶类 Transgerases水解酶类Hydrolases裂合酶类Lyases异构酶类Isomerases合成酶类Synthetases Synthases,氧化-还原酶 Oxidoreductase,氧化-还原酶催化氧化-还原反应。主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。,转移酶 Transferase,转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。例如， 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。,水解酶 hydrolase,水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：,裂合酶 Lyase,裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如， 延胡索酸水合酶催化的反应。,异构酶 Isomerase,异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。,合成酶 Ligase or Synthetase,合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。A + B + ATP + H-O-H =A B + ADP +Pi 例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸,核酸酶（催化核酸） ribozyme,核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一类特殊的RNA，能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。,2.2简单的酶催化反应动力学简单的酶催化反应是指由一种反应底物参与的无抑制不可逆反应1.2.1 M-M方程的建立,几点假设：1. CS0CE0，中间复合物ES的形成不会降低CS。2. 反应过程酶的总浓度不变。3. 产物的浓度较低，产物的抑制作用可以忽略。,快速平衡法推导动力学方程：E + SES为快速平衡，ESE+ P 为整个反应的限速阶段，因此ES分解成产物不足以破坏这个平衡。,rs：底物S的消耗速率（mol/Ls）rp：产物P生成速率（mol/Ls）v：反应体系的体积（L） ns、np：底物S和产物P的量（mol）t：时间（s）,根据上述假定(3)（存在控制步骤），可列出,Ks=K-1/K+1为解离常数（mol/l）,米氏方程rmax表示全部酶都呈复合物状时的反应速率。K+2又称酶的转换数，表示单位时间内一个酶分子所能催化底物发生反应的分子数。,GEBriggs和JBHaldane对上述第三点假设进行修正，提出了“拟稳态”假设。 认为由于反应体系中底物浓度要比酶的浓度高得多，中间复合物分解时所得到的酶又立即与底物相结合，从而使反应体系中复合物的浓度维持不变，即中间复合物的浓度不再随时间而变化。 消去 得 km：米氏常数(mol/l),km与ks的关系为由两种推导方法所得速率方程式形式基本相同，不同的是ks值代表反应的平衡常数，而km值称为米氏常数，它代表动态的平衡常数，表示实际的恒态时的浓率关系。 当 时，km值才接近于ks,km值是酶的一个很基本的特性常数，它和酶的浓度无关，但和温度、pH等因素有关。km值一般在10-610-2mol/L之间根据km值可以推断酶和底物的亲和力。如果酶的专一性不高，可催化几种底物发生反应时，km值最小的就表示酶与这一底物的亲和力最大，反之，则最小。,另一个动力学参数为最大反应速率，根据定义，它表示当全部的酶都是复合物状态时的反应速率。k+2表示单位时间内一个酶分子所能催化底物发生反应的分子数。因此它表示了酶催化反应能力的大小，不同的酶催化反应，其值不同。,从 S图的关系曲线可以看出，该曲线表示了三个不同的动力学特点的区域。当 时，该曲线近似为一水平线，表示当底物浓度继续增加时，反应速率变化不大。此时，酶催化反应可视为零级反应，反应速率将不随底物浓度的变化而变化。这是因为当km值很小时，绝大多数酶呈复合物状态，反应体系内游离的酶很少。所以即使提高底物浓度，也不能提高其反应速率。 即 或 当CS与km的数量关系处于上述两者之间的范围时，则符合MM方程所表示的关系式。,在上述M-M方程和B-H两个方程的推导中，都假设CE0Cs0,因而CES值也是很小的。如果酶的浓度很高，此时CES值在反应过程中有可能是很高的。若仍然采用上述方程会带来较大误差,2.2.3 参数的求取要建立一个完整的动力学方程，必须通过动力学实验确定其动力学参数。对Michaelis-Menten方程，就是要确定 rmax（或k+2）和km值。但直接应用Michaelis-Menten方程求取动力学参数所遇到的主要困难在于该方程为非线性方程。为此常将该方程加以线性化，通过作图法直接求取动力学参数。,1. 双倒数图解法（Lineweaver Burk图解）,将MM方程取其倒数得到下式:以 值对应于 作图：,双倒数作图法,斜率=Km/rmax,-1/Km,1/rmax,双倒数法应用广泛，但有两个缺点：1、选用基质浓度不宜等量增加，否则在作图时，点都会集中在纵轴附近，难于正确作图。基质浓度以选用1.0、1.11、1.25、1.43、1.67、2.0、2.5、3.33，5和10等为宜，这样倒数值几乎是等量递增的。2、反应速率测定稍有误差，其倒数值误差必将扩大，特别是在低浓度基质测定时，引起的误差更大，这样将影响直线斜率，影响 rmax及Km值 的测定。,2. 图解法（Hanes Woolf图解）,将MM方程变换成下式（双倒数式同时乘以S):以 为纵坐标，CS为横坐标，此方程为一直线方程，直线斜率为 ，与纵轴交点为 ，与横轴交点为 。,2.3有抑制的酶催化反应动力学抑制剂：在酶催化反应中，任何能直接作用于酶并降低酶反应速率的物质称为抑制剂。酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。b.能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物。,不可逆抑制：如果抑制剂与酶的基团成共价结合，则此时不能用物理方法去掉抑制剂。此类 抑制可使酶永久性地失活。例如：重金属离子对酶的抑制作用。如有机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯。,可逆抑制：可用诸如透析等物理方法把抑制剂去掉而恢复酶的活性，此时酶与抑制剂的结合存在着解离平衡的关系。包括：竞争性抑制，非竞争性抑制，反竞争性抑制，混合型抑制，底物抑制和产物抑制。,2.3.1 竞争性可逆抑制动力学当抑制剂与底物的结构相类似时，能在酶的活性部位上结合，从而阻止了酶与底物的结合，使酶催化底物的反应速率下降，这种抑制称为竞争性抑制。特点：抑制剂与底物竞争酶的活性部位，当抑制剂与酶的活性部位结合之后，底物就不能再与酶结合，反之亦然。,竞争性抑制反应机理：,非活性复合物,根据稳态假设，可列出方程:,竞争性抑制动力学的主要特点是米氏常数值的改变。当CI增加，或KI减少，都将使Km*增大，使酶与底物的结合能力下降，活性复合物减少，因而使底物反应速率下降。,抑制百分数i：i=（rS-rSI)/rS,某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。,竟争性抑制剂举例(琥珀酸),戊二酸,丙二酸,草酰乙酸盐,草酸,延胡索酸,2.3.2 非竞争性抑制若抑制剂可以在酶的活性部位以外与酶相结合，且这种结合与底物的结合没有竞争关系，这种抑制称为非竞争性抑制。,酶可以同时与底物及抑制剂结合，两者没有竞争用。酶与抑制剂结合后，可以与底物结合成SEI; 酶与底物结合后，也还可以与抑制剂结合。但是中间产物SEI不能进一步分解为产物，因此酶活性降低。,如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制,2.3.3 反竞争性可逆抑制动力学有些抑制剂不能直接与游离酶相结合，而只能与酶-底物的复合物ES相结合，生成SEI复合物，该复合物不能生成产物，导致酶催化反应速率下降，此种抑制称为反竞争性抑制。,反竞争性抑制时当Cs增加，抑制程度反而增加,2.3.5 底物抑制动力学有些酶催化反应，在底物浓度增加时，反应速率反而会下降，这种由底物浓度增加而引起反应速率下降的作用称为底物抑制作用。,2.3.6 不可逆抑制动力学不可逆抑制：抑制剂与酶活性部位的氨基酸残基形成共价键，致使酶永久性的失活。实际上没有完全的不可逆抑制作用，一般把抑制剂与酶反应的解离常数KI的数量级为10-9mol/L以下的抑制作用称为不可逆抑制。,2.3.4混合型可逆抑制动力学,式中KIS、KSI 分别为EI与S和ES与I相结合形成SEI的解离常数。当KIS=KSI时，为非竞争性抑制；当KSI趋于时为竞争性抑制，当KIS趋于时为反竞争性抑制，当KISKSI且均为常数值时，称为混合抑制。,可逆抑制作用的动力学特征,加入竞争性抑制剂后，Km 变大，酶促反应速度减小。,1. 竞争性抑制,无抑制剂,竞争性抑制剂,1/Vmax,加入非竞争性抑制剂后，Km 虽然不变，但由于Vmax减小，所以酶促反应速度也下降了。,2.非竞争性抑制,无抑制剂,非竞争性抑制剂,-1/km,2.4 复杂的酶催化反应动力学2.4.1 可逆反应动力学某些酶催化反应的逆反应相当明显，反应进行到一定程度后即达到平衡状态，此时底物和产物都具有相当的数量。,2.4.2 双底物、多底物反应动力学随机机制：两个底物分子随机地与酶相结合，两个产物分子也随机地释放出来。如激酶类催化。,顺序机制：底物与酶的结合和产物的释放是按一定顺序进行，产物不能在底物完全结合前释放。大部分脱氢酶类催化。乒乓机制：酶与一种底物结合后，先释放其对应的产物，然后再结合另一底物，并释放另一产物。关键问题： 底物A、B哪个先和酶结合？ 任何一个都有可能先与酶结合（随机机制） A先与酶结合或B先与酶结合 两底物同时与酶结合（可能性极小）,序列机制：序列有序反应,序列随机反应,乒乓机制：,2.4.3 变构酶催化反应动力学变构酶又称为调节酶，它是一种寡聚酶。这类 酶具有变构部位和活性部位。当底物分子与这类酶结合时，能诱导酶的结构 改变，增加酶与底物的结合能力，表现出底物 对酶的激活效应。 属于此类型的酶有磷酸果糖激酶、己糖激酶、 天冬氨酸转氨甲酰酶、苏氨酸脱氢酶等。机理复杂,2.5 影响酶催化活性的因素,2.5.1 pH的影响酶分子上有许多酸性和碱性的氨基酸侧链基团， 如果酶要表示其活性，则这些基团必须有一定的解离形式。随着pH 的变化，这些基团可处在不同的解离状态，而具有催化活性的离子基团仅是其中一种特定的解离形式，因而随着pH值的变化，具有催化活性的这种特殊的离子基团在总酶量中所占的比例就会不同，因而使酶所具有的催化能力也不同。,1.5.3 酶的失活动力学酶是一种不稳定的物质，常因温度、pH等因素的影响而产生不可逆的活性下降。一般是胞外酶较稳定，而胞内酶在外部环境中容易失活。酶在保存和参与反应时均有可能失活。如果酶在保存过程中，由于时间的原因而使其失活，该失活类型称为酶的静态稳定性。如果酶在参与反应过程中发生的失活，则该失活被称为酶的操作稳定性。,1.5.2 温度的影响,了解未反应时酶的热稳定性关系到酶的保存。测定酶未反应时的热稳定的方法，是在一定条件下，使酶溶液恒温保持一定的时间，然后在最适宜的pH和温度下测定残存的酶活力，即残存酶活。,在不同温度下反复测定，即可得到一条曲线。该曲线可以表示的酶失活特性，称为酶的热稳定性。若改变保温时间，则会得到不同的稳定曲线。,1、静态稳定性中酶的失活动力学,如要了解酶在未反应时的失活速率，可将残存的酶活性对其失活时间作图，则又