丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌体外混合培养对肠道致病菌的影响

丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌体外混合培养对肠道致病菌的影响 摘要 本试验研究了丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌混合培养对肠道中沙门氏菌 金黄色葡萄球 菌 产气荚膜梭菌和大肠杆菌 4 种致病菌的影响 结果表明 丁酸梭菌对这 4 种菌均有明 显的抑制作用 可使其菌落数下降 3 5 个数量级 鼠李糖乳杆菌可降低产气荚膜梭菌 沙 门氏菌菌落数 丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌混合培养可使 4 种致病菌菌落数均下降 3 4 个数 量级 由此可见 两种菌混合培养对 4 种病原微生物的抑制无协同作用 关键词 丁酸梭菌 鼠李糖乳杆菌 混合培养 肠道致病菌 Abstract This experiment was conducted to study the effects of the mixed culture of Clostridium butyricum and Lac tobacillus rhamnosus on intestinal pathogens including Salmonella gallinarum Staphylococcus aureus Clostridium perfrin gens and Escherichia coli The results showed that the Clostridium butyricum significantly inhibited the number of these four types of bacteria and made them down 3 5 orders of magnitude Lactobacillus rhamnosus reduced Clostridium per fringens Salmonella gallinarum colonies the mixed culture of Clostridium butyricum and Lactobacillus rhamnosus made four kinds of bacteria down 3 4 orders of magnitude The results indicated that the mixed culture of strains had no syner gistic inhibition effect on the four kinds of pathogenic microorganisms Key words Clostridium butyricum Lactobacillus rhamnosus mixed culture enteric pathogens 丁酸梭菌属于梭菌属 是一种专性厌氧的革 兰氏阳性芽孢杆菌 其广泛分布于土壤 也能从 健康动物的肠道中分离出来 丁酸梭菌适合动物 的肠道厌氧环境 呼慧娟等 2011 可以控制消 化道紊乱 张晓阳等 2012 有效抑制有害菌 曹 广添等 2012 鼠李糖乳杆菌属于乳杆菌 具有 较强的酸及胆碱耐受能力 王玉华等 2008 有 抑制有害菌的作用 吴光伟和韩建春 2009 具 有抗氧化活性 并且可以影响机体免疫功能 目 前丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌均被广泛用作饲料 添加剂 本试验研究了丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌 联合培养对产气荚膜梭菌 金黄色葡萄球菌 沙 门氏菌 大肠杆菌的抑制作用 为微生物制剂联 和使用提供理论依据 1 材料与方法 1 1 试验材料 1 1 1 菌种 试剂及培养基 丁酸梭菌 Clostridi um butyricum HJCB998 由浙江惠嘉生物科技有 限公司提供 鼠李糖乳杆菌 Lactobacillus rhamno sus ATCC7469 产气荚膜梭菌 Clostridi um per fringens ATCC13124 均由广东省微生物菌种保 藏中心提供 大肠杆菌 C83928 Escherichia coli C83928 沙门氏菌 Salmonella gallinarum C79 金 黄 色 葡 萄 球 菌 Staphylococcus aureaus SHZ018 均由浙江大学动物科学学院研究室提 供 琼脂 氯化钠为分析纯 厌氧液体培养基 LB 液体培养基 LB 琼脂培养基 强化梭菌培养基 RCM DRCA 梭菌选择性培养基 伊红美蓝培养 基 EMB 乳酸细菌培养基 MRS BP 培养基 HE 培养基 SC 培养基 均购自北京陆桥生物科技 有限公司 1 1 2 主要仪器与设备 厌氧培养箱 灭菌锅 恒 温培养箱 培养皿 超净工作台 试管 接种环等 1 2 试验方法 1 2 1 菌种活化 丁酸梭菌活化 将冻干管保藏 菌株接种于装有梭菌液体培养基的试管中 置于 厌氧培养基中 37 静止厌氧培养 48 h 取 0 1 mL 转接装有 9 9 mL 厌氧液体培养基的试管 厌氧静 止培养 16 h 产气荚膜梭菌及鼠李糖乳杆菌活化 在超净 台内 取一定量的无菌水迅速加入打开的冻干管 轻轻将菌粉混匀溶解 然后将菌液分别转接 LB 斜面及厌氧液体培养基 置 37 厌氧培养 48 h 后 取 1 环菌种接种于装有 9 9 mL 厌氧液体培养 基的试管 厌氧静止培养 16 h 1 2 2 培养物的制备 将活化好的 0 1 mL 丁酸 梭菌 鼠李糖乳杆菌 产气荚膜梭菌 金黄色葡萄 球菌 大肠杆菌 沙门氏菌分别接种于装有 9 9 mL 厌氧液体培养基的试管 丁酸梭菌 鼠李糖乳杆 菌 产气荚膜梭菌均于 37 厌氧静止培养 24 h 其余肠道致病菌普通培养 16 h 并分别计数 1 2 3 混合培养 取 16 个装有 19 9 mL 厌氧液 体培养基的三角瓶 将活化的菌液稀释到 10 4 10 5 cfu mL 分组混合 1 丁酸梭菌与大肠杆菌按 浓度 100 1 比例混合接种到三角瓶中 2 鼠李糖 乳杆菌 大肠杆菌按浓度 100 1 比例混合接种到 三角瓶中 3 丁酸梭菌 鼠李糖乳杆菌及大肠杆 菌按浓度 100 100 1 比例接种至三角瓶中 4 将 等量的大肠杆菌接种于三角瓶中作为对照 随后 置厌氧培养箱中 37 恒温静止培养 活菌计数方法 分别在培养的 0 4 8 12 24 36 48 72 h 取各组培养物样本 检测试验组与对 照组中各致病菌的数量 cfu mL 并与单独培养 进行对比 采用稀释平板计数法 将待测菌液摇 匀 每组分别取 0 1 mL 样品进行 10 倍连续稀释 选取适当稀释度的菌悬液 0 1 mL 分别滴加在伊 红美蓝选择性培养基平板上 每个稀释度 3 个重 复 置 37 培养 48 h 后 计算其菌数后取平均值 三个平板菌落总数 3 10 稀释倍数 由于丁酸 梭菌 鼠李糖乳杆菌是严格厌氧菌 在有氧情况下 无法长出 计数结果为准确的致病菌菌数 丁酸梭菌和鼠李糖乳杆菌对产气荚膜梭菌 金黄色葡萄球菌 沙门氏菌的体外生物拮抗作用 研究方法同上 选用的计数培养基分别为 SC 培 养基 BP 培养基 HE 培养基 2 结果与分析 2 1 丁酸梭菌和鼠李糖乳杆菌 对沙门氏菌 的体 外生物拮抗作用 从图 1 可以看出 培养 12 h 时 丁酸梭菌培养组沙门氏菌数量比沙门氏菌单 独培养有明显下降趋势 菌落数差别达 2 个数量 级 24 h 后菌落数差别达 4 5 个数量级 鼠李糖 乳杆菌对沙门氏菌的抑制作用从 24 h 开始比较 明显 菌落数差别为 1 2 个数量级 丁酸梭菌与 鼠李糖乳杆菌混合培养时 沙门氏菌菌落数从 12 h 开始明显下降 24 h 后菌落数差别达 3 4 个数量级 可见 两种菌联合培养对沙门氏菌的抑 制无协同作用 2 2 丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌 对金黄色葡萄球 菌的体外生物拮抗作用 从图 2 可以看出 丁酸 梭菌可以明显抑制金黄色葡萄球菌 从 12 h 开 始 其菌落数比金黄色葡萄球菌单独培养时下降 2 4 个数量级 鼠李糖乳杆菌对金黄色葡萄球菌 无明显抑制作用 丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌混合 培养时 从 12 h 开始 金黄色葡萄球菌菌落数下 降 2 3 个数量级 两菌株混合培养对金黄色葡 萄球菌的抑制无协同作用 时间 h 金 黄 色 葡 萄 球 菌 数 量 l g c f u 图 2 丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌对 金黄色葡萄球菌的体外生物拮抗作用 沙 门 氏 菌 数 量 l g c f u 图 1 丁酸梭菌和鼠李糖乳杆菌对 沙门氏菌的体外生物拮抗作用 时间 h 0481224364872 7 9 3 5 沙门氏菌 丁酸梭菌 鼠李糖乳杆菌 沙门氏菌 丁酸梭菌 沙门氏菌 鼠李糖乳杆菌 沙门氏菌 0481224364872 7 9 3 5 金黄色葡萄球菌 丁酸梭菌 鼠李糖乳杆菌 金黄色葡萄球菌 丁酸梭菌 金黄色葡萄球菌 鼠李糖乳杆菌 金黄色葡萄球菌 102013 年第 21 期中国饲料 2 3 丁酸梭菌与 鼠李 糖乳杆菌 对产 气荚膜梭菌 的体外生物拮抗作用 从图 3 可以看出 丁酸梭 菌对产气荚膜梭菌抑制作用明显 从 8 h 开始 可 使菌落数下降 2 5 个数量级 在 36 h 时抑菌效 果最明显 鼠李糖乳杆菌单独作用于产气荚膜梭 菌时 从 12 h 开始 可使其菌落数下降 2 个数量 级以上 两菌株联合培养对产气荚膜梭菌的抑制 作用在 24 48 h 时低于丁酸梭菌单独培养 其 他时间无显著差异 2 4 丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌对大肠杆菌的体外 生物拮抗作用 从图 4 可以看出 丁酸梭菌能明显 抑制大肠杆菌 从 8 h 开始 其菌落数比大肠杆菌 单独培养时低 3 4 个数量级 鼠李糖乳杆菌对大 肠杆菌无明显抑制作用 丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌 混合培养时 可以使大肠杆菌菌落数降低 3 4 个 数量级 并且抑菌曲线和丁酸梭菌大体一致 表明 两菌株混合培养对大肠杆菌的抑制无协同作用 3 讨论 丁酸梭菌是肠道正常微生物 可以调节肠道 菌群 抑制肠道有害菌 研究表明 丁酸梭菌可以 对大肠杆菌 沙门氏菌 产气荚膜梭菌均产生抑制 作用 曹广添 等 2012 Yang 等 2012 Cao 等 2012 降低产气荚膜梭菌在微生物群体中的比例 Kong 等 2011 丁酸梭菌可以产生有机酸降低 肠道 pH 从而抑制有害菌的生长 张晓阳等 2012 同时丁酸梭菌及其脂磷壁酸也可以抑制有 害菌在细胞上的附着 Gao 等 2012 另外丁酸梭 菌可以减轻艰难梭菌毒素蛋白的毒力并且降低该 菌的数量 Woo 等 2011 本试验表明 丁酸梭菌 对产气荚膜梭菌 金黄色葡萄球菌 沙门氏菌 大 肠杆菌的生长均有明显的抑制作用 已有研究表 明丁酸梭菌通过产生丁酸 乙酸等短链脂肪酸 产 生细菌素 以及对营养物质黏附位点的竞争等途 径来抑制有害菌 张晓阳等 2012 Gao 等 2012 鼠李糖乳杆菌具有很好的黏附性和抑菌性 Mack 等 1999 研究表明 鼠李糖乳杆菌可以体外 抑制大肠杆菌 除此之外 鼠李糖乳杆菌对志贺氏 菌 沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 枯草杆菌 鸡白痢 沙门菌 肠杆菌 肠球菌等有害菌均有一定的抑制 作用 刘冬梅等 2005 魏华等 2001 刘冬梅等 2006 研究表明 鼠李糖乳杆菌可以有效抑制有 害菌 其抑菌原因主要是产生了乳酸 改变了肠道 酸性环境 对有害菌产生抑制作用 本试验表明 鼠李糖乳杆菌可显著抑制沙门氏菌和产气荚膜梭 菌 而对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌无明显抑制 作用 这与之前研究结果略有不同 其原因有待进 一步研究 随着益生菌制剂在畜牧生产中的大量应用 单一益生菌应用效果的局限性也慢慢表现出来 因此几种益生菌的联合发酵和联合使用成为益生 菌制剂发展的新趋势 冯树和张忠泽 1990 Stadie 等 2013 研究表明 乳酸菌与酵母菌混合 培养 酵母菌释放精氨酸有助于乳酸菌生长 双歧 杆菌与嗜酸乳杆菌混合培养时可加快产酸 双歧 杆菌可促进嗜酸乳杆菌增殖 张香美等 1999 丁 酸梭菌 肠膜芽孢杆菌 粪肠球菌三种菌的无细胞 上清液彼此之间均有促进生长作用 薛胜平等 2008 丁酸梭菌与双歧杆菌体外共培养可以明显 抑制大肠埃希杆菌 O157 痢疾杆菌 F2a 伤寒杆 菌 艰难梭菌及产气荚膜梭菌的生长 吕存女等 2011a b 丁酸梭菌和婴儿型双歧杆菌对霍乱孤 菌有拮抗作用 并且其主要拮抗作用是由丁酸梭 菌引起的 陆俭等 2000 本试验结果也表明 丁 酸梭菌和鼠李糖乳杆菌联合培养时对产气荚膜梭 菌 沙门氏菌 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌均显示 出较强的生物拮抗作用 其中起主要作用的是丁 酸梭菌 4 结论 本试验结果表明 丁酸梭菌对产气荚膜梭菌 产 气 荚 膜 梭 菌 l g c f u 图 3 丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌对 产气荚膜梭菌的体外生物拮抗作用 时间 h 图 4 丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌对 大肠杆菌的体外生物拮抗作用 0481224364872 8 10 时间 h 大 肠 杆 菌 数 量 l g c f u 4 6 大肠杆菌 丁酸梭菌 鼠李糖乳 杆菌 大肠杆菌 丁酸梭菌 大肠杆菌 鼠李糖乳杆菌 大肠杆菌 0481224364872 8 10 4 6 2 产气荚膜梭菌 丁酸梭菌 鼠李糖乳杆菌 产气荚膜梭菌 丁酸梭菌 产气荚膜梭菌 鼠李糖乳杆菌 产气荚膜梭菌 11 中国饲料 2013 年第 21 期 上接第 8 页 29 Joo S T Lee J I Ha Y L et al Effects of dietary conjugated linoleic acid on fatty acid composition lipid oxidation color and water holding capacity of pork loin J Anim Sci 2002 80 1 108 112 30 Karin N Klaus F Gerd N et al Effects of dietary olive and linseed oil on lipid composition meat quality sensory characteristics and muscle structure in pigs J Meat Science 2005 70 63 74 31 Loughmiller J A Nelssen J L Goodb et al Influence of dietary total sulfur amino acids and methionine on growth performance and carcass characteristics of finishing gilts J J Anim Sci 1998 76 8 2129 2134 32 Mahan D C Cline T R Richert B Effects of dietary level of selenium enriched yeast and sodium selenite as selenium sources fed to growing finish ing pigs on performance characteristics and loin quality J J Anim Sci 1999 77 8 2172 2179 33 Matthews J O Higbie A D Southern L I et al Effect of chromium propi onate and metabolizable energy on growth carcass traits and pork quality of growing finishing pigs J J Anim Sci 2003 81 191 196 34 O Quinn P R Smith J W Nelssen J L et al Effects of source and level of added chromium on growth performance and carcass characteristics of growing finishing pigs J J Anim Sci 1998 76 2 125 35 Okeudo N J Moss B W Interrelationships amongst carcass and meat qual ity characteristics of sheep J Meat Science 2005 69 1 8 36 Olivares A Daza A Rey A I et al Interactions between genotype dietary fat saturation and vitamin A concentration on intramuscular fat content and fatty acid composition in pigs J Meat Sci 2009 81 4 641 647 37 Shehon J L Payne R L Johnston S L et al Effect of chromium propi onate on growth carcass traits pork quality and plasma metabolites in grow ing finishing pigs J J Anim Sci 2003 81 2515 2524 38 Wiegand B R Sparks J C Parrish F C et al Duration of feeding conjugat ed linoleic acid influences growth performance carcass trails and meat quality of finishing barrows J J Anim Sci 2002 80 637 643 通讯地址 南昌市经济技术开发区枫林大 道 邮编 330013 金黄色葡萄球菌 沙门氏菌 大肠杆菌的生长均有 明显的抑制作用 鼠李糖乳杆菌可抑制沙门氏菌 和产气荚膜梭菌 而对金黄色葡萄球菌和大肠杆 菌无明显抑制作用 丁酸梭菌和鼠李糖乳杆菌联 合培养时对产气荚膜梭菌 沙门氏菌 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌均显示出较强的生物拮抗作用 但未表现出协同作用 参考文献 1 曹广添 刘婷婷 周 琳 等 丁酸梭菌对致病菌和有益菌的体外作用效果 研究 J 中国饲料 2012 4 16 19 2 冯树 张忠泽 混合菌 一类值得重视的微生物资源 J 中国食用菌 1990 9 1 4 7 3 呼慧娟 范小燕 周 琳 等 不同氧需求特性菌株在模拟肠道厌氧条件下 的增殖 J 饲料工业 2011 32 20 38 41 4 黄 琴 黄 怡 崔志文 等 鼠李糖乳杆菌对巨噬细胞先天性免疫应答的 调节作用 J 中国农业科学 2012 45 8 1621 1626 5 黄怡 黄琴 李卫芬 等 鼠李糖乳杆菌对 Caco 2 细胞抗氧化功能和细 胞因子分泌的影响 J 畜牧兽医学报 2012 43 2 250 254 6 刘冬梅 李理 梁世中 等 鼠李糖乳杆菌产生抗菌物质的抑菌作用和特 性研究 J 中国乳品工业 2006 34 1 13 16 7 刘冬梅 李理 梁世忠 等 鼠李糖乳杆菌的抑菌及其在大豆奶酪中性质 研究 J 现代食品科技 2005 21 4 6 10 8 陆俭 张雪平 孟筱琦 酪酸梭菌和婴儿型双歧杆菌对霍乱弧 菌 的 拮抗 试验 J 微生物学通报 2000 27 5 338 341 9 吕存女 邝 欣 崔萱林 酪酸梭菌与婴儿型双歧杆菌对产 气荚膜梭菌 试管内生物拮抗作用的研究 J 中国微生态学杂志 2001a 13 1 38 40 10 吕存女 邝欣 张雪平 等 酪酸梭菌与婴儿双歧杆菌对艰 难 梭菌 体外 生物拮抗作用的研究 J 中国微生态学杂志 2001b 13 4 222 224 11 王玉华 高 晶 陈 萍 等 鼠李糖乳杆菌不同组分抗氧化活性的研究 J 食品科技 2011 36 9 27 31 12 王玉华 高 晶 冯 印 等 鼠李糖乳杆菌耐酸及胆盐能力研究 J 食品科 学 2008 20 12 449 451 13 魏 华 徐 锋 徐玉琴 鼠李糖乳杆菌的生物学特性及发酵性能研究 J 食品与发酵工业 2001 27 9 11 15 14 吴光伟 韩建春 鼠李糖乳杆菌 ATTC 53103 产细菌素的研究 J 东北 农业大学学报 2009 40 8 81 85 15 薛胜平 杜连祥 路福平 三种益生菌混合培养及共生机理研究 J 工业 微生物 2008 38 2 28 32 16 张香美 江汉湖 董明盛 双歧杆菌与嗜酸乳杆菌混合培养时微生态关 系研究 J 安徽农业技术师范学院学报 1999 13 2 5 10 17 张晓阳 卢 忆 马艳莉 等 丁酸梭菌生理功能及应用研究进展 J 中国 食物与营养 2012 12 31 35 18 Cao G T Xiao Y P Yang C M et al Effects of Clostridium butyricum on Growth Performance Nitrogen Metabolism Intestinal Morphology and Cecal Microflora in Broiler Chickens J J Anim Vet Adv 2012 11 15 2665 2671 19 Gao Q X Qi L L Wu T X et 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