免疫组化讲座

免疫组化Immunohistochemistry,汪丛丛 2013年9月,免疫组化,免疫组化（Immuno-histo-chemistry）IHC 应用抗原与抗体特异性结合的原理，对组织或细胞内的抗原进行原位定位、定性及定量检测的技术。,一、免疫组化步骤,样品制备,样品制备：组织 ：石蜡切片、冰冻切片样品固定：固定液包埋：脱水、透明、浸蜡切片细胞：细胞爬片,预处理,抗原修复内源酶封闭非特异性位点封闭,原理：甲醛的聚合作用，造成细胞内的蛋白质分子键相互交联固定液的作用，使氨基酸残基在分子内或分子间形成醛键细胞内抗原决定簇被掩盖，抗原不能与抗体充分反应作用：掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露抗原性得到一定程度的恢复提高免疫组化染色的阳性率,抗原修复,直接法,Tissue Antigen,Labeled Antibody,将荧光、酶直接标记在一抗上优点：简单方便缺点：灵敏度低每种一抗都需要进行标记,间接法,Tissue Antigen,Primary Antibody,Secondary Antibody,将荧光、酶等标记在二抗上优点：灵敏度高只需要少数标记的二抗可以和相应的一抗反应,免疫组化SP法,SP法-链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法 （streptavidin-peroxidase）一抗生物素标记的二抗Streptavidin-HRP（HRP标记的链霉亲和素）简化实验步骤减少非特异性背景,ABC法 (Avidin Biotin-peroxidase Complex)一抗生物素标记的二抗Avidin-Biotin-HRP Complex（亲和素-HRP标记的生物素）,亲和素与HRP标记的生物素混合，放置30分钟。一个亲和素分子具有可与生物素结合的四个部位。大大增加了结合到生物素上的过氧化物酶，提高了显色反应的 灵敏度。,免疫组化ABC法,抗体孵育,一抗的选择 单克隆抗体 多克隆抗体二抗的选择 酶 - HRP、AP（磷酸酯酶）等 荧光基团 - Cy3 、Cy5、 FITC等 生物素,多克隆抗体,单克隆抗体,免疫组化在肿瘤诊断中的应用,肿瘤抗原,肿瘤抗原（tumor antigen）是指在肿瘤发生、发展过程中新出现的或过度表达的抗原物质。 肿瘤特异性抗原（tumor sepific antigen，TSA）指只存在于肿瘤细胞表面，而不存在于正常相应组织或细胞的大分子物质。 肿瘤相关抗原（tumor associated antigen，TAA）是指非肿瘤细胞所特有的，既存在于肿瘤细胞表面，也存在于相应的正常细胞中，只是在细胞癌变时其含量才会明显增加。,肿瘤抗原肿瘤标志物,肿瘤抗原可以是肿瘤标志物，但肿瘤标志物不一定是肿瘤抗原。,常见的肿瘤标志物,免疫组化在肿瘤诊断中的应用,上皮性肿瘤标记,间叶源性肿瘤标记,基因抗体标记,双向分化肿瘤标记,肿瘤细胞增殖活性与细胞凋亡标记抗体,神经细胞、胶质细胞及神经内分泌肿瘤标记,淋巴网状组织肿瘤标记,肿瘤标记,（一）上皮性肿瘤标记1角蛋白（Keratin）：一种中间丝蛋白，分: （1）表皮角蛋白（Epidermal keratin，EK）鳞状上皮或高分化鳞癌标记； （2）细胞角蛋白（cytokeratin，CK）低分子角蛋白，对腺癌、移行细胞部及低分化鳞癌标记。一般用广谱型角蛋白抗体为好，常用。,二、免疫组化在肿瘤诊断中应用,2上皮膜抗原（Epithelial membrane antigen，EMA）：这亦是常用的上皮细 胞标记抗体，细胞膜阳性，用Zankers、Bouin或B5固定液中固定为好。其在低分化和未分化上皮中表达好，但亦可在间变性大细胞淋巴瘤、恶性横纹肌样瘤中表达。3桥粒蛋白（Desmoplakin）：主要标记上皮桥粒，Desmo仅表达于复层上皮。,4癌胚抗原（Carcinoembrgonic antigen，CEA）：是从结肠癌中分离而得一种球蛋白，定位于细胞膜上，对肠、胃、肺、胰、肝、乳腺等腺癌标记阳性，但个别非上皮肿瘤也可阳性。5甲胎蛋白（Alpha Fetoprotein，AFP）：由胎肝细胞提取的一种酸性糖蛋白，细胞浆和膜上表达，它对肝细胞癌、卵黄囊癌的特异性标记。,是一种可溶性糖蛋白，胚胎期主要存在于胎儿的胃肠管、胰腺和肝脏。胃肠道恶性肿瘤时可见血清CEA升高，在乳腺癌、肺癌及其他恶性肿瘤中也可出现表达，并分泌于体液中。,临 床 意 义,恶性肿瘤的辅助诊断：CEA在中晚期肿瘤中的阳性率胰腺癌 8891肺癌 76结肠癌 73乳腺癌和卵巢癌 73膀胱癌、宫颈癌和子宫内膜癌中也有升高,CEA 的 优 势,CEA是一个结肠癌标记物，CEA与CA-242联合应用目前被认为是对结肠癌的最佳标记物的搭配。在整个直肠癌治疗其间，CEA是一个有效的监视指标，是发现复发的理想指标，其敏感性高于X线和直肠镜。,CEA的局限性,只在肿瘤的中晚期才有较显著的升高，也不只局限于某一类肿瘤，因此CEA对多数肿瘤的早期发现与鉴别诊断并无帮助；CEA具有较高的假阳性和假阴性，并不适合用于肿瘤的普查 。,预后的评估,术前CEA水平正常的患者手术治愈率高，术后不易复发若术前CEA已升高者，则大多数已有血管壁、淋巴系统和周围神经的侵犯和转移，预后较差术后若癌症有转移或复发者，在临床症状出现前10周13个月，CEA就有可能开始升高，CEA浓度变化随病情进展而升高,伴CEA升高的良性疾病,吸烟者溃疡性结肠炎胰腺炎结肠息肉,（二）间叶源性肿瘤免疫组化标记 间叶组织包括纤维结缔组织、脂肪、肌肉、血管、骨、软骨及外周神经等，间叶组织肿瘤往往由多向分化的原始间叶细胞产生，存在共性，标记抗体特异性不足，有交叉反应。 1波纹蛋白（Vimentin，Vim）：是一种细胞中间丝蛋白抗体，在多数软组织肿瘤均可表达，但纤维细胞较明显，在一些上皮性肿瘤也有阳性反应。常用作间叶源与上皮源肿瘤的第一线鉴别抗体 。,2结蛋白（Desmin，Des）： 平滑肌、横纹肌均可阳性。3肌动蛋白（Actin）：平滑肌、血管 内皮、肌上皮细胞标记，HHF35特异。4肌球蛋白（Myotlobin），肌红蛋白 （myosin）：对横纹肌标记较好。5第因子，CD34：对血管内皮细胞肿瘤标记 较特异。,6S-100蛋白：是一种周围神经 雪旺氏细胞特异标记抗体，后发现 对脂细胞、朗格罕氏细胞、肌上皮 细胞、黑色素细胞及其肿瘤均可阳性。7酸性或碱性磷酸酶：对骨与软骨肿瘤 标记好。,（三）双向分化肿瘤标记 即有上皮与间叶两种细胞分化的肿瘤的标记，如滑膜肉瘤、间皮肉瘤、脑膜瘤、癌肉瘤、上皮样肉瘤等，一般采用CK、EMA标记上皮，Vim等标记间叶细胞。 另外有一种恶性纤维组织细胞瘤，由纤维细胞、肌纤维母细胞和组织细胞混合组成的恶性肿瘤，故应用Vim和组织细胞标记来诊断。,（四）神经细胞、胶质细胞及神经内分泌肿瘤标记1神经原特异性烯醇化酶（Neuron Specific Enolase，NSE）：神经原肿瘤标记。2胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillaly Acidic protein，GFAP）：脑胶质细胞特异性标记抗体。CD34+F8血管,3神经内分泌肿瘤标记：包括类癌、胰岛、垂体瘤、甲状腺髓样癌、皮肤Merkel细胞癌、原始神经外胚层瘤（PNET）等，目前应用NSE、嗜铬蛋白颗粒A（CgA）及触突素（Syn）三种抗体同时或两种一起用，因NSE不够特异。,（五）淋巴网状组织肿瘤（淋巴瘤）标记1B细胞标记抗体：CD20（L26），Ig重链（IgG、M、A、E）、轻链（、）、CD79a。2T细胞标记抗体：CD45RO（UCHL-1），CD3较好。CD563组织细胞标记抗体：Mac387、CD14、抗溶菌酶（lysozyme）、抗糜蛋白酶（-1 Antichymotrypsin）等。,4霍奇金淋巴瘤（Hodgkins lymphoma，HL）R-S细胞（Reed-Sternberg cell）标记抗体：CD15、CD305白细胞共同抗原（leucocyte common Antigen，LCA）：它对淋巴网状细胞均为膜阳性，作第一线抗体为好。注：（1）国际上将百余种标记抗体统称为CD（Cluster Designation）系列。 （2）淋巴细胞标记与R-S细胞多数为膜阳性，而Ig与组织细胞标记为胞浆阳性。,（六）肿瘤细胞增殖活性与细胞凋亡标记抗体 瘤细胞增殖指数反应细胞增殖活性，是瘤细胞新生（恶性）状况的客观指标，与凋亡指数呈反比关系。常用抗体有：1增殖细胞核抗原（proliferative neuclear Antigen，PCNA），核阳性。2Ki-67，Brdu抗体：原要求新鲜组织，新近有Ki-67石蜡切片标记抗体问世。,3细胞凋亡（Apoptosis）标记抗体：开始发现细胞凋亡发生于正常细胞受基因调控性自然性死亡。后发现肿瘤细胞亦可发生，而且某些药物放、化疗亦可诱发细胞凋亡，故成了研究肿瘤发生、发展、治疗的热点。其标记抗体有： （1）凋亡抑制基因蛋白抗体：Bcl-2、Bcl-XL、mtp53。 （2）促凋亡基因蛋白抗体：Fas/FasL系统，wtp53、Bax、Bcl-xs、Fas等。Tunel标记。,（七）癌基因与抗癌基因，促转移与转移抑制基因蛋白抗体标记。 目前应用很多，因方法比分子生物学技术简单，但是这种结果不能直接反应肿瘤基因的活性，只能间接反应肿瘤基因代谢活性，要注意正确评价它的价值。,TM基本上不能对肿瘤定位 极少数TM如PSA，甲状腺球白等具器官特异性，但不是肿瘤特异性。,三、肿瘤标志物的临床意义,（一）定位,通常不能进行确诊因为TM无足够的灵敏度，不能排除假阴性结果。但本周蛋白(多发性骨瘤）、 AFP（肝癌）、-HCG（绒毛膜癌）和降钙素（C-细胞癌）等有助确诊。,（二）确诊,大多数TM与疾病分期有关，且浓度与肿瘤大小通常存在关联但并不能根据个体测得值来判断肿瘤大小，也不能以TM 浓度精确指示各期肿瘤，因为各期肿瘤的TM浓度范围极广，且互相重叠。,（三）分期,术前TM浓度增加，术后降低，表示这些TM对此肿瘤有预后价值。在病程监测中，TM的浓度增加或降低与疾病的预后密切相关。,（四）预后,TM评价治疗有效性方案（Beastall, 1991),无效：TM浓度与治疗前相比下降50%有效：TM浓度与治疗前相比下降90%显效： TM浓度下降至临界值以下,1肿瘤的大小和肿瘤细胞的数目：肿瘤越大细胞越多，肿瘤标志物的浓度越高。 2肿瘤细胞合成和分泌肿瘤标志物的速度：肿瘤细胞合成和分泌肿瘤标志物的速度