变态反应原性试验

2017/12/24,1,变态反应原性试验基础及实践,2017/12/24,2,报告内容,一、 变态反应原试验的基本概念二、 具有变态反应原的物质三、 抗体种类及过敏型四、 变态反应原试验的设计思路五、 变态反应原试验的实际,2017/12/24,3,一、变态反应原试验的基本概念,1、机体的防御功能 机体具有防御功能的免疫系统。该系统对微生物、化学物质等外来异物通过特异性抗体或致敏淋巴细胞进行各种防御作用，但有时这些防御过程对机体产生不良的反应。2、变态反应原性试验的目的 变态反应原性试验就是研究药物对人体是否产生过敏性休克等变态反应原的可能性。研究药物变态反应原时，应介绍致敏原性和攻击原性两个概念，致敏原性是指药物或其分解物刺激机体的免疫功能而产生抗体的能力。攻击原性是指在致敏成立的动物再次注射抗原时，产生变态反应原性反应的能力。,2017/12/24,4,二、具有变态反应原性的物质,高分子物质: 蛋白质等多数具有变态反应原性。把这些物质给予动物后，可以产生抗体。这种状态称之为致敏状态。一般情况下，蛋白质、多聚糖、核酸等高分子化合物具有变态反应原性，当机体识别这些高分子等异物时产生抗体。低分子物质：化学物质等低分子化合物一般不具有变态反应原性，但当这些物质与机体内高分子物质(血清白蛋白等蛋白质)结合时，可诱导低分子化合物产生自身的抗体 。具有这种性质的低分子化合物称之为半抗原，青霉素就是一个典型的例子，在临床上可以产生严重的过敏性休克。,2017/12/24,5,三、抗体类型及过敏反应型,抗体的类型：IgE 、IgM、IgG。IgE抗体：产生过敏性休克称为型过敏反应IgG及IgM抗体：可产生溶血性贫血称为型过敏反应及血清病称为型过敏反应。变态反应原试验最基本的要求：当药物给予机体后是否产生抗体进行研究。,2017/12/24,6,四、变态反应原性试验的设计思路（1）,1、高分子化合物 一般情况下，高分子化合物既有致敏原性，又有攻击原性。所以在考察受试物是否具有变态反应原时，按照表1进行试验就可以得到正确的评价。 表1 传统的变态反应原性试验设计 组别 致敏 攻击 受试物组 受试物 受试物 阴性对照组 溶媒 受试物 阳性对照组 阳性对照物 阳性对照物,2017/12/24,7,四、变态反应原性试验的设计思路（2）,2、低分子化合物 化学物质等低分子化合物一般不具有变态反应原性，但当这些物质与机体内高分子物质(血清白蛋白等蛋白质)结合时，可诱导低分子化合物产生自身的抗体 。 表2 低分子化合物变态反应原性的设计 组别 致敏 攻击 受试物组 受试物 受试物 受试物-蛋白结合物 受试物-蛋白 受试物-蛋白 受试物 结合物组 结合物 受试物-蛋白结合物 阴性对照组 溶媒 受试物 受试物-蛋白结合物 阳性对照组 阳性对照组物 阳性对照物,2017/12/24,8,四、变态反应原性试验的设计思路（3）,分子量大小的界线：一般以20k为界线。全抗原及半抗原：高分子化合物一般称全抗原，低分子化合物一般称半抗原。载体蛋白(carrier protein) ：低分子化合物与牛血清白蛋白(BSA)的结合物给予动物后使致敏成立，再给予抗原攻击时，使攻击成立，蛋白质叫做载体蛋白，复合物(conjuste) ：受试物与蛋白质的结合物叫做复合物。,2017/12/24,9,四、变态反应原性试验的设计思路（4）,表3 生物技术药物变态反应原性试验的设计 组别 致敏 攻击 受试物组 受试物 受试物 不纯物 阴性对照组 溶媒 受试物 不纯物 不纯物组 不纯物 受试物 不纯物,2017/12/24,10,四、变态反应原性试验的设计思路（5）,生物技术药物变态反应原性的几种情况 1、人原性：氨基酸序列与人类相同，并不纯物可控。 一般不要求该试验。 2、非人原性（改构、融合蛋白等）要求该试验。 3、不纯物：生物技术药物在制造过程中易混入杂质，疫苗多数是利用遗传学基因重组方法，例如用酵母或大肠杆菌制造的生物技术药物。在这些药物的最终产品中可能混入由酵母和大肠杆菌带来的不纯物质，这些不纯物多数含有蛋白质，是引起变态反应原性反应的重要原因。因此也要求该试验。,2017/12/24,11,五、变态反应原试验的实践（1）,1 、主动性全身过敏反应试验 (Active Systemic Anaphylaxis, 简称ASA)常用豚鼠，检测IgE抗体。反应原理 1. 由抗原致敏产生IgE抗体。 2. IgE抗体与肥大细胞及嗜碱性粒细胞结合。 3. 细胞表面的IgE抗体与(攻击)抗原的结合。 4. 伴随着脱颗粒的过程释放化学介质。 5. 化学介质引起的变态反应原性反应。,2017/12/24,12,五、变态反应原试验的实践（2）,ASA试验的基本设计 *静注后观察全身症状,致敏(sc or ip),攻击(iv),2017/12/24,13,五、变态反应原试验的实践（3）,ASA 阳性反应症状- 无症状无症状+ 不安、哆嗦、搔鼻、打喷嚏、排尿、脱便及呼吸急促。+ 除以上各症状外，还有呼吸困难和运动障碍。+ 除以上各症状外，呼吸衰竭，直至痉挛，但可恢复。+ 死亡。ASA 阳性反应原因 由于化学介质的释放，支气管、肠、膀胱等处的平滑肌收缩导致呼吸困难、非自主排尿、排粪，并伴随严重的肺气肿等。注意：攻击抗原经皮下、腹腔等非静脉给药时，症状出现及死亡时间明显延长，多数因脏器充血导致低血压而死亡，给症状观察带来不便。,2017/12/24,14,五、变态反应原试验的实践（4）,2、 被动皮肤过敏反应 ( Passive Cutaneous Anaphylaxis, 简称ASA)常用豚鼠、小鼠、大 鼠，检测IgE、IgG抗体。反应原理 该反应是评价抗体滴度的一种方法。把致敏动物（内含大量的 IgE、IgG抗体）抗体与局部皮肤肥大细胞的Fc受体结合，使其被动致敏。当致敏抗原攻击时，引起局部肥大细胞释放过敏介质，使局部血管的通透性增加，注入的染料在该皮肤处渗出着色。,2017/12/24,15,五、变态反应原试验的实践（5）,PCA试验的基本设计 致敏时间 * 观察静注后皮肤产生的兰色斑,致敏(sc or ip),采血(心脏),攻击(iv+色素),被动致敏(皮内),2017/12/24,16,五、变态反应原试验的实践（6）,由于IgE 和IgG抗体对动物皮肤的亲和性不同，抗体出现的时间也不一致。下表所示致敏动物、被动致敏动物及被动致敏后各种抗体的检出情况。PCA反应形式和被检出抗体的种类 致敏动物 被动致敏动物 致敏时间* 被检出的抗体 豚鼠 豚鼠 4hr IgG1 豚鼠 豚鼠 48hr-8 days IgE 小鼠 大鼠 24hr-48 hr IgE 小鼠 小鼠 1hr IgG1、2a、2b 小鼠 豚鼠 3hr IgG2a *：皮下注射后到静注抗原攻击时间,2017/12/24,17,五、变态反应原试验的实践（7）,PCA反应观察及评价： 攻击抗原注射数分钟后，皮肤表面就能看到漏出的兰色斑点，30分钟后，放血处死动物，将背部的表皮剥离，从皮肤内侧测量色斑的长经和短经，平均值在5mm以上时判断为阳性反应。评价有两种方法，一种是呈阳性反应的最高稀释倍数的抗体价为指标。另一种是固定的血清稀释倍数后以色斑的大小为指标。需要了解正确的抗体价应选择前者。否则可以选择后者。,2017/12/24,18,五、变态反应原试验的实践（8）,同种PCA反应(homologous PCA)：豚鼠与豚鼠同种之间所进行的PCA反应称，如豚鼠-豚鼠4hr-PCA试验。异种PCA反应(heterologous PCA)：小鼠和大鼠这样异种间所进行的PCA反应叫称，如小鼠-大鼠24hr-PCA试验。伊文思兰染料(Evans blue)：为使局部的免疫能够定量化，通常加入浓度为0.5-1%及容量与攻击抗原相同的伊文思兰染料。攻击途径：PCA、ASA反应均要求攻击抗原能迅速到达全身的各部位，必须是静脉给药。PCA(福氏完全佐剂)：为了加强抗原的致敏，通常选择与抗原一起给药。,2017/12/24,19,五、变态反应原试验的实践（9）,ASA与PCA两实验结合设计法：,致敏(sc or ip),攻击(iv)完成ASA反应,采血（心脏）进行PCA反应,2017/12/24,20,五、变态反应原试验的实践（10）,3、抗体滴度的测定 (Enzyme-linked immunosorbent assay) 抗体和抗原的定性和定量用高灵敏性的放射免疫测定法(Radioimmunoassay RIA)。反应原理 将抗原吸附在固定相(Microplate)上，被固定的抗原与特异性抗体结合，根据第二抗体酶水解底物的量进行定性和定量方法。,2017/12/24,21,五、变态反应原试验的实践（11）,方法简述：,固定抗原,测定材料的添加,洗 涤,测定吸收度,酶基质的添加,酶标抗体反应,洗 涤,保 护,2017/12/24,22,固定抗原,ELISA法使用的平皿多数是用聚苯已烯或氢氧化乙烯树脂制成的，有市售品。对于蛋白质抗原来说，用碳酸氢钠缓冲液或者用磷酸生理盐水缓冲液稀释成5ug/ml左右时容易被固定相吸附。 被固定处理的抗原液100ul加入平皿后4放置一夜或者室温下放置3小时。,2017/12/24,23,保 护,平皿固定处理后，在平皿表面还有未被吸附的抗原，这些抗原容易与无关的蛋白反应产生非特异性抗体，因此，应采取措施防止非特异性抗体的吸附。具体用明胶或Bovine serum albumin溶解在碳酸和磷酸生理盐水使之配成0.1-1% 的溶液，以1.5-2倍的量加入抗原液以后，在室温下放置3小时以上起到保护作用，保护结束后将洗净干燥，在阴冷处保存数月或一年都可以使用。,2017/12/24,24,添加被检血清(抗血清),与固定后的抗原发生反应可以获得抗血清抗体，抗血清用0.5%Tween20/PBS或者1%BSA/PBS稀释以后，每平皿加入100ul，室温或者专门的恒温箱(37)中，反应1小时以上。,2017/12/24,25,洗净操作,1 目的是洗掉与抗原抗体反应无关的非特异性抗体，平皿中加入洗净液后，吸收、去除的操作重复3次。,2017/12/24,26,二次抗体反应,1 检测抗体是否具有特异性，添加用酶标记抗体，室温下至少反应1小时可以得到结果。酶标记所用的酶一般采用Peroxidase(POX)、Alkaline phosphatase(ALP),从灵敏度来看，ALP是POX的10-400倍，但价格很高。用酶标记抗体的预备实验，非特异性的显色很少，事先稀释后，能够检测出非特异性抗体，市场上出售的标记抗体种类很多，灵活地对它们进行运用，将会对工作带来方便。,2017/12/24,27,显色反应,二次抗体反应结束以后，用PBS-Tween清洗3次，加入作用于酶(标记时用)的显色物质100ul，在室温下反应15分钟以后，加入反应停止液(1-2NH2SO4)100ul。,2017/12/24,28,吸光度的测定,1,1 各受试样品的吸光度用专门的测定装置(ELISA reader, Microplate reader)来测定，使用上述基质，再用硫酸停止反应的测定波长是490nm.,2017/12/24,29,免疫毒理非临床安全性评价现状（1）,1）免疫毒理从不良反应表现形式角度分包括免疫抑制、自身免疫、抗原性、过敏反应、免疫刺激。2）为什么要注意该问题，免疫毒性是药品安全性的重要问题，（1）免疫抑制对已有免疫功能损害、患慢性病可能出现免疫功能低下、营养不良的病人及免疫功能尚未成熟的儿童的影响都是值得高度重视的（2）药物所致过敏反应和自身免疫疾病已上市药物从市场撤出的主要原因。（3）药物（分子量10000KD的蛋白类、肽、聚合物和分子量的低分子化合物如青霉素和磺胺的代谢产物或作为半抗原）的抗原性直接影响药物的生物活性（抗体中和作用影响药效、毒性、代谢），尤其是较长时间给药时；也可产生过敏反应。（4）近年来免疫免疫调节剂的大剂量和过长时间使用已表现出对免疫功能的损害，而免疫刺激剂二性霉素B表现出刺激巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子的作用，硫代磷酸寡脱氧核苷酸刺激IgG和IgM的产生，补体系统的激活和B淋巴细胞的增生（属2，3型变态反应）。,2017/12/24,30,3）毒理试验方法的现状：虽受到广泛重视，尚未找到能被普遍接受、合理、重复性好、简便易行的检测评价方案。目前FDA正在制订免疫毒理评价的技术指导原则，美国FDA和欧共体已建议可以加强现有的一些常规毒理研究试验（尤其是长毒试验）来对上述各种免疫毒性进行观察和在必要时进一步研究，具体体现在：,2017/12/24,31,免疫抑制、免疫刺激可在常规毒理学实验中进行观察和检测，过敏反应的某些改变也可在常规毒理试验中观察（如贫血、白细胞减少、血小板减少、肺炎、静脉炎、肾小球肾炎等与2、3、4型过敏反应相关，过敏性休克及致死与1型变态反应相关，欧共体建议采用小鼠局部淋巴结实验来代替