结核病实验室检查临床价值

,结核病各项实验室检查的临床价值,山西省结核医学中心太原市第四人民医院段慧萍,结核病概况,病原学,1882年 德国柯赫医生发现结核致病菌-结核杆菌,1897年提出结核病的飞沫传播1922年，卡介苗为预防结核病首次对新生儿接种1945年，链霉素的问世使肺结核不再是不治之症。,1998年完成了结核分枝杆菌标准株H37Rv的基因组测序,流行病学,病 因,发病机制,初次感染与再次感染（1）初次感染 淋巴结肿大、可向全身播散（2）再次感染 常表现为局部组织反应剧烈 不易引起淋巴结肿大 不易发生全身播散,病 理,结核病分型,临床表现,实验室检查,影像检查,病理检查,+,临床,诊断,治疗,化学治疗对症治疗手术治疗,实验室各项检查临床价值,结核病实验室检查,细菌学检查,免疫学检查,分子生物学检查,涂片染色镜检分枝杆菌分离培养分支杆菌药敏试验分枝杆菌菌种鉴定噬菌体生物扩增法,生物化学检查,最原始最基础的检测方法,涂片镜检,涂片染色镜检临床价值,适用于多种标本； 操作简便，价格低廉。,确诊涂阳结核病及开放性结核,2份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性； 1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+肺部影像学检查符合活动性肺结核表现。,肺结核治疗评估的主要依据之一,治愈：涂阳肺结核患者完成规定疗程，连续2次涂片结果阴性，其中1次是治疗末的涂片。治疗失败：新涂阳患者治疗第5个月末或疗程结束时，痰涂片检查阳性，涂阴肺结核患者治疗过程中任何1次痰菌检查阳性，均为治疗失败。,缺点：不能区别是否为非结核分枝杆菌 不能区别死活菌。 结核杆菌暴露于异烟肼时，某些条件会失去抗酸性，出现假阴性。 检测灵敏度较低（104-105 个细菌/毫升）。,结核菌培养,传统方法：L-J固体培养基快速培养法: 检测细菌生长过程中代谢产生的CO2或消耗的O2，显微镜直接观察、变色液体培养基等 BACTEC460系统、BACTEC MGIT960系统、Bact/ALERT 3D、ESP等。,确诊结核病,1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+1份痰标本结核分枝杆菌培养 痰涂片阴性，肺部影像学检查符合活动性肺结核影像学表现+1份痰标本结核分枝杆菌培养阳性,结核菌培养临床价值,肺外结核的结核菌培养,68例手术确诊的骨结核和胸壁结核，23例手术中脓液培养出结核菌。 怀疑结核的胸水标本，结核菌培养阳性率12.2%，脑脊液标本阳性率13.8%，尿液标本阳性率10%。,太原市第四人民医院,用于耐多药结核疗效判定,治愈：（1）患者完成疗程，且在疗程的后12个月，至少最后5次痰培养（每次间隔至少30天）连续阴性。 （2）如出现1次痰培养阳性，其后痰培养（间隔至少30天）最少连续3次阴性。失败： 治疗的最后12个月，5次痰培养中有两次或两次以上阳性；或者在最后的3次，培养中有任何一次是阳性。,敏感性较直接涂片法高，理论上10-100条菌/毫升可检出阳性；特异性较直接涂片法高，可以从菌落生长速度、色素产生初步判断非结核分枝杆菌；分离出具有活力的纯培养物，为进一步药敏试验提供基础。,分离培养的优点,需时长，根据接种量的大小，一般2-8周才能得到肉眼可见菌落。结果受标本保存运送时间、培养基成分和质量、前处理方法等影响， 操作较直接涂片法复杂，需经严格培训 。需培养基凝固灭菌器、离心机、涡旋振荡器、恒温培养箱等设备。成本是直接涂片法的7-8倍。,分离培养的缺点,绝对浓度法：我国三十多年来一直沿用的药敏试验方法。 比例法：WHO耐药监测项目推荐药敏试验方法。,结核菌药敏试验,药物敏感性测定的重要意义,临床治疗的重要参考流行病学的重要指标,定义耐药结核病,MDR-TB = 菌株至少对异烟肼和利福平（最重要的一线抗结核药）耐药XDR-TB = MDR菌株加上对任意氟喹诺酮类药物、以及3种注射类二线药物中（阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素）任意一种耐药,MDR TB,XDR TB,对任意药物耐药的结核,DST是确诊耐药结核病的唯一标准,制定耐药结核病治疗方案,耐药结核病的诊断包括结核分枝杆菌病培养、菌种鉴定以及药敏试验（DST）技术。是制定耐药结核病治疗方案的重要依据。,耐药结核病DST结果的判读,异烟肼，利福平的药敏试验结果准确率最高；链霉素、乙胺丁醇、吡嗪酰胺的可靠性和重复性相对较低，综合用药史酌情参照；氨基糖苷类、多肽类和氟喹诺酮类药物可靠性较好；其他二线药物的DST结果仅供参考。,在得到纯细菌的培养物后仍需4周可报告结果，远远滞后于临床诊治的需要； 试验比较繁琐，结果受多种因素影响，可重复性较差；实验室耐药与临床耐药之间的有一定差距。,药敏试验方法局限性,分枝杆菌菌种鉴定,鉴别结核和非结核分枝杆菌 非结核分支杆菌传染性小；耐药性高。,噬菌体生物扩增法检测结核,噬菌体生物扩增法检测结核菌,噬菌体生物扩增法检测结核菌临床价值,优点：检测结果只需48小时，使快速诊断成为可能； 安全可靠，传染性小； 检测活菌，且为半定量试验，可作为治疗效果好坏的判断指标。 缺点：操作影响因素多，检测涂片阳性痰标本的敏感性29%99%，特异性52%100%。结果差异很大。有待标准化研究。,结核病实验室检查,细菌学检查,免疫学检查,分子生物学检查,涂片染色镜检分枝杆菌分离培养分支杆菌药敏试验分枝杆菌菌种鉴定噬菌体生物扩增法,生物化学检查,体液免疫学检查,细胞免疫学检查,体液免疫学检查,结核抗体测定结核抗原测定循环免疫复合物测定,结核蛋白芯片LAM、蛋白16KD、蛋白38KD,灵敏度60.2%，特异度88.2%,太原市第四人民医院,结核病体液免疫学诊断具有快速、简易的优势，但灵敏度、特异度较低，可作为辅助诊断方法。,结核病细胞免疫学检查,结核菌素皮肤试验干扰素释放试验,迟发型细胞超敏反应1）方法：1:2000 OT或PPD液0.1毫升(5单位)，左前臂屈侧中部皮内注射，4872h测量皮肤硬结的直径。,PPD试验,2）判断标准：阴性4mm弱阳性5-9mm阳性10-19mm，强阳性20mm或局部出现水泡与坏死,3)结核菌素试验的意义阴性：无结核菌感染；不能排除结核感染。阳性：曾有结核感染，并不一定现在患病。强阳性：活动性结核病可能,A、变态反应尚未建立；B、免疫抑制如应用皮质激素或营养不良等,PPD所含抗原为致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌及卡介苗菌株所共有，其结果受到卡介苗接种及其他分枝杆菌感染的影响，特异性较差。 当出现免疫功能低下时可出现假阴性结果，敏感性低。 免疫力正常的阴性有一定意义。强阳性有一定意义。有结核变态反应、淋巴结核强阳性多。 经济、简便，可以用于流行病学大规模的筛查和普查，但存在着明显的缺陷。,PPD试验临床价值,干扰素释放试验,-干扰素释放试验进行结核早期诊断的原理,人体初次感染结核菌后体内会存在致敏的淋巴细胞，当人体再次接触结核杆菌抗原后，致敏的淋巴细胞就会迅速活化为效应性淋巴细胞，并产生高水平的细胞因子，其中最重要的细胞因子为-IFN。因此高水平的-IFN可以作为诊断结核感染的一项指标。,刺激抗原：ESAT-6蛋白(早期分泌抗原靶6） 、CFP-10蛋白（培养滤液蛋白），由结核分枝杆菌特有的RD1基因编码，可刺激活化的效应T淋巴细胞产生干扰素。 RD1基因在BCG以及大部分环境分枝杆菌中缺失。,PPD皮试和-干扰素释放试验的比较,-干扰素释放试验具有和PPD皮试相似的敏感性和显著增高的特异性； 受BCG接种和环境分枝杆菌感染的影响较小； 且可重复性相对较好； 减少了医生主观因素对检测结果的影响; 故虽然检测仪器昂贵，操作相对较为复杂，但仍可视为进行结核病早期诊断的较为理想的手段。,结核病实验室检查,细菌学检查,免疫学检查,分子生物学检查,涂片染色镜检分枝杆菌分离培养分支杆菌药敏试验分枝杆菌菌种鉴定噬菌体生物扩增法,生物化学检查,体液免疫学诊断,细胞免疫学诊断,DNA测序DNA探针技术基因芯片技术DNA指纹图谱聚合酶链反应（PCR）,PCR在结核病诊断中的价值,对临床标本中的结核分枝杆菌有较高的检出率； 报告时间短； 痰涂片阳性，痰PCR多次阴性，提示可能非结核分枝杆菌； 存在假阳性、假阴性问题。 石蜡包埋组织PCR敏感性高。,胸水TB-PCR检测,灵敏度65.5%，特异度86.7%,太原市第四人民医院,其他分子生物学诊断方法,可用于对结核分枝杆菌的检测、菌种鉴定、耐药株检测；结果报告快，灵敏度、特异度高；,线性探针耐多药检测方法（HAIN）,适用范围：1、TB的诊断2、一线抗结核药物耐药诊断3、二线抗结核药物耐药的诊断4、目前，利福平（rpoB基因） 、异烟肼（Kat基因、inhA基因）耐药的诊断所需仪器设备：生安柜、超声振荡仪、PCR扩增仪、可调温振荡仪,HAIN和目前常规药敏方法比较,结核病实验室检查,细菌学检查,免疫学检查,分子生物学检查,涂片染色镜检分枝杆菌分离培养分支杆菌药敏试验分枝杆菌菌种鉴定噬菌体生物扩增法,生物化学检查,体液免疫学诊断,细胞免疫学诊断,DNA测序DNA探针技术基因芯片技术DNA指纹图谱聚合酶链反应（PCR）,腺苷脱氨酶、乳酸脱氢酶、溶菌酶、血管紧张素转化酶,腺苷脱氨酶（ADA）重症肺结核和血播结核，血ADA可以升高(正常癌性非特异性胸腹水。以高于45U/L，灵敏度特异度较高。结核性脑膜炎脑脊液中升高。一般结脑8U/L,隐脑、病脑0.6为渗出液，30g/ml，癌25U，癌25U（ACE）,结核病病理检查（可确诊结核病）,结核基本病理改变渗出 充血、水肿、白细胞浸润增殖 结核结节形成变质 干酪样坏死,增殖性病变（结核结节,结节中央：郎罕斯巨细胞（Langhans giant cell）,郎罕斯巨细胞：体积巨大，胞膜界限不清，胞质呈嗜酸性，核有几十个之多，位于胞质之边缘部,外围：类上皮细胞成层状排列和包绕周围：淋巴细胞和浆细胞分布和覆盖结节直径:为0.1至数毫米，可相互融合,肺结核病（结核结节）,胸壁结核,病理方法的病原学检查：组织抗酸染色,右膈下囊肿,石蜡包埋组织PCR检查,275例PCR检测结核分枝杆菌DNA阳性211例(76.7%)，病理诊断为结核183例(66.5%)，抗酸染色阳性23例(8.4%)。病理诊断为结核者PCR阳性率为93.4%，抗酸染色阳性者PCR阳性率95.7%。聚合酶链反应技术敏感性高、其与组织病理学相结合可以提高诊断率。,李秀武等，中国防痨杂志，2010,32（5）,石蜡包埋组织PCR检查,手术组织结核菌培养阳性、病理是结核病的20例患者，石蜡包埋组织PCR全部阳性，灵敏度100%。,太原市第四人民医院,男性，55岁