产纤维素酶菌种的筛选与优化.doc

目 录实验一 产纤维素酶菌种的分离与初筛实验二 产纤维素酶菌种的复筛与保藏实验三 酶活测定与传代保藏实验四 产纤维素酶菌种的紫外诱变育种实验五 产纤维素酶菌种的产酶条件优化实验六 产纤维素酶菌种的产酶条件优化的结果分析实验一 产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定一、实验目的 1了解产纤维素酶微生物分离的基本原理； 2掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法。二、实验原理 自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。这些生物与绿色植物一起构成了这个世界的碳循环。在发酵堆肥中，存在着大量的，耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分解，菌种需要：1. 内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），也称Cx酶、CMC酶、EG。这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素；2. 外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4-D-glucanase,EC3.2.1.91），也称C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶（Cellobiohydrolase,简称CBH）,这类酶从纤维素长链的非还原性末端水解-1,4-糖苷键，每次切下纤维二糖分子；3. -葡萄糖苷酶（-glucosidase，EC3.2.21，简称BG）又称纤维二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生产葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快。随着葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。只有三种酶的协同作用，才能较好的分解纤维素。就单菌落而言，霉菌如木霉、曲霉和青霉的总体酶活性较高，产量大，故在畜牧业和饲料工业中的应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。本实验以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基，只有能够水解纤维素成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长，利用筛选培养基分离产纤维素酶的微生物。以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为唯一碳源，通过微生物分解利用CMC-Na，分离出能产纤维素酶的菌种； 刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色复合物。三、实验仪器及试剂1材料 土样 取自学校校门口小树林520cm深处； 2仪器 试管、烧杯、移液管、平板、锥形瓶、玻璃珠、电磁炉、电子称、量筒、培养皿、酒精灯、移液枪、接种环、高压灭菌锅等； 3培养基 （1）筛选培养基（500ml） CMC-Na 10g、(NH4)2SO4 1.4 g、MgSO4 0.3g KH2PO4 2g、MnSO4 1.6mg、FeSO4 5mg ZnSO4 2.5mg、CoCl2 2.0mg 琼脂20g PH7.0 （2）保藏培养基（500ml） CMC-Na 15g、MgSO4 0.5g、K2HPO4 1.5g、酵母粉10g NaCl 5g、蛋白胨15g、琼脂20g、刚果红 PH7.0四、实验步骤1.土样采集 取自学校校门口小树林520cm深处；2.实验器材灭菌：平板、移液管的包扎及灭菌；3.无菌水的制备： 量取99ml自来水于250ml锥形瓶中，并放入适量颗玻璃窗珠，塞上棉塞，用牛皮纸包扎，于121?C条件下灭菌20min备用。 量取9ml自来水于试管中，用试管塞塞好，用牛皮纸包扎，于121?C条件下灭菌20min备用。4筛选培养基配制及倒平板：准确按筛选培养基配方称取各物质溶于1000ml蒸馏水中，调节pH7.0。在高压来菌锅中于121?C高温灭菌20min，取出于无菌环境旧倒平板备用。5保藏培养基配制及摆斜面：准确按筛选培养基配方称取各物质溶于1000ml蒸馏水中，调节pH7.0。分装试管中，在高压来菌锅中于121?C高温灭菌20min，取出摆斜面备用。6.土样预处理及梯度稀释 （1）样品菌悬液的制备 先取1g样品，加入到99ml含有玻璃珠的无菌水中，震荡几分钟形成悬液。 （2）梯度稀释： 在无菌条件下，用灭好菌的移液管取1ml到装有9ml无菌水的试管中，依次稀释10 -3、10-4、 10-5、 10-6的梯度备用7.倒平板涂布 分别取10-4、 10-5、 10-6三个浓度的菌悬液接种到倒好了的平板中，并涂布均匀 8.培养、观察、记录实验二 产纤维素酶菌种的筛选与保藏一、实验目的 1掌握平板接斜面的操作； 2掌握筛选原则与选择方法。二、实验原理 刚果红能和纤维素结合，纤维素酶能水解纤维素，从而使刚果红在产纤维素酶菌株周围结合到纤维素而形成透明圈，从而选择目标菌落。微生物繁衍具有容易变异的特性，同时微生物的生长一般离不开生长所需的营养、水分、氧气及环境温度等，在营养缺乏、干燥、隔绝空气、温度低等条件下均可使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态而便于保存微生物的特性。利用微生物的纯培养以确定分离所得的最佳产酶微生物，并进行保存与进一步研究。通过酶活测定确定初筛菌株的产酶性能；通过培养条件的控制而菌种休眠实现保藏。三、实验仪器及试剂1菌种 借用实验室的菌种；2仪器 试管、烧杯、电磁炉、电子称、量筒、培养皿、酒精灯、移液枪、接种环、旋转式摇床等；3培养基 摇瓶培养基 CMC-Na10g、(NH4)2SO44.0g、MgSO47H2O 0.5g、K2HPO4 1.5g、牛肉膏2g、蛋白胨4g（PH自然 定容到1L）四、实验步骤1.在分离产植酸酶黑曲霉的平板上，选择透明圈明显、透明圈直径与菌落直径比值较大的，分离效果最好的单菌落，并做好标记；2.左手拿平板，右手拿接种环，先将金属环烧灼灭菌，再将接种环在空白培养基处冷却，挑取菌落，在火焰旁稍等片刻。3.左手将平板放下，拿起斜面培养基。在火焰旁用右手小指和手掌边缘拔下棉塞并夹紧，迅速将接种环伸入空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接于其上。划线时由底部向上划一直线，一直划到斜面的顶部。4.灼烧试管口，在火焰旁将棉塞塞上，接种完毕，接种环上的余菌必须灼烧灭菌后才能放下。5.培养：倒置于28至30oC恒温箱中，培养3-7d观察结果。实验三 酶活测定与传代保藏一、实验目的 1了解纤维素酶总酶活测定原理；2.掌握纤维素酶活力检测方法； 3学习传代保藏的操作方法。二、实验原理纤维素酶在合适的条件下可以分解纤维素，产生葡萄糖等还原糖，与3,5-二硝基水杨酸显色剂（DNS）作用，可生成橙黄色络物。使用终止反应法，是在恒温反应体系中，每隔一定时间，取出一定体积的反应液，用强酸或强碱或SDS以及加热等使反应立即停止，然后用化学方法放射性化学法或酶偶联法分析产物的形成或底物的消耗量。这是最经典的的酶活力测定方法，几乎所有的酶都可以根据这一原理设计出具体的测定方法。本实验使用强碱终止分解反应，通过DNS法进行吸光度的测定。根据相应的标准曲线，运用比色法可以推算出反应液中葡萄糖的生成量，进而推算出酶的活力。酶活的定义：在37oC PH5.5的条件下60min水浴，每分钟释放出1umol的单糖为一个酶活单位。 三、实验仪器及试剂1.筛选到的菌种 2仪器：试管、烧杯、电磁炉、电子称、量筒、培养皿、酒精灯、移液枪、接种环、旋转式摇床、分光光度计、恒温水槽、滤纸等； 3试剂：柠檬酸、柠檬酸钠、柠檬酸缓冲液、葡萄糖、DNS等四、实验步骤将筛选到的菌种接入摇瓶，37、200转/分下培养3d，制成种子液，取1ml的接种量接入第二次摇瓶培养基中7、200转/分下培养。纤维素酶原酶液的制备方法：取培养液3ml8000r/min离心10min，上清液即为粗酶液。取1ml粗酶液，加9LPH5.0柠檬酸缓冲液，即为稀释10倍原酶液。1.纤维素酶的测定还原糖的测定为DNS试剂法，540nm处有紫外光大光吸收峰，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度比例关系，利用比色法测定其还原糖生成量就可测定纤维素酶的活力。（1）纤维素酶活德尔测定 A按下表比例稀释成不同葡萄糖浓度溶液。标准序号葡萄糖标准溶液/ml蒸馏水/mlDNS/mlOD540nm0012.010.10.92.020.20.82.030.30.72.040.40.62.050.50.52.060.60.42.070.70.32.080.80.2 2.0 B显色反应：在上述试管中分别加入DNS试剂2.0ml，于沸水浴中加热5min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定吸光值。以葡萄糖含量（mg/ml）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。（2）滤纸酶活性（FPA）测定 取干净的10ml刻度试管若干，各加入0.5ml稀释10倍的粗酶液和0.5ml0.05mol/L，PH5.0的柠檬酸缓冲液，向对照管中加入0.5mlDNS溶液终止反应。将试管先在50水浴中预热10min，在各加入滤纸条50mg，50水浴中保温60min后取出，立即向上述试管中分别加入DNS试剂2.0ml，于沸水浴中加热5min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定吸光值。以上酶活测定时间均扣除发酵液中的还原糖后计算，采用国际单位即在上述条件下1min产生1umol葡萄糖为一个活力单位（IU/ml）。2.菌种传代保藏将菌种接种到在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2-8的冰箱保藏。保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2-4个月，移种一次。此法为实验室和工厂军追踪室常用的保藏方法，优点是操作简便，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理。化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状，污染杂菌的机会也会较多。实验四 产纤维素酶菌种的紫外诱变育种一、实验目的 1了解紫外诱变育种的原理； 2掌握紫外诱变育种的操作方法。二、实验原理诱变育种是指用物理。化学因素诱导动植物的遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求的单株/个体，进而培育成新的品种或种质的育种方法。它是继选择育种和杂交育种之后发展起来的一项现代育种技术。常规杂交育种基本上是染色体的重新组合，这种技术一般并不引起染色体发生变异，更难以触及到基因。当通过辐射将能量传递到生物体内时，生物体内各种分子便产生电离和激发，接着产生许多化学性质十分活跃的自由原子或自由基团。它们继续相互反应，并与其周围物质特别是大分子核酸和蛋白质反应，引起分子结构的改变。由此又影响到细胞内的一些生化过程，如DNA合成的终止、各种酶活性的改变等，使个部分结构进一步深刻变化，其中尤其重要的是染色体损伤。由于染色体断裂和重接而产生的染色体结构和数目变异即染色体突变，而DNA分子结构中碱基的变化则造成基因突变。那些带有染色体突变或基因突变的细胞，经过细胞世代将变异了的遗传物质传至性细胞或无性繁殖器官，即可产生生物体的遗传变异。获得不可控的突变性状，进而筛选出目的单个/个体。本实验以紫外线作为诱变剂，通过紫外线照射，使菌种基因发生突变，然后从变异的菌种中选取功能符合要求的菌种，进行培养，得到我们所需的菌种。三、实验仪器及试剂1.筛选得到的产纤维素酶菌种 2电子称、量筒、培养皿、酒精灯、移液枪、接种环、玻璃棒、磁钢、高压灭菌锅、超净工作台、恒温箱等； 3试剂 CMC-Na 20g 、(NH4)2SO4 2.0g 、MgSO47H2O0.5g 、K2HPO4 1.0g刚果红0.4 g 、琼脂20g （ PH自然 定容到1L）生理盐水四、实验步骤10ml无菌蒸馏水，用无菌刮铲轻轻刮下成熟孢子，取1ml孢子悬液进行梯度稀释至10-4，各取0.05ml涂布于筛选培养基平板表面，除对照组外垂直置于20W紫外灯下，20cm距离，照射时间分别为30s、60s、90s、120s、150s、180s、210s、240s，照射后，置于上述步骤所得的最佳条件下避光3-4d。1.致死率的研究选取酶活最高的菌株A1，对其进行紫外诱变，并与对照组参比计算致死率。并测定CMC光圈与最佳条件酶活验证突变效果，产酶量高于出发菌株10%为正突变，低于出发菌株10%为负突变。2.菌株稳定性的研究照射时间s致死率%正突变率%照射时间s致死率%正突变率%03015060180902101202403.刚果红平板染色将在32条件下CMC平板上培养两天的菌种（A1）取出，等菌种长出来后，把菌体刮离，然后加入刚果红染色60分钟，再用生理盐水冲洗4-6次，产生透明圈的就是能水解纤维素的菌。透明圈的大小说明了CMC分解酶（1,4-葡萄糖苷酶）酶活力的大小。4.菌种鉴定 将纯化后的菌种接入察氏培养基37条件下培养，使用插法通过棉兰染色观察孢子、菌丝与孢子囊结构。同时根据观察筛选得到的菌株在培养基上菌落的形态、颜色、气味、菌丝粗细、生长密度等对照真菌鉴定手册筛选得到的菌株做出形态学初步鉴定。 实验五 产纤维素酶菌种的产酶条件优化一、实验目的 1掌握菌种条件优化的原理； 2掌握产纤维素酶菌种的产酶条件优化的方法。二、实验原理发酵产酶过程中，培养基中的碳源、氮源作为菌种生长的必须元素同时也是纤维素酶的骨架。金属离子影响到产酶代谢及纤维素酶的活性中心，发酵温度、时间、PH等影响到产酶代谢从而影响到产酶。以酶活为指标，通过单因子实验及正交实验，确定各因素对产酶影响的大小及最佳发酵产酶条件。三、实验仪器及试剂 1菌种 产纤维素酶正交突变株种子液； 2仪器 试管、烧杯、移液枪、量筒、电子称、电磁炉、培养皿、酒精灯、接种环、高压蒸汽灭菌锅、旋转式摇床等； 3试剂材料 CMC-Na10g、(NH4)2SO44.0g、牛肉膏5g、 K2HPO4 2g 、MgSO47H2O 0.5g、蛋白胨10g（PH自然 定容到1L） 麦芽糖、甘油、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖MgSO4、FeSO4、CaCl2、ZnSO4、CoCl2、MnO4、NaOH、HCl四、实验步骤1.菌种活化及摇瓶种子制作 将保藏的菌种接种到斜面培养基上面，在30培养箱中活化24h，然后接种到装有100ml种子培养基的500ml三角瓶中，在30，150r/min培养2d至对数生长期后，然后接种至相应的发酵瓶中进行产酶发酵研究。2.产酶培养基选择 在控制培养基初始PH值为7.0，接种量为10%，温度为30，摇床转速为150r/min的条件下，发酵3d取样测定酶活，考擦培养基中单因素对产酶的影响，并使用正交试验来优化发酵产酶培养基配方。3.碳源的选择将发酵基础培养基的其他成分不变，分别用等量的麦芽糖、甘油、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖代替葡萄糖作为碳源，进行摇瓶发酵，检测酶活，确定最佳碳源。在确定最佳碳源后，将其作为唯一碳源，改变其加入量为0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%,3.0%,进行摇瓶发酵，取样测定酶活，确定最佳碳源浓度。4.氮源的选择将发酵培养基的其他成分不变，分别用等量的牛肉膏、蛋白胨、玉米浆干粉、硫酸铵、尿素代替酵母膏作为氮源，进行摇瓶发酵，检测酶活，确定最佳氮源。在确定最佳氮源后，将其作为唯一氮源，改变其加入量为0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%,3.0%,进行摇瓶发酵，取样测定酶活，确定最佳氮源浓度。5.无机盐的选择 在确定最佳碳源和最佳氮源及相应浓度的基础上，在发酵培养基中分别单独添加不同的无机盐如表所示，发酵后检测酶活以确定最佳的无机盐。金属盐浓度MgSO40.02FeSO40.02CaCl20.02ZnSO40.05CoCl20.05MnO40.056.正交实验对发酵产酶培养基的优化 在明确了碳源。氮源及无机盐的单因子实验结果的基础上，选择对发酵产酶影响较大的因素进行3因素3水平的正交实验，确定各因素的影响大小和最佳条件，优化发酵培养基各组分的含量。7.产酶发酵条件选择在优化了产酶发酵培养基的基础上，以初始PH为7.0，温度为30，摇床转速150r/min，装液量20%，接种量10%，发酵时间3d为基础发酵条件，单独改变发酵培养的初始PH、培养温度、摇床转速、培养时间、等影响因素，进行发酵培养，通过测定不同因素各条件下的酶活，并根据检测结果，确定影响较大的几个因素，设计正交实验，来优化产酶发酵条件。8.发酵产酶的培养基初始PH选择 用10%氢氧化钠及10%盐酸调节发酵培养基初始PH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，接种后进行摇瓶产酶发酵，取样测定酶活。9.发酵产酶的温度选择分别在22、26、30、34、38、42下进行菌株发酵产酶，接种后进行摇瓶产酶发酵，取样测定酶活。10.发酵产酶的摇床转速选择 分别以70 r/min 、110 r/min、 150 r/min 、190 r/min、 230 r/min、 270 r/min的转速，接种后进行摇瓶产酶发酵，取样测定酶活。11.发酵产酶接种量的选择 分别采用2%、4%、6%、8%、10%的接种量，接种后进行摇瓶产酶发酵，取样测定酶活。12.装液量对发酵产酶的影响 分别以10%、20%、30%、40%、50%的装液量，接种后进行摇瓶产酶发酵，取样测定酶活。13.发酵产酶的发酵时间选择及其与菌体生长的关系 从接种发酵第6h起，每隔6h，取样一次酶活和生物量，知道发酵96h结束。实验六 结果分析、正交分析一、实验目的 1了解正交分析的方法； 2根据以上实验数据进行结果分析。二、实验原理正交试验设计（orthogonal experimental design）是研究多因