【毕业学位论文】(Word原稿)番茄青枯病植物疫苗构建及其免疫抗病机理研究-植物病害防治

学校编号 10394 图书分类号 学 号 20091100 密 级 全日制 学术型 研究生 硕士学位论文 番茄青枯病植物疫苗构建及其免疫 抗病机理研究 of 科 专 业： 微生物学 研 究 方 向： 植物病害防治 指 导 教 师： 教授 申请学位级别： 理学硕士 论文提交日期 ： 年 月 日 论文评阅人 ： 论文答辩日期 ： 年 月 日 答辩委员会主席： 学位授予单位 ： 福建师范大学 学位授予日期 ： 年 月 日 2012 年 5 月I 中文摘要 本研究从 番茄青枯病植物疫苗 的定殖特性、诱导番茄植株免疫抗病的生理机制及植株根系土壤微生物种群结构变化等方面 来阐明 番茄青枯病植物疫苗 的 免疫抗病机理 ，主要研究内容及结果如下： 1、 对本实验室 保存的不同致病力青枯雷尔氏菌进行致病性检测和防效评价，从中找到一株防效好、定殖量大、定殖周期长，且生物学特性稳定的菌株（ 作植物疫苗 工程菌 。 研究结果表明 ， 植物疫苗 工程菌 番茄青枯病的发病率越低。 同时接种 植物疫苗 工程菌 茄青枯病的发病率最低 ， 先接种 植物疫苗 工程菌 隔 3d、 6茄青枯病的发病率较高 。 2、 植物 疫苗 工程菌 能在番茄根系土壤和植株的根部及茎部定殖，在植株的叶片无定殖。不同接种浓度的植物疫苗 工程菌 番茄植株及根系土壤的定殖量不同，接种浓度越大，其定 殖 量越大，定殖时间越长。 3、 植物疫苗 工程菌 迫接种对番茄植株株高、根系长度、根系干重影响不显著（ P但对番茄植株不同部位的抗氧化酶影响较明显。植物疫苗 工程菌 迫接种能导致番茄植株不同器官的 活性总和显著高于对照植株，并且在胁迫处理植株与对照植株之间， 4、 接种植物疫苗 工程菌 改变根系土壤微生物种群结构和含量， 迫 处理后 ，不同作物根系土壤微生物总量均比对照组高 ， 不同作物根系土壤 的磷脂脂肪酸生物标记（ 类群变化均可分为下降型、无变化型、上升型 。 进一步分析表明，接种 株 能改变 不同作物 根系土壤微生物群落结构，促进细菌和真菌的生长，抑制放线菌的生长 。 植物疫苗 工程菌 理能提高 丝瓜 、番茄、 芹菜 根系土壤的 数 值，降低 茄子 和 辣椒 根系土壤的 数 值；提高 番茄 和 芹菜 根系土壤的 数 值，降低 茄子、辣椒和 丝瓜 根系土壤的 数 值；降低这 5 种作物根系土壤的 数值 。 5、 不同根际提取液对植物疫苗 工程菌 长能力的影响不同 。番茄、辣椒、粉蕉的根系提取液对 长有促进作用，而韭菜对 长具有抑制作用。光谱扫描分析表明，辣椒和粉蕉 的根际提取液处理 32h 后， 在 波长260 280无核酸和蛋白质的特征吸收峰，而番茄和韭菜在 250段一吸收肩峰。 观察比较发现不同根际提取液处理下植物疫苗工程菌 菌落形态和弱化指数菌均无出现明显差异。 关键词：植物疫苗，定殖，防御酶系统，土壤微生物，根系提取液 he of of of as 1、 to as a of at of at d d 2、 in of of to of in 3、 of by of OD at of in in OD 4、 to of in by of V in be in to of of of of nd of of of of 5、 of of 2 of 60 nm 80nm to a in 50of of by 中文文摘 细菌性青枯病是一种由青枯雷尔氏菌引起的 土传 病害，该菌寄主 范围 广， 可侵染 54 个科的 450 余种 作 物，严重影响了 许 多重要经济作物 生长 ，对农业 生产 造成重大的经济损失。 目前防治 作 物青枯病主要采用化学防治，但 尚无理想的 化学防治药剂，且化学防治 污染环境， 容易 使病原菌 产生抗性。利用 青枯雷尔氏菌的 无致病力菌株作为植物疫苗防治 作物 青枯病具有对环境无污染，有益人畜安全、不易产 生抗性等优点， 近年来广泛受到植物病 害 研究者的重视。 国内外在利用生防因子防治青枯病方面开展了大量工作，并获得了令人欣喜的防治效果。 但对 无致病力青枯雷尔氏菌诱导植株产生抗性达到免疫保护作用方面的研究相对较少。 无致病力青枯雷尔氏菌诱导植株抗病机制研究，对了解病原菌与植株的互作方式、阐明植株系统性获得抗性的机制、提高青枯病生物防治水平等均具有重要的理论和现实意义。 本研究从 番茄青枯病植物疫苗 的定殖特性、诱导番茄植株免疫抗病的生理机制 及 诱导植株根系土壤微生物种群结构 变化等方面 来 阐明 番茄青枯病植物疫苗 的 免疫抗病机理 ，主 要研究内容及 结果如下 ： 1、 对本 实验 室保存的不同致病力青枯雷尔氏菌进行致病性检测和防效评价 ，从中找到 一株防效好、定殖量大、定殖周期长，且生物学特性稳定的菌株 （ 作植物疫苗 工程菌 。 （ 1） 比较 植物疫苗 工程菌 不同接菌浓度 （ 1108、1107、 1106、 1105、 1104对 番茄青枯病生防效果的影响 ； （ 2） 比较先 接种 植物疫苗 工程菌 同间隔时间（ 0d， 3d， 6d）接种致病性青枯雷尔氏菌 （ 番茄青枯病生防效果的影响 。 确 定 植物疫苗 工程菌 佳 接种 浓度和最佳 接种 时间，为 番茄 青枯病植物疫苗的 应用提供理论基础 。 研究结果表明， 植物疫苗 工程菌 接种浓度越大， 番茄青枯病的 发病率越低。 当 工程菌 种 浓度小于 1106，番茄青枯病的 发病率较高 ，接种浓度为 1108， 番茄青枯病的 发病率最低， 致病性青枯雷尔氏菌理 25d 后发病率 为 40%。 植物疫苗 工程菌 致病性青枯雷尔氏菌 不同间隔时间接种结果表明 ，同时接种 工程菌 菌株番茄青枯病的发病率最低 ， 先接种 工程菌 隔 3d， 6d 再接种菌株 茄青枯病的发病率较高， 致病性青枯雷尔氏菌 理 25别为 85%、 90%、 100%。 、 判断筛选的生防菌株生防能力如何，最重要的是其能否在寄主植物根围及植株体内定殖。 本研究 比较分析不同接种浓度（ 104、 106、 108 植物疫苗 工程菌 不同苗龄（ 2 5期 ）的番茄植株及根系土壤的定殖情况。结果表明 ：（ 1）植物 疫苗 工程菌 能在番茄根系土壤和植株的根部及茎部定殖，在植株的叶片无定殖。（ 2） 不同接种浓度的植物疫苗 工程菌 番茄植株及根系土壤的定殖量不同，接种浓度越大，其定 殖 量越大，定殖时间越长。当 植物疫苗 工程菌 种浓度为 104在番茄植株体内的定殖时间只有 12d， 且只在植株根部定殖，在茎和叶均无定殖。 当 植物疫苗 工程菌 06 108 ，其在番茄植株体内的定殖时间 可达 18d。（ 3）当接种浓度为 106， 接种的番茄植株苗龄越小， 工程菌 番茄植株及根系土壤的定殖量越大。 3、 本研究以 植物 疫苗 工程菌 为外源微生物胁迫接种番茄植株，接种后于不同时间取样分析番茄植株株高、根系长度、根系干重及植株不同器官（根、茎、叶）的防御酶系 性动态变化。结果表明， 植物 疫苗 工程菌 迫接种对番茄植株株高、根系长度、根系干重影响不显著（ P但 对番茄植株不同部位的抗氧化酶影响较明显。 植物 疫苗 工程菌 迫接种能导致番茄植株不同器官的 活性总和显著高于对照植株，并且在胁迫处理植株与对照植株之间， 活性变化动态也有所不同。这说明， 植物 疫苗 工程菌 接种可提高植株对病原物入侵的防御能力。 4、 青枯病 的 发生与植株根系土壤微生物群落结构关系密切， 本文 引入 磷脂脂肪酸（ 生物标记分析 植物 疫苗 工程菌 迫对不同作物 （茄子、 辣椒、丝瓜、番茄、芹菜 ） 根系土壤微生物群落 结构的影响，从生态学角度揭示 植物疫苗对作物青枯病的 免疫抗 病 的机理，为青枯 病植物 疫苗的研发提供理论依据。研究 结果表明 ： （ 1） 植物疫苗 工程菌 迫 处理后不同时间， 从 茄子、辣椒、丝瓜、番茄、芹菜根际土壤 分别测得 48、 58、 59、 58、 50 种 2） 植物疫苗工程菌 迫 处理后， 不同作物根系土壤 群 变化均分为 下降型、无变化型、 上升型 ，其中 在下降型的 化类群 中 ， 茄子、番茄、芹菜根系土壤微生物 成 16:0 含量 下降 最大 分别 达到 该标记指示假单胞菌 ； 辣椒、 丝瓜 根系土壤微生物 成 19:0 含量 下降 最大到 该标记指示细菌 ； 在无变化型的 化类群 中 ， 番茄根系土壤 包含 、 H、 3 I、 G、 317:0 38:1 6c 等脂肪酸标记； 为上升型的 化类群 中， 其 脂肪酸标记均包含指示放线菌的生物标记 10 和 10， 这两个标记在 茄子、辣椒、丝瓜、番茄、芹菜根际土壤 的 平均含量 分别 增加 （ 3）植物疫苗 工程菌 迫 处理后， 茄子、辣椒、丝瓜、番茄、芹菜根际土壤的 量 、指示细菌的 、指示真菌的 均比对照组高，指示放线菌的 比对照组低，说明 理 能够促进作物根系土壤细菌和真菌的生长，而抑制放线菌的生长 。（ 4）比较分析 植物疫苗 工程菌 迫处理对 茄子、辣椒、丝瓜、番茄、芹菜根际土壤 的微生物群落多样性的影响， 结果表明， 理能提高 丝瓜 、 番茄、 芹菜 根系土壤的 数 值，降低茄子 和 辣椒 根系土壤的 数 值； 同时 提高 番茄 和 芹菜 根系土壤的 ，降低 茄子、辣椒 和 丝瓜 根系土壤的 数 值； 此外能 降低这 5 种作物根系土壤的 数值 。 5、 微生物在植株的侵染定殖能力与 植株 根系分泌物关系密切 ，不同作物的根系分泌物对生防菌的定殖能力的影响存在差异。 本 研究提取 番茄、辣椒、粉蕉 和 韭菜根系提取液 ，分析其对 植物疫苗 工程菌 长特性的影响。结果表明： 不同根际提取液对 植物疫苗 工程菌 长能力 的 影响不同 。番茄、辣椒、粉蕉的根 系 提取液对 植物疫苗 工程菌 长 有促进作用，而韭菜对 工程菌长具有 抑制 作用 。 光谱扫描分析表明 ， 辣椒和粉蕉的根际提取液处理32h 后，在波长 260 280无核酸和蛋白质的特征吸收峰， 这可能和发酵液组分中蛋白质的含量较低有关 ； 番茄和韭菜处理液在 250段有一吸收肩峰。观察发现不同根系处理液处理下菌株的菌落形态和弱化指数菌均无出现 明 显差异。 植物疫苗工程菌 和致病力菌株 都 来自植株 ，对环境安全，筛选无致病青枯雷尔氏菌作为植物疫苗 工程菌 防治青枯病是青枯病生物防治的重要内容，对作物具有较好的防效，具有一定的生防潜能。随着现代生物科技的发展以及各学科之间的相互借鉴和渗透，相信在不久的将来即可研制出能在田间对作为青枯病有长期控制的效果的植物疫苗。今后将在青枯病免疫抗病机理的研究及茄科作物青枯免疫接种剂的研究与应用做更深入的探索。 录 中文摘要 . I . 文文摘 . V 第一章 引言 . - 1 - 茄青枯病及其生物防治研究 . - 1 - 茄青枯病病原菌的致病力分化 . - 1 - 茄青枯病的致病机理 . - 2 - 茄青枯病 的生防途径 . - 2 - 茄青枯病生物防治机制的研究 . - 4 - 防菌定殖的研究进展 . - 4 - 防菌对植株防御酶系统的研究进展 . - 5 - 防菌定殖土壤微生态的研究 . - 5 - 系提取液对生防菌的研究 . - 6 - 茄青枯病植物疫苗研究及其应用前景 . - 6 - 研究的目的及意义 . - 7 - 第二章 番茄青枯病植物疫苗工程菌的筛选 . - 8 - 言 . - 8 - 验材料 . - 8 - 验方法 . - 9 - 茄青枯病植物疫苗工程菌的筛选 . - 9 - 茄青枯病植物疫苗工程菌的接种浓度对番茄青枯病防效的影响 . - 9 - 茄青枯病植物疫苗的接种时间对番茄青枯 病防效的影响 . - 10 - 茄青枯病植株病原菌的 的分离及鉴定 . - 10 - 验结果 . - 11 - 茄青枯病植物疫苗菌株的筛选 . - 11 - 茄青枯病 植物疫苗工程菌 接种浓度对番茄青枯病防效的影响 - 13 - 茄青枯病 植物疫苗工程菌 接种时间对番茄青枯病防效的影响 - 14 - 验获得番茄青枯病植株病原菌的 的鉴定 . - 15 - 论 . - 16 - 三章 植物疫苗 工程菌 番茄植株的定殖特性 . - 17 - 言 . - 17 - 验材料 . - 17 - 试菌株 . - 17 - 养基 . - 17 - 试番茄 . - 17 - 验方法 . - 17 - 液的制备 . - 17 - 物疫苗工程菌 番茄植株不同部位的定殖数量 . - 18 - 物疫苗工程菌 番茄不同生长期的定殖数量比较 . - 18 - 壤青枯雷尔氏 菌的分离 . - 18 - 株体内青枯雷尔氏菌的分离 . - 18 - 株体内分离的青枯雷尔氏菌的分子鉴定 . - 19 - 果与分析 . - 19 - 物疫苗工程菌 番茄植株不同部位的定殖数量 . - 19 - 物疫苗工程菌 番茄不同生长期的定殖数量比较 . - 20 - 株体内分离的青枯雷尔氏菌的分子鉴定 . - 23 - 论 . - 24 - 第四章 植物疫苗对 番茄青枯病 免疫抗病的生理机制 . - 26 - 言 . - 26 - 试验材料 . - 26 - 试菌株 . - 26 - 养基 . - 26 - 试番茄 . - 26 - 试验方法 . - 26 - 植物疫苗 工程菌 迫接种 和取样方法 . - 26 - 生物指标测定 . - 27 - 酶活性的测定 . - 27 - 据统计分析 . - 27 - 结果与分析 . - 27 - X 植物疫苗胁迫对番茄植株生长的影响 . - 27 - 植物疫苗胁迫对番茄植株抗氧化酶系活性的影响 . - 28 - 讨论 . - 32 - 第