【毕业学位论文】（Word原稿）岛叶点燃癫痫大鼠海马Arc、BDNF、TrkB表达及其与学习记忆的关系-癫痫的临床与实验研究

0 分类号： 单位代码： 10752 密 级：公 开 学 号： 2008181 宁夏医科大学 硕士研究生学位论文 岛叶点燃癫痫大鼠海马 达及其与学习记忆的关系 s 学 位 申 请 人 ： 指导教 师 ： 教授 申请学位门类级 别 ： 医 学 专业名 称 ： 外 科 学 研究方 向 ： 癫痫的基础和临床研究 所在学 院 ： 临 床 学 院 论 文 完 成 日 期 ： 二一一年三月 宁夏医科大学研究生学院 s s 011 宁夏医科大学学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，无抄袭及编造行为。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经 发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名 论文导师签名 年 月 日 年 月 日 宁夏医科大学 关于学位论文使用授权的声明 宁夏医科大学有权保留使用本人学位论文，同意学校按规定向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权宁夏医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。 （保密论文在解密后应遵守此规定） 论文作者签名 论文导师签名 年 月 日 年 月 日 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 中文摘要 I 岛叶点燃癫痫大鼠海马 达及其与学习记忆 关系 的研究 摘要 目的 电刺激 立慢性电点燃癫痫模型，通过避暗试验观察癫痫大鼠不同时间段学习记忆功能， 检测 活性骨架调节 蛋白（ 脑源性神经营养因子 (酪氨酸蛋白激酶受体 B(岛叶慢性电点燃癫痫大鼠海马组织中表达， 探讨 方法 关性研究：健康雄性 16只，随机分为岛叶点燃组、假手术 对照 组及空白对照组， 假手术组大鼠只植入电极及测定后发放阈，不行电刺激点燃。 点燃组 建立 岛叶慢性电点燃模型。点燃组 分 0 周 、 1 周 、 2周 、 3 周 、 4 周 几个亚组。观察各 组大鼠行为学改变及脑电生理变化，采用避暗试验方法记录 各组大鼠 潜伏期（ 穿梭次数（ 研究其学习记忆变化 。 大鼠单笼饲养， 避暗试验后，无外界刺激无痛处死假手术对照组及空白对照组大鼠 ，每组取大鼠 n=12 只。点燃组每亚组避暗试验后于 1h、 3h、 6h、 12h、 24h 等不同时间点无痛处死大鼠，每时间点取大鼠 n=12 只； 取 1h、 3h、 6h、 12 取 1h、 12h、 247每组大鼠一半用乙醚麻醉后断头取脑，迅速取出海马组织，分别放于冻存管中，置于液氮后再移 至 冰箱以备用，另一半经乙醚麻醉后用 4%多聚甲醛灌注后取全脑放于蔗糖溶液分别梯度过夜脱水，应用 包埋，冰箱保存以备组织切片用 。 标本应用免疫组化、 技术方法研究岛叶电点燃致癫大鼠海马 蛋白的表达并探讨与学习记忆的关系 。 结果 1、 岛叶慢性点燃后大鼠 自行癫痫发作，检测大鼠脑电波可收集典型的癫痫脑电波模型。模型制作点燃成功率为 空白组避暗试验结果 中文摘要 ），假手术组避暗试验结果 （ 、 （ ），点燃组： 点燃 0周（即点燃当天至点燃第七天） 避暗试验 结果 ）；点燃 1周避暗 试验 的结果 ）；点燃 2 周 避暗试验结果的 ( （ ）； 点燃 3 周 避暗试验结果的 (、 （ ）；点燃 4 周避暗试验的 结果为 （ ）。 点燃 2周、 3周组 与 对照组相比学习记忆能力增强（ P 点燃 4周 与对照组比学习记忆能力 明显下降（ P 假手术组与空白对照组 间 差异无统计学意义。 2、分子生物学检测显示： （ 1） 免疫组织化学结果： 疫组织化学染色阳性结果表现为海马细胞胞质成棕黄色， 胞膜呈棕黄色。阳性细胞百分率点燃组与假手术对照组及空白对照组有明显差异（ P 点燃组明显高于对 照组。点燃组内比较，阳性细胞百分率点燃 2 周 、 3 周组时明显高于0周、 1周、 4周 组， 4 周组最低（ P 各亚组各个时间点检测中， 42周及 3周组峰值均最高 (P 4 周 峰值均最低（ P 。 （ 2） 果 ： 在 对照下目的条带清晰可见，通过测定各条带的光密度值，与 点燃组与假手术对照组及空白对照组有明显差异（ P 点燃组明显高于对照组。点燃组内比较，光密度校对值点燃 2周 、 3周组时明显高于 0周、 1周、 4 周 组， 4周组最低（ P 各亚组各个时间点检测中， 增出片段为 77 6h 达到高峰， 增出片段为 533 增出片段为248为 242周及 3周组峰值均最高 (P 4 周 峰值均最低（ P。 （ 3） 迹结果 ： 各个组大鼠海马中 白 均有表达，在标准蛋白分子参照物 对照下，通过测定各目的条带的光密度值，与 点燃组与假手术对照组 及空白对照组有明显差异（ P 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 中文摘要 燃组明显高于对照组。点燃组内比较，光密度校对值点燃 2 周 、 3 周组时明显高于 0周、 1周及 4周 组， 4 周组最低（ P 各亚组各个时间点检测中， 子量为：55 6子量为： 14 子量为： 145为 242周及 3周组峰值均最高 (P 4 周 峰值均最低（ P 。 结论 1、慢性 电刺激大鼠岛叶成功建立了慢性癫痫点燃模型，通过行为学观察及大鼠脑电生理检测， 证实了岛叶是某些癫痫发作的一种独 立致痫源 。 明慢性岛叶癫痫大鼠学习记忆等认知功能受损。且进一步证明了岛叶癫痫与海马关系密切，海马在岛叶点燃癫痫模型中起着非常重要的作用。 能参与了岛叶癫痫的学习记忆功能，是学习记忆的重要分子基础。 关键词 ： 岛叶癫痫、海马 、 习记忆、避暗试验 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 英文摘要 s o of s to s o D by of to by of to in by -P to of is in s ) 、 T:s) 、 of N: is no of T： ， is of P . is in of rc in h., to h, to 2h. is to w), to to w（ P . As in 4 rc in is of is of 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 英文摘要 V 【 : 中英文缩 略语 略 语 表 英文缩写 英文全称 中文全称 治性癫痫 放电阈值 密度 电图 刻早基因 性调节细胞骨架蛋白 经生长因子 氨酸激酶受体 B 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 目录 目 录 中文摘要 英文摘要 缩略语表 前 言 1 一 、 大鼠岛叶慢性电点燃癫痫模型的建立及学习记忆 功能研究 3 材料和方法 3 结果 11 二 、 岛叶癫痫大鼠海马 材料和方法 13 结果 19 讨 论 27 小 结 参考文献 45 综 述 53 致 谢 60 攻读学位期间发表的学术论文 61 个人简历 62 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 前言 - 1 - 前 言 癫痫是由多种复杂病因共同引起的脑功能障碍综合征，且癫痫对高级神经机能损害作用较大、病情迁延时间长，常留下多种后遗症。癫痫反复发作所产生自发不规则放电可导致的神经系统生理机能及多种生理因子机能传递的异常，从而加重大脑多种生理生化功能的损害，加剧了由于异常功能放电所引起癫痫点燃效应、轴索功能顺应性的改变、突触传递及突触可塑性改变所致的结构及其功能异常，从而通过持续癫痫发作所形成异常放电活动或通过改变脑内多 种正常神经递质传递途径及生理机能而影响认知功能损害。临床上可表现为学习能力、时间记忆力、空间想象力和逻辑思维能力等认知功能的下降。 最近有研究报道，岛叶在认知功能方面有重要作用，特别对记忆、学习和情感起着至关重要的作用。作为人类第五脑叶的岛叶是一高度发达的结构，位置深在，周围比邻结构复杂，对其发生、发展、详尽的解剖学联系、特定功能，特别是其与癫痫的关系尚不明确 1 2007 年 研究证实，岛叶起源癫痫病人在认知功能方面有明显损害，表现在空间记忆、情感等多方面（ K 2008)。 海马是大脑边缘系统的重要组成部分，也是癫痫密切相关脑区之一，在人类岛叶癫痫患者以及各类癫痫动物模型中，均可出现海马硬化、变性萎缩等形态及细胞学改变 3。最近在对有海马病变的大鼠的研究发现海马是正常的再认记忆的结构基础 7。对大鼠及灵长目动物如：猴等海马损毁试验表明，其学习、记忆等认知功能明显改变，其直接证明海马是参与学习和记忆的脑认知功能区。所以海马是研究癫痫即岛叶癫痫学习记忆功能的重要脑区之一。 一种效应子。 4神经生物自发放电、应激等兴奋性刺激促使海马中性 受体迅速活化，并促使 录功能增加，并通过翻译成白，在功能神经元特定的部位改变其突触可塑性、调节长时程增强起重要作用，并发挥其独特生物学功能。 白通过影响微管系统相关性蛋白复合体聚合 6，并通宁夏医科大学硕士研究生学位论文 前言 - 2 - 过调节神经元细胞骨架之间相互作用，影响功能神经元突触的结构可塑性，调节改变神经元对信息的获取、储存、处理和巩固等重要 功能。 神经元突触可塑性和记忆巩固的关键分子 7 ，研究证实在学习记忆过程中伴随着该基因的转录与表达 7。 神经元产生的神经营养因子，可以促进出生前后脑的发育。 脑内含量丰富 ,在 发育过程中，可以支持神经元存活、分化、生长和突触形成，维持神经元正常生理功能，调节神经递质释放，参与神经的可塑性，调节长时程增强增强记忆力。 括增加突触终末的密度，促进树突和轴突的的生长有明显促进作用。并有证明直接参与调节学习和记忆过程 其特异性受体 过一系列酶促反应发挥生理学作用，可加强胆碱能、多巴胺能、 5 有酪氨酸激酶原癌基因编码的一种神经营养素家族高亲和力受体 14。 合后，可以引起其磷酸化并激活胞内的酪氨酸激酶信号通路，磷酸化的转录因子移入细胞核并与特定基因的启动子区结合启动转录过程，从而调控神经系统多种神经细胞的发育和分化等。 有与其特异性受体 合，才能发挥其多种的生物和生理学机能。最近研究发现，若阻断其信号传导通路，则 本 实验采用慢性电刺激 鼠岛叶，建立慢性电点燃癫痫大鼠模型，观察大鼠慢性期癫痫的自发反复发作特点及大脑海马区组织学改变，探讨岛叶癫痫的发病机制。并利用岛叶电点燃模型观察在不同时间点 蛋白在海马中表达 ，探讨它们在岛叶癫痫 对学习记忆的影响 。 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料与方法一 - 3 - 一、 岛叶慢性电点燃癫痫大鼠模型的建立及学习记忆的研究 材料与方法 1. 岛叶慢性电点燃大鼠癫痫模型的制作 6 8周龄健康成年 D)大鼠 216只， 体重 275 15有大鼠单笼饲养，避免强光、强噪音刺激， 24h 昼夜循环。 1周后进行筛选，筛选后大鼠行严格固定喂食、喂水时间，严格控制食物的量，自由饮水。积极培养本批大鼠统一生活习性及觅食规律。 大鼠按体重由小到大顺序排列，编为 1 216 号，利用随机数字表取得随机数，再将所得出随机数从小到大顺序安排编序号（按先后顺序排列数字相同），依次分入三组，随机分为岛叶点燃组、假手术组和 空白对照组 ，假手术组、空白对照组每组 n=6只，点燃组 n=96 只。 空白对照组：不行手术，不安置电极，在 刺激实验组的大鼠时以相同的方法刺激抓取 1 2 次即可。 岛叶点燃组： 分别在岛叶安放双极电极，本实验双电击安放在大鼠左侧岛叶，参考文献实验研究表明，左右无明显差别。假手术组：同岛叶点燃组方法，只植入双电击，测定后发放，不行电刺激点燃。 验主要使用试剂 戊巴比妥钠： 司 批号： 20091011 规格： 5g 头孢噻肟钠： 司 批号： 0000014， 规格： 80万单位 蒸馏水： 由宁夏医科大学科技中心试验准备室提供 无水乙醇： 南京光明化工公司，批号： 0910093602， 规格： 5005%乙醇： 上海振兴化工公司，批号： 0911083903， 规格： 500凝牙托粉： 天津光明医疗器械齿科材料厂， 批号： 200912 自凝牙托水： 天津光明医疗器械齿科材料厂， 批号： 200912 A& 司 氯乙酸 ) 司 批号： 20091021 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料与方法一 - 4 - 司 批号： 20093031 烯酰胺） 批号： 20091211 脂糖粉） 批号： 00002341 硫酸铵） 司 批号： 21991221 溴酚蓝） 批号： 20191031 基水杨酸） 批号： 21091711 司 批号： 20091011 M 脱脂奶粉） 公司 甲基亚砜） 批号： 21091711 巯苏糖醇） 批号： 201191011 二胺四乙酸） 批号： 20891017 油） 批号： 20621011 甘氨酸） 批号： 21293011 阿拉伯树胶粉） 批号： 22709111 基乙醇） 批号： 22309101 聚赖氨酸） 批号： 200912011 s（丽春红） 批号： 20081011 二烷基磺酸钠） 公司 温） 批号： 20891011 司 批号： 200910123 甲醇（ 上海振兴化工生物化学有限公司，批号： 0910493602， 规格： 500盐酸 (37% 上海振兴化工公司，批号： 0910093121， 规格： 500乙酸 (上海振兴化工公司，批号： 0110092602， 规格： 500化钠 ( 上海振兴化工公司，批号 0912093602， 规格： 500化钾 ( 上海振兴化工公司，批号： 0810093622， 规格： 500g 磷酸氢二钠 (上海振兴化工公司，批号： 091003235， 规格： 500g 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料与方法一 - 5 - 磷酸二氢钾 ( 上海振兴化工公司，批号： 0911093602， 规格： 500g 氢氧化钠 ( 上海振兴化工公司，批号： 0710093602， 规格： 500g 验仪器 鼠脑立体定位仪： 功能生物电子刺激器： 性颅骨钻： Y O 冷光四孔手术无影灯： 广东汕头医疗器械厂 动物生命体征监护仪 上海移数科技公司 验方法 叶电极植入及其固定方法 图 1 岛叶电极植入示意图 用镍铬漆包线（直径： 150 m）及其微电子元件自制双极大鼠岛叶刺激用电极，电极两尖端间距 100 m 200 m。电极制作完后置入戊二醛溶液中浸泡过夜，使用时用碘酒檫试。 巴比妥钠 (50mg/腔注射麻醉大鼠，小心用动物脱毛专用 剪刀将大鼠头顶部部毛尽量剪去，将大鼠头部固定于脑立体定向仪上，门齿低于耳杆平面 5%酒精局部消毒皮肤，正中切口，呈椭圆形（长短轴比为： 23次剪除皮肤、皮下结缔组织和钝性分离骨膜，用无水乙醇露骨表面脱脂，显露颅骨及前后囟点位置，用动物实验蚊式钳创面夹闭止血，露骨表面渗血可使用骨蜡涂抹。枕顶骨区及额骨区可安放 3个加固螺钉，枕骨区加固稍长螺钉（长约 兼做接地电极，见上示意图所示。 立体定位：左侧岛叶（前囟点前 开 膜下 14。宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料与方法一 - 6 - 双极电极安放于岛叶，作为刺激电极；单级电极安放于右额硬膜外和左侧小脑硬膜外，分别作为皮层记录电极和参考电极，安放固定螺钉，生物胶固定于颅骨。所有电极均由双孔接插件引出 ,并用牙托水泥将接插件固定在颅骨表面。大鼠电极及螺钉安放位置见图 1，封闭创伤口。术后严密观察大鼠呼吸频率、心率快慢、皮肤温度、血压及其肤色等变化，使用大鼠生理体征监护仪检测 1 项指标均达到正常，将鼠放回饲养笼，保证各鼠的单笼饲养，因大鼠有嗜血性，可能会相互咬噬；术后连续臀部肌注3d 头孢噻肟钠 /只以预防创面感染。 鼠岛叶慢性电点燃的建立 后放阈值（ 测定 16：在电极植入手术后恢复5 7d，将大鼠置于屏蔽箱笼内，双孔插件外接延长线，让大鼠自由活动，无强光及强声等外界刺激影响。测定大鼠岛叶的 100多功能生物电刺激器通过电极给大鼠岛叶持续电流刺激，脉冲为双向方波电流，设定波宽为 率 60赫兹，持续刺激时间 1秒。岛叶刺激强度开始为 100 A，以后每间隔 2400 A，直到视屏脑电图（ 录到大 于或等于 3 秒时间的后发放电高而尖的棘波，即为该大鼠的后放阈值（ 从测定 激强度为 ，每日两次，间隔时间为 8 小时，定时刺激大鼠岛叶，记录刺激时间及发作等级级别，直到大鼠出现癫痫 5级发作。 2 大鼠行为学实验观察 大鼠点燃过程中行为学观察， 24 小时监控大鼠活动情况，根据参考 评分标准进行癫痫发作级别评分。 18： 0级：无任何明显反应； 级：面部阵挛抽搐，包括不自主眨眼、动须、节奏性咀嚼、头部或全身湿狗样抖动等； 级： 级行为学表现加节律性点头动作； 级：级行为学表现加一侧或双前肢抬高、阵挛抖动，无明显站立，闭眼头部抖动明显加重； 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料与方法一 - 7 - 级：级行为学表现加后肢站立、站立不稳，但无跌倒； 级：级加双侧前、后肢强直、身体背屈强直、跌倒或口角呕出白沫，持续站立和倾倒，失平衡和四肢痉挛抽动，或持续倒地不起，全身痉挛抽搐。 大鼠连续出现 10 次 3. 脑电图描记 从开始刺激至试验结束，共 50天，采用 6通道的信号记录系统，对从每个电极的 。 24鼠自发癫痫的次数及时间和发作的强度。 4. 学习记忆实验 （避暗试验） 全部大鼠均采用避暗试验（ 博士 ）箱进行行为学测试 ，设备自带软件分析系统（上海移数信息科技公司）进行学习记忆能力测试。实验前将大鼠在试验箱内适应 35 分钟 ， 试验箱分明箱、暗箱两室，两室间有一直径 5“ n”形孔空洞，暗室底部有可外部自主控制通电铜网板。由于大鼠有喜暗的习性，将大鼠背对暗室的洞口放入明室，并开始计时，进行学习实验，大鼠可很快自由进入暗室，此时即为大鼠潜伏期，并记录，同时 接通暗室电源，直流电电击，受到电刺激后大鼠会逃出暗室，如此训练104大鼠休息 24 小时 后，暗室铜网板通电，将大鼠同前置于明室，研究大鼠记忆功能，记录大鼠从明室第 1 次进入暗室的时间即为本次实验大鼠潜伏期（ ，大鼠受电击后会逃避性地跑出暗室，然后记录 10鼠进入暗室的次数即穿梭次数（ 并记录和观察大鼠在明暗是活动时间和活动路线距离 ，共同作为记忆成绩表现为潜伏期和穿梭次数。 5. 统计学处理及分析 采用 计软件包进行分析避暗试验所得潜伏期及穿梭次数，所得数据以x s 表示，数据采用单因素因素方差分析，组间比较用 验， p 有统计学意义。 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 结果一 - 8 - 结 果 1. 模型制作：模型点燃成功率为 大鼠岛叶电刺激后发放阈值为： 35030A，点燃所需天数为： 5。实验发现，实验大鼠体重在一定范围内对大鼠的后发放阈值及点燃所需天数无明显影响。点燃成功后， 24 小时视频跟踪显示，大鼠会自发出现癫痫大发作，一般发作时间集中 于 下午（ 13 时 15 时）和凌晨（ 4 时 5 时）。一 般自发性发作次数为： 2 /天。有实验研究证明，大鼠点燃成功后，如长时间不再行外界刺激，会出现癫痫不再发作现象，这位模型局限性，所以我们在每周固定时间行电刺激一次，使其保持癫痫鼠状态。对实验大鼠正常脑电图、后发放阈脑电图、癫痫发作脑电图的测定进行对比。记录大鼠点燃过程中脑电波。如图 1 图 1（ a） 正常大鼠脑电图，两通道出现平稳的波；（ b）癫痫发作大鼠脑电图，出现明显的癫痫波，波幅增高增宽； （ c）后放阈脑电图，持续出现 3 2. 避暗试验 ： 空白组避暗试验结果 ），假手宁夏医科大学硕士研究生学位论文 结果一 - 9 - 术组避暗试验结果 、 （ ），点燃组：点燃 0周（即点燃当天至点燃第七天）避暗试验结果 （ （ ）；点燃 1 周避暗的结果 （ ）； 点燃 2 周 避暗试验结果的 ( （ ）； 点燃 3 周 避暗试验结果的 (、 . 15次）；点燃 4周避暗试验的结果为 ）。点燃 2周、 3周组 与 对照组相比学习记忆能力 增强（ P 点燃 4 周 与对照组比学习记忆功能明显下降（ P 假手术组与空白对照组间差异无统计学意义 表（ 1） 点燃 大鼠 避暗试验的 s）及 ） 点 燃 组 0 周 1周 2周 3周 4周 注： 个亚 组内比较， *示 P *示 P 各亚 组间相比较 示 P 示 P 照组大鼠避暗试验的 s）及 ） 项目 空白对照组 假手术对照组 N 燃组各亚组避暗试验周 2周 3周 4周分组 结果一 - 10 - 点燃组避暗试验周 2周 3周 4周分组次数 材料与方法二 - 11 - 二、 岛叶慢性电点燃癫痫大鼠海马 材料与方法 标本收集 大鼠单笼饲养， 避暗试验后 ， 无外界刺激 无痛处死假手术对照组及空白对照组大鼠 ，每组取大鼠 n=12 只。点燃组每亚组避暗试验后于 1h、 3h、 6h、 12h、 24h 等不同时间 点无痛 处死大鼠 ，每时间点取大鼠 n=12 只； 1h、 3h、 6h、 12测， h、 12h、 24h 等时间 检测 7每组大鼠 一半用乙醚麻醉后断头取脑，迅速取出海马组织，分别放于冻存管中，置于液氮后再移至 冰箱以备 ，另一半经乙醚麻醉后用 4%多聚甲醛灌注后取全脑放于蔗糖溶液分别梯度过夜脱水，应用 包埋， 冰箱保存以备组织切片用。 注方法 将大鼠无刺激的放置 醚箱中麻醉，正中开胸，从左心室至升主动脉快速灌注生理盐水 100速冲洗体内血液，随后用 4含 4%多聚甲醛的 磷酸盐缓冲液 (快后慢关注固定 15 分钟，待固定完成后，以大鼠双侧眼球瞳孔变白为准，剪刀快速断头，用咬骨钳取脑，切取视乳 头至乳头体之间的脑组织，依次浸入相同的多聚甲醛固定液、 30%蔗糖、 20%蔗糖及 10%蔗糖梯度脱水中各 24 小时，并都存放于 4冰箱内过夜，液氮内异戊烷隔离行 埋剂冷冻包埋， 箱保存。 验材料 56211 中杉金桥公司 N 235聚赖氨酸 )： 10 冰冻切片机： 动磨刀机 南京医疗器械模具厂 编号： 387821 自动双重纯水蒸馏器： 海第二生化仪器厂 编号： 232215 宁夏医科大学硕士研究生学