课题3　分解纤维素的微生物的分离

微生物的培养与应用微生物的培养与应用 课题课题 3 3 分解纤维素的微生物的分离分解纤维素的微生物的分离 一 基础知识一 基础知识 一 纤维素与纤维素酶 1 纤维素 纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物 是地球上含量最 丰富的多糖类物质 植物的根 茎 叶等器官都含有大量的纤维素 其中棉花是自然界中纤 维素含量最高的天然产物 2 纤维素酶 纤维素酶是一种复合酶 一般认为它至少包括三种组分 即 CX酶 C1酶 和葡萄糖苷酶 前两种酶使纤维素分解成纤维二糖 第三种酶将纤维二糖分 解成葡萄糖 二 纤维素分解细菌的筛选 分解纤维素的微生物 有各种细菌 真菌和少数放线菌 1 筛选方法 刚果红染色法 2 筛选方法的原理 刚果红是一种染料 它可以与纤维素形成红色复合物 但并不和纤维二 糖 葡萄糖发生这种反应 当纤维素被纤维素酶分解后刚果红 纤维素的复 合物就无法形成 培养基中会出现以纤维素分解为中心的透明圈 这样我们 可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌 二 实验设计与操作二 实验设计与操作 一 土壤取样 1 取样环境 选择纤维素丰富的环境 2 理由 由于生物适应一定的环境 环境对生物有选择作用 在富含纤维素的环 境中 纤维素分解菌的含量相对提高 因此从这种土样中获得目的微生物的 几率要高于普通环境 3 实例 树林中多年落叶形成的腐殖土 多年积累的枯枝败叶等 4 讨论 如果找不到合适的环境 可以将滤纸埋在土壤中 将滤纸埋在土壤 中有什么作用 你认为滤纸应该埋在土壤中多深 答 将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中 实际上是人工设置 纤维素分解菌生存的适宜环境 一般应将滤纸埋于深约 10cm 左右的土壤中 二 选择培养 1 目的 增加纤维素分解菌的浓度 以确保能够从样品中分离所需要的微生物 2 制备选择培养基 纤维素粉 5g NaNO31g Na2HPO4 7H2O1 2g KH2PO40 9g MgSO4 7H2O0 5g KCl0 5g 酵母膏 0 5g 水解酵素 0 5g 溶解后 蒸馏水定容至 1000mL a 该培养基是液体培养基还是固体培养基 为什么 答 是液体培养基 原因是配方中无凝固剂 b 这个培养基对微生物是否具有选择作用 如果具有 是如何进行选择 的 答 有选择作用 本配方中的碳源是纤维素 所以能分解纤维素的微生 物可以大量繁殖 c 你能否设计一个对照实验 说明选择培养基的作用 答 用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照 3 操作方法 称取土样 20g 在无菌条件下加入装有 30mL 培养基的摇瓶中 将摇瓶置 于摇床上 在 30 下振荡培养 1 2d 至培养基变混浊 吸取一定的培养液 约 5mL 转移至另一瓶新鲜的选择培养基中 以同样的方法培养到培养液 变浑浊 思考 为什么选择培养能够 浓缩 所需的微生物 答 在选择培养的条件下 可以使那些能够适应这种营养条件的微生物 得到迅速繁殖 而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制 因此可 以起到 浓缩 的作用 三 梯度稀释 按照课题 1 的稀释操作方法 将选择培养后的培养基进行等比稀释 稀 释最大倍数到 106 四 将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 1 制备鉴别培养基 参照旁栏中的比例 2 涂布平板 将稀释度为 104 106的菌悬液各取 0 1ml 涂布在培养基上 30 倒置培养 五 挑选产生透明圈的菌落 参照课本刚果红染色法 挑选产生透明圈的菌落 一般即为分解纤维素 的菌落 将挑选的菌种接种到纤维素分解菌的选择培养基上 在 30 37 培养 可获得纯培养 两种刚果红染色法的比较 方法一 先培养微生物 再加入刚果红进行颜色反应 方法二 在倒平板时就加入刚果红 优点 显示出的颜色基本上是纤维 素分解菌的作用 操作简便 不存在菌落的混杂问题 缺点 操作繁琐 加入刚果红会使 菌落之间发生混杂 由于产生淀粉酶的微生物也形成透明圈 所以可能产生假阳性反应 有些微生物具有降解色素的能力 他们 在培养过程中也会形成明显的透明圈 与 纤维素的分解菌不易区分 思考 本实验的流程与课题 2 中的实验流程有哪些异同 答 课题 2 是将土样制成的菌悬液直接涂