【毕业学位论文】（Word原稿）极端耐辐射异常球菌Deinococcus radiodurans错配修复基因的功能鉴定和分析-生物化学与分子生物学博士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 极端耐辐射 异常 球菌 in in i 摘 要 极端耐辐射 异常 球菌 1 是 地球上 最 耐 辐射 损伤 的生物之一 ， 具有能 将 电离辐射诱发产生 的 数 百个基因组 链断裂 完整恢复如初， 且 不发生突变 的能力 。 研究其 射损伤的修复机制，不仅对于揭示 复的分子机理，而且对于环境保 护，人类健康以及太空的探索和开发，均具有 十分 重要的意义。 尽管已公布 D. 1 基因组序列和开展大量的研究工作，然而 ， 对 该 生物的 极端辐射抗性的分子机制仍不十分了解。已知 复途径（重组修复、切除修复和错配修复）中，错配修复 途径 在 以及 在 防止生物突变、 维护基因组的完整性上起到重要的作用 。 基因组分析显示D. 有两个 源物， 都具有 和与 合的结构域，功能尚不明确。本研究利用 变分析系统 ，对预测的与错配修复相关 的 因（ 行了基因功能分析和鉴定。 研究利用 因引入到 D. 胞，成功地建立了一种研究突变频率和突变图谱的 糖敏感（ 变分析系统。并首次应用到极端耐辐射 异常球菌 D. ， 分析了该生物的突变作用以及 探讨了 因功能。 借用 条件致死基因 为阳性选择标记，捕获了四种 D. 可移动插入序列（ 件： 现 件是 细胞 自发突变、诱发突变和导致基因失活的主要原因。对构建的 D. 及 因缺失突变株的突变频率以及突变图谱的分析表明，这些基因的缺失提高了 D. 自发突变和辐射诱发突变频率 2 10 倍，其中 因的缺失导致 8 辐射诱发突变频率提高了近10 倍， 研究结果表明 及 因能有效地抑制 件的转座活性，在维护 D. 因组的稳定性起到重要作用。 为确定 D. 些基因在 配修复途径中的作用。 我们 利用来自 分析基替换的 突变分析 系统 变分析系统，测定和分析了 自发突变导致 D. 因 突变频率和突变图谱。研究结果表明 D. 因 不影响 碱基替换 （点突变）和 9 失引起的自发突变频率，而 因的缺失提高了 因 变频率 2 倍和 8 倍。突变图谱分析表明 因的缺失导致突变热点由野生型的一个热点 1259(T G)改变为三个（ 1435(G A)、 1319(C A)和 1441(A C)）；而 因的缺失增加另一个热点 1441(A C)。 用含有 碱基替换 和 9 因片段进行的 转化试验表明 因的缺失提高了 碱基替换 因片段转化效率，高于转化野生型菌株的 ， 转化 因缺失菌与野生型菌株的效率 没有区别， 用 9 失突变的 因片段对所有测试菌株的转化频率没有差异 。 研究结果证实 因编码的参与 基错配修复途径； 因编码的 白为错配修复途径的关键酶。目前 有关 D. 配修复的研究甚少 ， 本研究结果 为探求 D. 配修复的分子机制奠定理论基础。 关键词： 错配 修复 ， 变分析系统，突变 1 is of or of of on NA It NA an on of in . of in by In we a by as a a or We of in D. of . It of by S . of 4in of in . 及 S in of NA . To of . of in of on 100 . of of 259(T G) 435(G A), 1319(C A)441(A C); at 441(A C). of bp . of of in of t It in in 录 摘 要 . i . 一章 文献综述 . 1 极端耐辐射异常球菌的特性 . 1 耐辐射异常球菌的分离 . 1 耐辐射异常球菌的生长及遗传特性 . 3 D . 电离辐射抗性 . 3 D. 射抗性 . 5 干燥抗性 . 6 其它抗性 . 6 D. 伤的反应 . 7 耐辐射微生物的多样性和进化 . 7 修复机制 . 10 切除修复 . 10 错配修复 . 14 重组修复 . 17 D. 因组的分析 . 18 转录组学的研究 . 19 总结和展望 . 20 立题依据 . 20 研究内容 及技术路线 . 22 第二章 耐辐射异常球菌 变系统的建立 . 24 材料与方法 . 25 实验菌株来源 . 25 培养基 . 25 生物化学试剂 . 25 酶 . 26 主 要仪器 . 26 菌 株的生长 . 26 基因组 质粒 提取 . 26 含 体的构建 . 27 D. 变系统的构建 . 30 结果与分析 . 31 D. 生型菌株的抗生素抗性 . 31 因的克隆 . 31 粒的构建 . 33 蔗糖敏感型 D. 株 的构建 . 34 讨论 . 35 穿梭质粒载体 . 35 条件致死基因 能分析 . 37 第三章 因突变图谱的分析 . 39 材料和方法 . 41 实验菌株、质粒及培养条件 . 41 生化试剂、酶 . 41 主要仪器 . 42 v 基因组 质粒 提取 . 42 基因的 增 . 43 基因缺失突变 . 45 基因缺失突变株的构建 . 48 射生存率 . 48 射生存率和突变频率 . 48 因序列的测定和分析 . 49 利用条件致死 因分析 复基因的作用原理 . 49 结果与分析 . 50 D. 配修复相关 基因缺失突变株的构建 . 50 错 配修复 基因与 导的 伤修复 . 54 射生存率 . 55 突变频率分析 . 55 基因 突变图谱分析 . 58 小结 . 66 讨论 . 67 变系统 . 67 错配修复相关基因 的功能分析 . 67 件 . 69 第四章 错配修复基因 能分析 . 70 材料和方法 . 71 实验菌株和培养条件 . 71 生化试剂、酶、主要仪器 . 71 基因的 增 . 72 增产物的纯化 . 73 线性 转化 . 74 因双突变株的构建 . 74 发突变频率的分析 . 75 部分 因序列分析 . 75 错配修复基因对碱基替换 段转化重组的作用原理 . 75 结果与分析 . 75 D. 因双缺失突变株的构建 . 76 利福平抗性 （ 自发突变频率分析 . 76 因突变图谱分析 . 77 小结 . 83 讨论 . 84 变系统和 变系统的比较 . 84 存在问题 . 84 第五章 结论 . 87 参考文献 . 88 致 谢 . 104 附 录 . 105 个人简历 . 112 中国农业科学院博士学位论文 文献综述 1 第一章 文献综述 1 是 地球 最 耐 辐射 损伤的 生物之一。 其 耐 电离辐射和 射 的能力 显著的 表现在 于 辐照剂量达 15 500 不丧失生存能力 和 不发生突变 ， 它的 电离辐射抗性 和 射抗性比 分别 高 200 倍 和 20 倍（ 998， 974， 997）， 耐受的辐射剂量是人类的耐受剂量的 3,000 倍（ 995）。 与该属其它极端耐辐射微生物一样，该菌 具有将 上百个双链断裂和数千个单链断裂的基因组 完整如初地恢复的能力 。因此 ， 引起科学界的极大兴趣。 开发和研究 这类微生物菌株资源以及其 伤 的 修复 机制 ，不仅对 阐明 伤 修复分子机理 ， 而且 在 环境保护和生物修复、人类健康，乃至地外空间的开发和利用等方面有着十分重要意义 。 1997 年美国能源部开始对利用 D. 为全美放射性废物生物修复处理的一种潜在工具而倍加重视。伴随这种重视和资金投入，极大地促进和加速了极端辐射抗性微生物的研究，该菌成为整个基因组光学图谱、序列测定和目前金属修复和有机化合物降解基因的遗传工程表达的研究主题。 标志性的研究成果是 1999 年 美国 基因研究所（ 成 和 公布了 D. 因组全序列 （ 999） 。近年来， 抗辐射微生物资源及 复分子机制的研究越来越受全球科学界的关注，序列公布至今短短的 5 年间所发表的论文是 首次 发现 D. 序列公布 43 年间的 2 倍。 极端耐辐射 异常 球菌的 特性 耐辐射 异常 球菌 的分离 耐辐射 异常 球菌 1是 1956年从 电离辐射灭菌处理的肉罐头中分离的细菌 （ 956） 。 这种细菌能在经过完全灭菌的辐射剂量（ 3 10 6 25 射后的“灭菌”肉罐头中生存下来 ，该细菌被认为是“世界上最顽强的细菌”，最初定名为1 (耐辐射 微球菌 )（ 961） 。 细胞呈 革兰氏 阳性 球状 、 不产生孢子 ， 在培养基平板上形成鲑鱼肉红色 的 菌落。 M. 非唯一的抗辐射细菌 ， 在各种 辐射的材料中也分离到另一些具有类似的特点的红色微球菌（ M. 分离于辐射的鳕鱼组织 （ 963） ，M. 离于辐射过的 （ 印度 ） 龙头鱼 （ 971, 1973） ， M. 离于辐射过的动物排泄物中 （ 973） 。由于这些细菌的极端耐辐射能力和其它表型特征有别于 的其它成员，因此，这类微生物在分类学上的地位争论了许多年。 根据 16S 发现这类细菌聚类在一起，彼此之间的亲缘关系非常接近。 在系统发育分类上有别于原核细菌，与古细菌 嗜热菌属（ 的亲缘关系最近，认为 两个属共同起源同一祖先在早期进化过程中分支而来，分别 属于 原核细菌 （ 门的 （ 997）。 另外，它们不寻常和复杂的细胞壁 （ 964, 965, 968, 972, 973, 978） 以及脂质组成 （ 965, 971） 和辐射抗性， 明显 与 无关。因此， 19