【毕业学位论文】(Word原稿)尖孢镰刀菌致病性分化及其枯萎病植物疫苗工程菌FJAT-9290的构建-应用微生物学与基因工程

分类号： 单位代码： 10389 密 级： 学 号： 1091515 福建农林大学硕士学位论文 尖孢镰刀菌致病性分化及其 枯萎病植物疫苗工程菌 建 学 科 门 类：理学 一级学科名称：生物学 二级学科名称：微生物学 研 究 方 向：应用微生物学与基因工程 研 究 生： 指 导 教 师： 完 成 时 间：二 O 一三年四月 on 2013 独创性声明 本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了 文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅 ; 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 指导教师亲笔签名： 福建农林大学硕士学位论文 i 目 录 中文摘要 . I . 一章 绪论 . 1 1 非致病性尖孢镰刀菌的研究进展 . 1 非致病性尖孢镰刀菌的生防机制 . 1 非致病性尖孢镰刀菌的筛选 . 1 从自然界中筛选非致病性尖孢镰刀菌 . 1 人工突变获得非致病性尖孢镰刀菌 . 2 非致病性尖孢镰刀菌与其他微生物结合使用 . 3 非致病性尖孢镰刀菌的应用 . 4 2 子标记技术及其应用 . 4 3 脂肪酸图谱分析技术及其应用 . 5 4 本研究的目的及意义 . 6 第二章 枯萎病植物疫苗工程菌 物学特性研究 . 7 引言 . 7 1 材料和方法 . 7 材料 . 7 方法 . 7 培养时间对植物疫苗工程菌尖孢镰刀菌 株生长的影响 . 7 营养条件对植物疫苗工程菌尖孢镰刀菌 株生长的影响 . 7 植物疫苗工程菌尖孢镰刀菌 长的影响 . 8 温度对植物疫苗工程菌尖孢镰刀菌 长的影响 . 8 葡萄糖标准曲线的制作 . 8 2 结果与分析 . 8 培养时间对植物疫苗工程菌尖孢镰刀菌 株的生长影响 . 8 菌株培养过程中菌丝干重的变化 . 8 菌株培养过程中产孢量的变化 . 9 菌株培养过程中 变化 . 9 菌株培养过程中发酵液还原糖的变化 . 10 营养条件对植物疫苗工程菌尖孢镰刀菌 长的影响 . 11 碳源对菌株生长速率的影响 . 11 碳源对菌株产孢量的影响 . 12 碳源对菌落形态的影响 . 12 氮源对菌株生长速率的影响 . 13 氮源对菌株产孢量的影响 . 14 福建农林大学硕士学位论文 氮源对菌落形态的影响 . 15 植物疫苗工程菌尖孢镰刀菌 株生长的影响 . 16 菌株生长速率的影响 . 16 菌株产孢量的影响 . 17 温度对植物疫苗工程菌尖孢镰 刀菌 株的生长的影响 . 18 度对菌株生长速率的影响 . 18 度对菌株产孢量的影响 . 19 3 讨论 . 19 第三章 尖孢镰刀菌遗传多样性 析 . 22 引言 . 22 1 材料与方法 . 22 材料 . 22 方法 . 24 菌丝的培养及 提取 . 24 （ 6） 20 保存待用。 . 24 度的测定 . 24 菌株的鉴定 . 24 引物的筛选 . 24 电泳谱带的记录及数据统计分析 . 25 2 结果与分析 . 25 菌株的鉴定 . 25 物筛选与扩增结果 . 26 供试尖孢镰刀菌聚类结果分析和遗传相似性分析 . 29 3 讨论 . 30 第四章 尖孢镰刀菌的脂肪酸生态学 . 31 引言 . 31 1 材料与方法 . 31 材料 . 31 方法 . 31 脂肪酸的提取方法 . 31 脂肪酸的检测 . 32 尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记测定 . 32 尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记聚类分析 . 32 尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记的主成分分析 . 32 尖孢镰刀菌聚类分析 . 32 2 结果与分析 . 33 尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记测定 . 33 尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记聚类分析 . 34 尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记的主成分分析 . 35 尖孢镰刀菌聚类分析 . 36 3 讨论 . 37 福建农林大学硕士学位论文 五章 枯萎病植物疫苗工程菌 生防效果 . 39 引言 . 39 1 材料与方法 . 39 材料 . 39 方法 . 39 枯萎病植物疫苗工程菌 西瓜盆栽苗枯萎病防效的测定 . 39 枯萎病植物疫苗工程菌 香蕉盆栽苗枯萎病防效的测定 . 40 2 结果与分析 . 40 枯萎病植物疫苗工程菌 西瓜盆栽苗枯萎病防效的测定 . 40 枯萎病植物疫苗工程菌 香 蕉盆栽苗枯萎病防效的测定 . 41 枯萎病植物疫苗工程菌 香蕉盆栽苗生长特性的影响 . 41 枯萎病植物疫苗工程菌 香蕉盆栽苗枯萎病防效的测定 . 42 3 讨论 . 43 结论与展望 . 45 参考文献 . 47 致谢 . 53 个人简历 . 54 福建农林大学硕士学位论文 I 中文摘要 本文比较研究了含无毒基因的非致病性植物疫苗工程菌 致病性尖孢镰刀菌 之间生物学差异，利用 子标记技术明确非致病性尖孢镰刀菌致病性菌株之间的遗传差异性和亲缘关系，探讨非致病性菌株与致病性菌 株之间脂肪酸组成和含量的相关性，以及该菌株对西瓜和香蕉的生防效果。 研究不同时间段、不同营养条件、不同培养条件下的菌株的生长特性，结果表明：在培养过程中菌株 产孢量处于 106 106 间，总体低于菌株 丝干重处于 0000间，高于菌株 株 发酵液中还原糖的含量逐渐减少，从 mg/至 3.3 mg/株化不明显；淀粉 利于菌株 丝生长，葡萄糖利于其产孢；木糖不利于菌株 丝的生长，果糖利于其产孢。有机氮为氮源菌丝生长速率快，铵盐既不利于菌丝的生长，也不利于产孢。碳源对菌落形态的影响不大，氮源对菌落形态的影响比碳源大。 时菌株的生长速率最快， 时菌株的产孢量最大。 25 时菌株的生长速率最快， 30 时菌株的产孢量最大。 采用 子标记技术对 46 株尖孢镰刀菌进行分析， 15 条引物共扩增出 165 个条带，多态率条带数为 163 条，多态率为 通过聚类分析图对尖孢镰刀菌遗传多 态性进行研究表明在 水平上，供试的 46 株尖孢镰刀菌明显分为 3 个 群。 记技术在镰刀菌种内都表现出明显的遗传差异性，非致病性尖孢镰刀菌 不含无毒基因的尖孢镰刀菌之间的遗传差异性较大、同源性较低、亲缘关系较远。 利用气相色谱技术 对 46 株尖孢镰刀菌菌株细胞内的脂肪酸，分析不同尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记的结构组成和分布特点。对 46 株尖孢镰刀菌的脂肪酸进行聚类分析，可以聚成 2 类，即类群 、类群 ；类群 分为 2 个亚类群，即亚类群 ，亚类群 ，亚类群 为非致病性菌株。表明尖孢 镰刀菌脂肪酸的结构组成和分布特性与菌株的致病性具有一定的相关性。 采用 6 种不同的处理方式，先接入非致病性尖孢镰刀菌发酵液， 7 d 后再接入致病菌的方式，生物防治效果最好。非致病性尖孢镰刀菌 香蕉盆栽苗有促长得作用，显著增加株高和叶片数，防效为 75%；对西瓜枯萎病盆栽苗的防效为 关键词 :非致病性尖孢镰刀菌；生物学；遗传多样性；脂肪酸；生防效果 福建农林大学硕士学位论文 he of to is . vr . To of . . of of . . . of In on of as of of is 106 106 mL is 0000mL of in of mg/mL .3 mg/is to of of is to is to of of is to is of is to of to a on pH , pH . 5 , 0 . 6 A 65 5 in . of . 6 . . . 6 . by of is to in . to , ; , , to of of . . is . 7 d of in of by . of 建农林大学硕士学位论文 in by 5 %. by 5 %. of of . 建农林大学硕士学位论文 1 第一章 绪论 1 非致病性尖孢镰刀菌的研究进展 尖孢镰刀菌是一种常见的土传性真菌，广泛存在于世界各地各种类型的土壤中。具有菌株的多样性，所有这些都是成功的腐生菌，即能够长期生存于土壤的有机质中和许多植物的根际。有些菌株即非致病性尖孢镰刀菌能够寄生在植株中但不致病 ,也就是说 ,在某种程度上菌株能侵入植物组织却不诱导发病；有些是致病性的菌株，造成植株根腐或维管束病变。尖孢镰刀菌存在多种专化型具有很强的寄主特异性，根据寄主植株的种类和品种，可以分为多种专化型和生理小种。尖孢镰刀菌造成植物的萎蔫，严重损害重要的经济作 物。 非致病性尖孢镰刀菌在土壤微生物生态方面起着重要的作用，特别是抑制由致病菌引起的发病。非致病性尖孢镰刀菌具有重要作用的第一个证据是土壤中含有大量的非致病性尖孢镰刀菌能够抑制枯萎病。世界不同地区的一些研究都清楚地表明非致病性镰刀菌可以抑制镰刀菌枯萎病非致病性尖孢镰刀菌 被研究得最多的菌株，该菌由是法 究中心 士研究筛选、并已成功应用的生防菌，可以有效防治由尖镰孢菌引起的多种植物枯萎病。到目前为止，非致病性的生防机制是通过比较土传性致病菌株与非致病性菌进行的 研究。 非致病性尖孢镰刀菌的生防机制 关于非致病性尖孢镰刀菌的作用机制主要包括 3 种：竞争营养成分，竞争感染部位和定植部位，诱导系统抗性。 现非致病性尖孢镰刀菌防治镰刀菌枯萎病的效果与它们竞争碳源的能力有关（ 1990）。体外无土栽培时，致病菌 F. f. 生防菌 争的主要营养成份是碳源（ 1991）。对枯萎病的控制不 是依靠接入很高浓度的非致病菌，而是要求非致病菌的数量远多于致病菌。 为非致病的镰刀菌减少芹菜枯萎病发病与根表面侵染位点的竞争有关（ 1984）。 过测定病原菌或生防菌侵入后在根部定殖的相对数量证实了这一结论（ 1991）。所谓诱导系统抗性即植物在遭受一些生物或非生物的压力时所做出的系统防御反应，非致病性尖孢镰刀菌作用于植物后，植物受到诱导，与抗病相关的酶活性显著增强，并且植物体中会产生植保素等物质。 为在番茄中非致病菌 作用机理为诱导系统抗性，与几丁质酶， 3 葡聚糖酶和 , 4 葡糖苷酶活性有关（ et 1997）。 非致病性尖孢镰刀菌的筛选 从自然界中筛选非致病性尖孢镰刀菌 由于非致病性尖孢镰刀菌在防治植物枯萎病方面有着自身的优势，所以扩大筛选机制以获得更多的非致病性菌株，提高现有菌株的生防效果极为重要。非致病性尖孢镰刀福建农林大学硕士学位论文 2 菌存在于土壤或者寄生于植物组织，所以其分离主要分为两个方面：从土壤中分离或者从植物中分离。 20 世纪 70 年代初首次在拮抗性土壤中发现了非致病性 镰刀菌，并且发现在对镰刀菌枯萎病有拮抗作用的土壤中，存在