【毕业学位论文】(Word原稿)生防菌ANTI-8098A在番茄及土壤中定殖特性的研究-植物病害生物防治

分类号： 单位代码： 10389 密 级： 学 号： 建农林大学硕士学位论文 生防菌 番茄 及土壤 中 定殖特性 的 研究 学 科 门 类：农学 一级学科名称：植物保护 二级学科名称：植物病理学 研 究 方 向：植物病害生物防治 研 究 生： 指 导 教 师： 完 成 时 间：二 0 一 0 年四月 he on of in 2010 独创性声明 本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果 。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅 ， 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不 保密。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 指导教师亲笔签名： 日期： 福建农林大学硕士论文 i 目录 中文摘要 . I . 一章 综述 . 1 1 番茄青枯病的生物防治 . 1 2 番茄青枯病拮抗细菌的研究进展 . 1 3 生防菌定殖机制的研究进展 . 2 防菌的定殖研究进展 . 2 防菌对植株生理特性影响的研究进展 . 3 防菌 对植株根际微生态影响的研究进展 . 4 防菌定殖土壤微生态的研究 . 5 4 本研究的目的及意义 . 5 第二章 生防菌 其 记菌异质性比较 . 6 1. 引言 . 6 2. 材料与方法 . 6 料 . 6 法 . 6 3. 结果与分析 . 7 其标记菌株 形态观察 . 7 其标记菌株 生长曲线测定 . 8 其标记菌株 最适 试验 . 8 其标记菌株 验室抑菌率试验 . 9 4. 讨论 . 11 第三章 生防菌 番茄植株内的定殖 . 12 1. 引言 . 12 2. 材料与方法 . 12 料 . 12 法 . 12 3. 结果与分析 . 12 番茄植株内的定殖观察 . 13 番茄植株内的定殖浓度 . 14 4. 讨论 . 15 第四章 生防菌 番茄生理及根际微生物的影响 . 16 1. 引言 . 16 2. 材料与方法 . 16 料 . 16 法 . 17 3. 结果与分析 . 20 番茄生理生化特性的影响 . 20 番茄根际微生物的影响 . 23 番茄根系生长的影响 . 25 福建农林大学硕士论文 . 讨论 . 26 第五章 不同性质土壤中定殖特性 研究 . 27 1. 引言 . 27 2. 材料与方法 . 27 料 . 27 法 . 27 3. 结果与分析 . 28 壤理化性质的测定 . 28 种土壤中 数量动态变化 . 29 土壤中微生物种群的影响 . 30 分析 土壤微生物群落结构的影响 . 38 4. 讨论 . 43 第六章 生防菌 番茄青枯病的防效测定 . 44 1. 引言 . 44 2. 材料与方法 . 44 料 . 44 法 . 44 3. 结果与分析 . 45 同浓度 91 号青枯雷尔氏菌液对番茄的致病试验 . 45 其 记菌株对番茄青枯病的防效测定 . 46 4. 讨论 . 46 第七章 结论与展望 . 48 1 结论 . 48 2 特色 . 48 3 展望 . 48 附录 . 55 个人简历 . 63 致 谢 . 64 福建农林大学硕士论文 I 中文摘要 采用 激光共聚焦显微镜 技术， 对 青枯病生防菌 记菌株 在番茄 植株内的定殖 进行 跟踪 观察， 测定 了 番茄植株内不同部位的定殖浓度， 首次确定了 该菌 的内生定殖特性， 宜 在番茄植株内定殖， 其 在根内的定殖浓度最高，达 104g， 在 茎部 、 叶片内 的定殖 浓度递减。 研究了 番茄 叶绿素、可溶性蛋白含量 和 性 以及 根际微生 物 的影响，结果表明： 番茄叶绿素 有短期效应，处理后第 5 天叶绿素 a、 30 天与对照 几乎没有 含量差 ，处理后第 10 天叶绿素含量 a/b 的值明显低于对照，其后趋于一致；对 可溶性蛋白含量以及 性未产生明显影响，能显著提高番茄根系 性； 理后番茄根际 细菌、真菌、放线菌数量有所下降 。 研究了 记菌株在不同土壤中的定殖消 长动态，分别用稀释涂板法和脂肪酸生物标记法（ 析了 定殖对土壤微生物的影响 ，包括 生物标记总量和 微生物 群落结构的影响，结果表明： 不同土壤中定殖浓度不同，在各土壤中定殖时间 均 超过 160 天 ； 理后，各 处理 土壤中微生物的变化趋势 复杂 ，细菌、真菌 种类和数量均高于处理前，且在第 32 天高于对照 ； 析 结果显示 ，各处理土壤中脂肪酸生物标记总量均高于对照 ，各处理土壤中的微生物处于动态变化过程，总体趋势来看， 理后土壤中真菌、细菌、放线菌特征性磷脂脂肪酸标记量高于对照组。 对 其 记菌株 栽条件下对 番茄青枯病的 生防效果进行了测定，结果表明， 108、 106 度的 可以推迟番茄青枯病的 发生，有较高的防效， 108 校正防效分别为 100 %、 ， 106 校正防效 均 为 。 关键词： 生定殖，消长动态，土壤微生物，生防效果 福建农林大学硕士论文 of of in in of in in in a 04g, in to of of as of a of no on 0th b 0 no to of of in of in to in 60 as of 08, 106 mL to of a 08 mL 00 %, , 06 mL . 1 第一章 综述 番茄（ 是茄科茄属番茄 亚属 的多年生草本植物 ，品种众多，是重要的果蔬之一，国内外都有大面积种植 。 随着科学的发展，发现番茄具有丰富的营养和抗癌物质 1但番茄的产量和质量受多种病虫害的影响，其中番茄青枯病已成为影响番茄生产的主要障碍之一 。 1 番茄青枯病的生物防治 番茄青 枯病 是 由青枯雷尔氏菌（ 起的 一类土传性性细菌病害 4，寄主范围广，可侵染危害 50多个科的数百种植物，广泛分布于热带、亚热带及温带地区 5,6，在我国南方各省危害也十分严重，流行年份造成大面积减产，品质下降，特别在番茄结果期，适逢高温高湿的雨季，可引起毁灭性的危害。 番茄青枯病的防治是一大世界难题，国际上每 4年举行一次细菌性青枯病学术研讨会对其进行广泛的讨论与交流 7，可见国内外科学家对青枯病的高度重视。对于植物青枯病的防治研究，国内外一直是以综合防治为主 8。早期专家们将重点放在抗病育种 9上，但目前为止，具有抗青枯病性能的作物品种很少，而且抗性 容 易丢失；利用嫁接方法防治番茄青枯病虽获得成功，但因技术难度大而导致推广和普及困难 10；轮作在一定程度上能够较好地防治青枯病 11，但受地理环境的影响，也难以大面积推广 12；化学农药防治虽有一定的防效，但 青枯雷尔氏菌在土壤中存活时间长、传播快，小种分化型复杂 13 迄今为止还没有一种理想的农药可以防治青枯病 7，加之 随着化学农药使用量的日益增大， 易产生抗药性 、农药残留、污染环境等负面影响越来越 引起人们的关注 。生物防治具有对生态环境友好、不易产生抗性、有利于人畜安全等优点，使得人们将目光逐渐转向青枯病的生物防治。常用于青枯病生物防治的主要因子有无致病力青枯菌 16拮抗细菌 19,20、转基因作物 21菌根真菌 24、诱导抗性 7以及生态有机肥 25。 2 番茄青枯病拮抗细菌的研究进展 在番茄青枯病的生物防治中，拮抗细菌的利用一直是国内外学者的研究热点，而且也筛选到了不少在实验室内对青枯菌有明显抑制作用的菌株，迄今国内外文献中出现了许多关于拮抗细菌防治植物青枯病的相关报道 26涉及到的生防细菌主要有假单胞菌（如荧光假单胞菌 29、洋葱假单胞菌等）、链霉菌 30、芽孢杆菌（如多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌 31、短芽孢杆菌等）等。 芽孢杆菌 由于能产生抗逆性极强的芽孢， 要求营养简单，繁殖速度快等优点32， 从而更有利于商品化菌剂的生产、运输和保存，并且相对于其它细菌类和真菌类的菌剂，其与化学农药复配使用的相容性更好并且使用效果较为稳定， 使其福建农林大学硕士论文 2 成为筛选青枯菌拮抗细菌的重点来源 33,34。目前 用于防治青枯病试验的芽孢杆菌有：多粘芽孢杆菌 5、枯草芽孢杆 菌 36,37、蜡状芽孢杆菌 38、巨大芽孢杆菌 9等。 迄今为止，国内外学者已经对番茄青枯病的拮抗细菌的筛选以及防效测定做了大量研究。 1990）用三株生防菌分别进行多种作物青枯病的防效试验，其中一株对番茄青枯病的温室试验分别为 95 ，但是田间分别只有 36 40。 黎起秦等 37（ 2005）研究了不同接种方法对内生芽孢杆菌 果表明，接种 7 治效果为 ；同时接种 为 。将 番茄青枯病的室内防效为 ，田间防效为 。魏春妹等（ 2000）发现了对茄科类作物青枯病有良好防效并且具有促生作用的菌株 901。郑福庆等（ 1998）从广东省不同地方、不同作物的根围及根际土壤中，筛选到对番茄青枯病菌具抑菌效果的菌株 20个 8，盆栽试验结果表明，这些菌株可推迟番茄青枯病发生 10治效果高达 80 %。赵健等（ 2006）通过含菌平板抑菌圈测定法从健康番茄植株内筛选到了 3株对番茄青枯雷尔氏菌有较强拮抗作用的细菌42，其中 3。胡青平等 43利用滤纸片法从番茄茎内筛选到一株对番茄青枯雷尔氏菌抑菌圈达 2.5 虽然对青枯病生防菌的筛选以及防效研究是国内外学者研究的热点，也 有不少关于青枯病生防菌的报道，在实验室内或小区试验中均有很好的抑制作用， 但目前为止生防产品由实验室向大田推广应用的并不多，生防制剂多为活菌制剂，在田间的作用体系、作用方式尚未明了，田间应用 时容易受到土壤性质、土著微生物、外界温湿度等 44种因素影响，对生防制剂的不稳定性难以解释，从而无法控制 其田间防治效果。因此，应加强生防菌作用机制的研究，探索生防菌在施用环境中与病原菌、植物的互作机制是有效发挥生防菌作用效果的必要途径。 3 生防菌定殖机制的研究进展 防菌的定殖研究进展 探究生防菌在施用过程中的定殖特性及其作用机制对于提高生防效果以更好的应用于生产意义重大。多数生防菌在实验室内有很高的抑菌活性，但是在田间应用时防治效果却不理想，这就要求研究者在研究生防菌自身理化性质的基础上，进一步研 究生防菌与病原菌的互作、生防菌与施用环境的互作、生防菌与作物的互作，以便发挥生防的更佳效果。首先生防菌能否很好的在土壤或植株中定殖是能否较好的发挥防效的关键问题。 关于生防菌定殖机制的研究国内外也有不少报道。对于生防菌在植株内的定殖研究方法也有多种。有许多学者通过抗生素平板筛选突变菌株的方法 48生福建农林大学硕士论文 3 防菌的定殖以及生防特性进行研究。龙良鲲等 48研究了抗 200 g/霉素及 100 g/福平的自发突变菌株 01番茄根茎内的定殖，胡军华等 49通过逐步提高药物浓度获得了抗 300 g/霉素的对烟草青枯病菌拮抗活性稳定的铜绿假单胞菌 对其在烟草根、茎、叶内的定殖能力进行了研究。 运用现代分子生物学技术基因标记方法 也是许多学者研究的热点。 利用标记好的生防菌接种植物，可以很直观地观察到生防菌是否进入了植物体，不同生防菌的侵染特性及其动力学、侵入部位、在宿主中的定殖部位以及在植物的整个生活史的动态变化，实现研究过程的可跟踪化。 张淑梅等 52利用黄绿荧光蛋白基因和氯霉素抗性基因标记生防枯草芽孢杆菌得到标记菌株 对该菌株在黄瓜植株各部位的定殖能力、种群动 态及其在根围的分布进行了研究。 （ 1998）以 作为选择标记，用基因枪法进行了 T. 株1295遗传转化，并以带标记基因的转化子研究了该菌在匍匐苇草根际和叶面的定殖和分布情况。 绿色荧光蛋白（ 发现为研究植物和微生物之间的关系提供了一个极为有效的技术方法 53。它不需要像免疫胶体金标记那样复杂杂的处理和 样加入底物的反应过程，而是用活体材料在激发光的作用下，用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜对 记菌株进行实时检测 54。 2000）以 导法进行了 T. 遗传转化，并用筛选出的待标记基因的稳定转化子检测了该生防菌在土壤中的定殖和生长。因其具有检测方便、荧光稳定、无毒害、可进行活细胞定时定位观察等优点 55，在研究微生物与环境、宿主相互作用、基因表达调控等方面得到广泛的应用，并展现出良好的应用前景。 稀释涂板法作为一种传统的研究方法因操作简单被广泛采用。扫描电镜和荧光显微镜也是常用的 检测工具 56,57。苗则彦等（ 2009）研究了 黄瓜内生生防菌 58，得出结论，土壤中施入的 体能够进入黄瓜根系，并可以向植株的茎、叶转移和定殖。菌体浓度对该菌的定殖数量影响很大，浓度越高，在根、茎、叶中定殖数量越高，反之则低。齐飞飞等（ 2008）将发光酶 因转移到棉花根际促生芽孢杆菌中，用根盒试验对标记菌株在棉花根际的定殖动态进行了追踪 59。 随着绿色荧光蛋白标记的应用日渐广泛，激光共聚焦显微镜也越来越广泛的应用到植物病害生物防治领域 60 2006）研究了根际同时接种致病力和无致病力镰刀菌在番茄根际中的定殖以及土壤中的分布 63，利用激光共聚焦显微镜观察到了菌体在番茄根部的定殖 。 防菌对植株生理特性影响的研究进展 植物本身就是一个复杂的生态系统，生防菌的引入会引起植物怎样的反应？促进还是抑制植物生长？这都是在生防菌的使用之前有必要探究的问题。对于生福建农林大学硕士论文 4 防菌定殖后对植株影响的报道也有不少。自从 1978 年提出根际促生细菌（ 定义以后 64，国内外相继报道了许多根际促生细菌 65，已报道的有荧光假单胞菌、芽孢杆菌 、根瘤菌等 20 多个属的的根际微生物。它们多具有促进植物生长，改善土壤和植物微生态环境，增强植物抗病性等作用 66,67。 叶绿素、可溶性蛋白含量是鉴定植物生长状态的常用指标 68,69， 植物中参与各种代谢活动的防御酶类活性的变化情况与植物抗病性关系密切 70， 氧化酶系的活性也被当作植物抗性相关因子而经常作检测指标 71,72。 关于植物生理生化各项指标的测定均有多种方法，叶绿素的测定有丙酮法、 95 %乙醇法，最常用的可溶性蛋白测定方法是考马斯亮蓝法， 紫外分析法操作简单 ，也得到不 少 学者的青睐。关于 活的测定方法最常用的分别是 创木酚法 、儿茶酚法 ，但是测量者经常根据所测样本特点而稍作改进 。 周晓慧等（ 2007）研究了甜瓜蔓枯病抗性与 性变化的关系，结果表明，抗病品种 性高于感病品种 73。 张晓鹿等（ 2008）研究了不同接种条件下辣椒疫病生防菌的定殖及其对辣椒生长以及抗性诱导的影响 74，结果表明生防放线菌与生防真菌混合接种可以提高辣椒叶片 性，而降低根系 性，至于叶片 性的提高 是否意味着抗性增强而根系 梁军锋等（ 2005）研究表明75，接种生防放线菌后，辣椒叶片多酚氧化酶 (苯丙氨酸解氨酶 (活性均会提高，对辣椒的诱导抗性有显著影响，但是该放线菌不能在辣椒根系定殖，放线菌与辣椒疫霉混合接种可促进放线菌定殖，且对辣椒叶片 性的提高幅度大于单独接种。许英俊等（ 2008）报道了 3 株放线菌对草莓的促生作用以及对 性的影响， 可以提高草莓根系 性，对增强抵抗草莓根系根区病原菌侵染有一定效果 76。 防菌对植株根际微生态影响的研究进展 根际微生态是由植物 微生物组成的一个动态变化的生态系统 77。受到多种因素的影响。而生防菌能否很好的定殖于植物根际土壤，并且与植物以及根际微生物达到一个平衡状态，是生物菌能否很好防治土传病害要考虑的一个重要因子。 张伟琼等（ 2007）研究表明，荧光假单胞菌只有在它们成功地在根际定殖后才能对抑制病害的发生真正起作用 78。 生防菌作为一种外来菌源施入土壤中很好的定殖以后又会对土壤中的微生物产生什么影响呢？ 郭志英等（ 2008）研究了 生防菌苗床接种对辣椒根域微生态及产量的影响 79，结果表明，接种生防菌后促使辣椒根域土壤中微生物类型由真菌型向细菌型转变，细菌和放线菌数量明显增加，而真菌数量减少。张昕等（ 2007）报道了引入黄瓜根围的两株生防菌株的生态效应 80，施入生防菌株对土壤中细菌福建农林大学硕士论文 5 种群数量有短期影响，随着黄瓜生育期的延长，引入生防菌土壤中细菌数量与对照持平。而处理期间，引入生防菌对黄瓜根围真菌与放线菌数量未产生明显影响。刘国坤等（ 2009）报道了淡紫拟青霉 株对根际真菌群落结构的影响 81，该菌与虾壳粉混合施用可以提高土壤真菌种群多样性。 防菌定殖土壤微生态的研究 拮抗细菌在土壤中的定殖能力与防效关系密切，而生防菌的定殖又会对土壤微生物结构群落产生怎样的影响，值得探讨。土壤理化性质