人类Y染色体SRY基因的鉴定

山东大学实验报告山东大学实验报告 2013 年 06 月 08 日 姓姓 名名 班班 级级 同组人同组人 科科 目目 遗传实验遗传实验 题题 目目 人类性别决定基因人类性别决定基因 SRYSRY 分析分析 学学 号号 201100140154201100140154 第 1 页 共 6 页 山东大学遗传实验报告 1 背景介绍背景介绍 SRY 基因又称为雄性的性别决定基因 指 Y 染色体上具体决定生物雄性性别的基 因片段 人的 SRY 基因位于 Yp11 3 只含有一个外显子 没有内含子 转录单位长约 1 1kb 编码一个 204 氨基酸的蛋白质 由于 SRY 蛋白含有一个典型的 DNA 结合结构域 高泳动类非组蛋白 high mobility group HMG 盒基序 类似于已知的转录因子 所以推测 SRY 编码一个转录 因子 SRY 的 HMG 域以一种序列特异的方式与 DNA 相结合 在双螺旋结构中引入一个 尖锐的转折 有证据显示 性反转病人 HMG 域中的突变可分为两类 影响 DNA 结合和 影响 DNA 弯曲的 提示这两种性质对于 SRY 蛋白行使转录调节功能来说都很重要 已 发现 HMG 域在体外能以高亲和力与钙调素 Calmodulin CaM 相结合 这一现象的功 能意义不明 但提示 SRY 的活性可能受另一个层次的调控 SRY 在成年小鼠生殖细胞中表达为一环状转录物 在发育中的小鼠性腺里则转录 为一个长 4 8kb 的 RNA 所用的启动子也与成年鼠不同 SRY 于大约交配后 10 5 11 天 days postcoitum dpc 的生殖嵴中专一开启 正好是两性间出现可观察的形态学 差异之前 于 12 5dpc 左右关闭 因此 SRY 的功能是启动睾丸分化而不是维持睾丸存 在 Lovell Badge 认为 SRY 起一种感受态因子的作用 因为有些小鼠虽然有 SRY 的 表达 但未能把细胞定型到雄性途径 相反在完全没有 SRY 的情况下 有时卵巢组织 也能逆转成睾丸 目前 已经在所有哺乳动物包括有袋目动物中发现了 SRY 基因 在不同的物种中 SRY 蛋白的 HMG 域高度保守 但是即使是在有亲缘关系的物种之间 SRY 蛋白的其余部 分也并不同源 还不肯定这是否意味着 HMG 域是 SRY 蛋白中唯一功能上重要的区域 Y 染色体上 95 是男性特异区域 里面含和男性有关的基因 通共有 156 个转录单 位 有 78 个编码蛋白质的基因 最后是 27 个完全不同的蛋白 约 10 的基因是近几百 万年才从 X 染色体移到 Y 染色体上来 还有 20 是更早以前来自于 X 染色体 其余是 一些回文结构 象中文诗词玩文字游戏一样 DNA 的回文也是顺过来和倒过去读都是 一样的序列 佩基等发现 Y 染色体的男性特异区域重复有回文结构 这是以前科学家 们没有预计到的 在技术上 重复结构给测序带来很多困难 在科学上 这些重复回文 结构的发现对于理解 Y 染色体有很大帮助 有研究发现 Y 染色体有许多重复回文结构的序列 并且这些重复的回文结构有 DNA 重组能力 具体说叫 基因转换 Y 染色体自己的一段和另外一段之间进行重组 这样靠自我重组来获得活力 这是第一次知道 Y 染色体在其男性特异区域有重组 以 前这段 DNA 被称为非重组区域 现在也就改名叫男性特异区域了 这个自我重组能力 山东大学实验报告山东大学实验报告 2013 年 06 月 08 日 姓姓 名名 班班 级级 同组人同组人 科科 目目 遗传实验遗传实验 题题 目目 人类性别决定基因人类性别决定基因 SRYSRY 分析分析 学学 号号 201100140154201100140154 第 2 页 共 6 页 山东大学遗传实验报告 是进化过程中 Y 用来自救的重要机制 大规模的基因转换在每一代男孩出现 而且猜 想常染色体和 X 染色体上说不定也有些区域有基因转换 给其它染色体也可能增加 活力 二 实验原理二 实验原理 本实验将通过 PCR 扩增技术 对 SRY 基因进行扩增 以此验证性别 聚合酶链反应 Polymerase Chain Reaction PCR 是体外核酸扩增技术 它具有特异 敏感 产率高 快速 简便 重复性好 易自动化等突出优 点 能在一个试管内将所要研究的目 的基因或某一 DNA 片段于数小时内扩 增至十万乃至百万倍 使肉眼能直接观 察和判断 PCR 由变性 退火 复性 延伸 三个基本反应步骤构成 模板 DNA 的 变性 模板 DNA 经加热至 94 左右一 定时间后 使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离 使之成为单链 以便它与引物结合 为下轮反应作准备 模板 DNA 与引物的退火 复性 模板 DNA 经加热变性成单链后 温度降至 40 60 左 右 引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合 引物的延伸 DNA 模板 引物结合物 在 DNA 聚合酶的作用下 于 72 左右 以 dNTP 为反应原料 靶序列为模板 按碱基 配对与半保留复制原理 合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变 性 退火 延伸三过程 就可获得更多的 半保留复制链 而且这种新链又可成为下 次循环的模板 每完成一个循环需 2 4 分钟 2 3 小时就能将待扩目的基因扩增放 大几百万倍 琼脂糖凝胶电泳是利用不同分子量的 DNA 在琼脂糖凝胶电厂中电泳速度不同而分 离 DNA 片段的方法 琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它们的相对分子质量 及分子构型 同时与凝胶的浓度也有密切关系 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电 荷效应和分子筛效应 DNA 分子在高于等电点的 pH 溶液中带负电荷 在电场中向正极 移动 在一定的电场强度下 DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应 即 DNA 分子本 身的大小和构型 在凝胶中 DNA 片段 小于 20kb 迁移距离 迁移率 与碱基对的对 山东大学实验报告山东大学实验报告 2013 年 06 月 08 日 姓姓 名名 班班 级级 同组人同组人 科科 目目 遗传实验遗传实验 题题 目目 人类性别决定基因人类性别决定基因 SRYSRY 分析分析 学学 号号 201100140154201100140154 第 3 页 共 6 页 山东大学遗传实验报告 数成反比 因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较 便可测出未知片段的大小 此法以观测 灵敏度较高 而且 DNA 可以切胶回收 是现 在 PCR 反应后最常用的实验方法 唯一美中不足的是所需要的染剂 EB 是一种剧毒物质 会引起多种病症的产生 因而在使用中一定需要多加注意 三 实验目的三 实验目的 1 了解性别决定的 SRY 分子机制 2 掌握口腔上皮细胞和毛囊细胞基因组 DNA 提取的方法 3 掌握 PCR 反应的基本原理 4 掌握琼脂糖凝胶电泳法对于条带的鉴定 四 实验材料 试剂及仪器四 实验材料 试剂及仪器 1 实验材料 男性的口腔上皮细胞及头发毛囊细胞 女性的口腔上皮细胞及头发毛囊细胞 2 实验试剂 DNA 提取液 0 2mol L NaOH 溶液 0 04mol L HCl 溶液 10XPCR 缓冲液 25mmol L MgCl2 2 5mmol L dNTP 10umol L SRY 引物 1 10umol L SRY 引物 2 5 U l Taq 酶溶液 无菌水 琼脂糖 缓冲液 3 仪器 PCR 仪 电泳仪 离心机 紫外投影机 五 实验步骤五 实验步骤 1 口腔粘膜上皮细胞或毛发样品 DNA 的制备 1 男生口腔粘膜上皮细胞或毛发数根 女生口腔粘膜上皮细胞或毛发数根作为对照 2 剪下带毛囊的发根部分 放入一个 200ul PCR 管 加 20 l 的 0 2mol L NaOH 溶 液 75 温育 30min 在有热盖的 PCR 仪中反应 以避免水分蒸发 山东大学实验报告山东大学实验报告 2013 年 06 月 08 日 姓姓 名名 班班 级级 同组人同组人 科科 目目 遗传实验遗传实验 题题 目目 人类性别决定基因人类性别决定基因 SRYSRY 分析分析 学学 号号 201100140154201100140154 第 4 页 共 6 页 山东大学遗传实验报告 3 加入 100 l 的 0 04 mol L HCl 中和 4 12000 r min 离心 5min 去除未溶解的沉淀物 上清转入 1 个新管 DNA 就在水 溶液中 2 PCR 反应 1 扩增人的 SRY 基因 所用引物为 SRY1 5 TGG GAC TGG TGA CAA TTG TC 3 SRY2 5 GAG TAC AGG TGT GCA GCT CT 3 2 每个样品反应体系为 25 l 首先将下列成分预混 再分装为 4 个管 分装到 4 只 0 2 ml PCR 管中 19 l 管 其中两管分别加入 6 l 男生口腔上皮细胞和头发毛囊细胞 DNA 另两管加入 6 l 女 生口腔上皮细胞和头发毛囊细胞 DNA 反应体系配好后 就可以放入 PCR 仪中扩增 扩增程序如下 3 PCR 反应条件为 94 3min 94 30s 50 30s 循环 35 次 72 30s 试剂名称试剂量 PCR 缓冲液 10 0 ul MgCl2 25mM 8 0 ul dNTP 2 5mM 8 0 ul SRT 引物 1 10uM 4 0 ul SRT 引物 2 10uM 4 0 ul Taq 酶 2 0 ul 灭菌水 40 ul 山东大学实验报告山东大学实验报告 2013 年 06 月 08 日 姓姓 名名 班班 级级 同组人同组人 科科 目目 遗传实验遗传实验 题题 目目 人类性别决定基因人类性别决定基因 SRYSRY 分析分析 学学 号号 201100140154201100140154 第 5 页 共 6 页 山东大学遗传实验报告 72 5min 10 3 电泳检测 制备 1 的琼脂糖凝胶 取 15 l PCR 产物 加 3ul 的 loading buffer 混匀 点样 同时点 DNA 分子量标记 在 5V cm 的电压下电泳 电泳结束后 用荧光染料溴乙 锭 EB 染色 紫外光下观察 DNA 条带 用凝胶成像系统输出照片 并进行有关的数据 分析 六 实验结果及分析六 实验结果及分析 全班共跑了两块胶 可以看到上方的胶没有跑出来 连 marker 都没有跑出来 第二块儿胶由图可知三号和第七号样品出现条带 经验证 分别为徐霖和吴宏宇 都 为男生 一号和五号也为男生但却没有带 可以看到 四号和六号为女生也是没有带 的 图中 SRY 基因大小在 300bp 左右 与 DNA Marker 对照可以看见很浅的条带 位于 白色圈内 山东大学实验报告山东大学实验报告 2013 年 06 月 08 日 姓姓 名名 班班 级级 同组人同组人 科科 目目 遗传实验遗传实验 题题 目目 人类性别决定基因人类性别决定基因 SRYSRY 分析分析 学学 号号 201100140154201100140154 第 6 页 共 6 页 山东大学遗传实验报告 七 思考与讨论七 思考与讨论 1 上方的胶没有跑出带 原因较复杂 可能是由于 P