【毕业学位论文】（Word原稿）固氮斯氏假单胞菌A1501铵转运基因amtB的结构分析和功能研究微生物学硕士论文

密级 : 论文编号 : 中国农业科学院 学位论文 固氮斯氏假单胞菌 转运 基因 结构分析 和 功能研究 of in 1501 of in 1501 1 要 固氮斯氏假单胞菌（ 一株分离自水稻根际的联合固氮细菌，属变形细菌亚族。铵转运基因（ 生物体细胞内外氮素平衡重要基因， 而 铵又处于整个同化代谢的中央位置，因此详尽研究该基因对于固氮作用以及调节机制研究有重要意义。 通过对其全基因组序列分析、设计两对引物，经 1501中扩增出 2684过序列比对和 列比较后确定包含 整 基因，并且确定该菌含有两个紧密连锁的铵载体基因为 别包含 12 和 11 个跨膜结构域。并且在两个基因之间无启动子和终止子序列，利用 法证实了这一结果。 本研究从野生型 取细菌总 分别克隆 分片段， 连接 到自杀质粒载体 ，通过三亲接合 与 野生菌 行同源单交换，经过抗性筛选获得了 性突变株 、非 极性突变株 以及 极性突变株 ，分别命名为 性突变株 ， 变株， 变株。 在 高铵 条 件下测定 细胞 生长曲线发现， 所有 突变株 相对于野生菌 生长 表型 没有什么差异，但是在低铵浓度下， 性突变株 相对于野生菌 平板显示出生长缓慢，而两个 非极性突变 野生菌 似。测定铵吸收实验中发现，突变 株 野生菌胞外铵浓度下降趋势相似，而 性突变株 胞外铵浓度基本保持不变，证明 两个铵载体基因突变的确影响 细胞 的转运能力。接下来生理实验测定结果显示： 在菌株生长到 稳定 期后， 有一定泌铵能力。当 何基因的突变后，并未影响到固氮酶活 性 ，但是在固氮条件下，铵 激后极性突变株 的表型特征与其它菌株不一致，仍能保持比较高的固氮酶活 性 ，而 非极性突变 和野生菌基本丧失固氮酶活 性 。 将 极性突变株 野生型 种水稻，研究水稻光合作用和固氮作用之间的互作。结果表明：施用固氮菌后，对水稻有明显的促生作用，但突变株在根表竞争能力明显强于野生型，所占菌数总量的 74%。并且接种后的水稻，无论在株高以及根系发达的程度均强于野生菌株，表现出明显促生作用。 通过利用 整基因互补 性突变株 ，利用抗性筛选获得组成性表达质粒 ,命名为定生长曲线，泌铵能力 以及固氮酶活后发现，表型特征与野生型 似，说明铵转运基因突变的确是影响细菌铵的转运能力，影响到了细胞内外氮素平衡。 关键词 ： 斯氏假单胞菌 固氮， 铵转运基因，极性突变，非极性突变 1501, of is an a in in to of of A 2684 NA CR by no of of 2 1. B2 by or of or CR or 1501 by on at of 1501 at of at of B1 B2 1501, of in in up to in no on of at of in on by to 1501, 4% of of 1501. us to in 1501, 录 第一章 文献综述 . 1 言 . 1 物固氮的遗传工程 . 1 氮遗传工程的研究概述 . 1 氮基因表达调节机理的研究进展 . 2 同化代谢 . 3 转运系统 . 4 转运 . 4 载体 基因分布 . 4 载体蛋白 . 5 转运系统 . 5 载体基因 究进展 . 8 式菌株大肠杆菌的 运机制研究进展 . 9 表性模式菌株菌株的 结构和功能研究 . 10 生固氮 菌 纵子的特征和功能研究 . 10 合固氮菌 征和功能研究 . 11 白可以作为模式系统理解铵转运 . 13 题依据 . 15 术路线 . 16 第二章 铵转运基因 基因克隆以及结构预测 . 17 养基与抗生素 . 17 用的菌株 . 17 15 限制性培养基 . 17 、试剂及试剂盒 . 18 隆 整基因所用的引物 . 18 法 . 18 1501 菌株基因组 分离 . 18 . 19 物的纯化 . 19 切及连接反应 . 19 脂糖凝胶中 段的回收 . 20 效率转化感受态细胞的制备、转化 . 20 裂解法小量提取细菌质粒 . 21 果与分析 . 21 因完整序列的克隆 . 21 转运载体蛋白结构预测 . 23 论 . 25 第三章 铵转运载体基因 功能研究 . 26 料与方法 . 26 株和质粒 . 26 引物 . 26 验方法 . 27 提取 . 27 增反应 . 28 性突变株 段与 非极性突变株 段的克隆 . 28 构建 . 28 体和目标片段的连接 . 29 受态细胞的制备 . 29 接产物转化感受态细胞 . 29 粒的接合转移 . 29 组质粒的 测 . 30 生型与突变株生长曲线的测定 . 30 酚蓝比色法测定 度 . 30 株生长曲线的测定 . 30 株固氮活性测定 . 31 蛋白的测定 . 31 果与 分析 . 32 性突变株的构建 . 32 性突变株 理化特性 . 33 因整合突变株的构建 . 35 因整合突变株的 证 . 35 极性突变株的验证 . 37 因表达质粒 构建 . 37 因表达质粒 构建过程 . 38 变株的表型检测 . 39 论 . 43 第四章 结论 . 44 附录 1 突变株和野生菌株定殖能力的初步研究 . 45 验材料 . 45 株 . 45 养基 . 45 验方法 . 45 稻根表定植试验 . 45 果和分析 . 46 变株根表定殖的平板记数 . 46 性突变株与野生型在根表竞争比较 . 46 性突变株与野生型对水稻接种效应 . 47 附录 2 . 49 附录 3 . 51 参考文献 . 53 致谢 . 60 作者简介 . 61 V 英文缩略图 缩略词 英文名称 中文名称 p m 1501 氮斯氏假单胞菌 转运载体 乙炔还原活性 邻硝基 氨卞青霉素 四环素 卡那霉素 氯霉素 bp 基对 血清白蛋白 代十六烷基三甲胺 氧核糖核苷酸 EB 化乙锭 丙基硫代 养基 钟 合酶链式反应 分钟转速 二烷基磺酸钠 4 3中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 言 21 世纪 30 年代我国人口将达到 16 亿，年需粮食 (按人均 400算 )吨，每收获 1 吨粮食约投入 100素，总计需尿素 6400 万吨，为了满足 2030年对氮肥的需要，至少还要新建年产 30万吨尿素厂 300 座 这不仅投资巨大 (约千亿元 )（卢嘉锡 ,2001） ，而且消耗不可再生的化石能源和污染大气。世界人口剧增给土地造成了巨大的压力，人类必须从同样甚至不断减少的耕地上生产更多的粮食才能维持自身的生存。增加粮食产量，肥料 是必不可少的条件，在氮、磷、钾三要素中氮素是最常见的不同作物生长所需的限制性营养元素。化学合成肥料是重要的肥料来源，发展中国家从 1950年到 1990年间所经历的农业产量上的“绿色革命”就是源于 10倍量的化学合成氮肥的投入。在发展中国家，尤其在中国，农业生产中过量的依赖化肥已造成严重不良后果，大量和超量使用化肥造成土壤结构破坏，生态环境污染，随化肥的使用每公斤的投入增加产量年递减率达 为了避免“地不出产”的最终局面形成，发展可持续性的农业势在必行，加强生物固氮的研究和应用是可持续农业发展中的一重要举措 。生物固氮可为农作物提供氮素，与化学肥料相比，生物固氮不降低土壤生产力，不污染环境，而且是取之不尽，用之不竭的廉价氮源。目前，世界其它国家同样面临着能源、粮食、人口和环境等问题，因而生物固氮的研究倍受世人的关注，随着社会经济和科学技术的深入发展，生物固氮研究已日新月异。 物固氮的遗传工程 氮遗传工程的研究概述 遗传工程是用人工的方法去改变生物的遗传特性或 按照 人们的意愿去创造新的物种。近十多年来，固氮遗传工程的兴起为研究生物固氮开辟了美好的前景。遗传工程发源于分子生物学和微生物学、而自 然界有生物固氮能力的生物只限于极少数低等的原核微生物 (细菌和蓝藻 )，微生物学中的基因重组和细胞融合等遗传操作新技术为改造生物提供了强有力的手段。对于固氮微生物来说，固氮基因（ 纵和调节固氮酶（ 合成， 使得 固氮微生物具有固氮作用。如果将固氮基因进行人工转移，就可能获得具有固氮作用的新物种。在这一领域人们已进行了大量的研究，进展显著。固氮基因已经能够在原核生物界细菌之间转移，例如，已能将肺炎克氏杆菌的固氮基因转移到大肠杆菌中去。因此，有的学者预言，玉米结瘤固氮可望在 21世纪初成功 ，水稻的固氮也有成功的可能。美国科学家估计，今后 20年内，生物工程可能使粮食作物产生自身固氮能力，从而可节约生产氮肥投资的 90以上 （黄中， 2000） 。 目前，对固氮根瘤菌及其宿主植物的基因组、功能基因组和蛋白质组研究工作正在蓬勃开展，在一个新的层面上认识生物固氮及其与之相关的微生物与高等植物相互作用机理，必将取得新的突破。重组苜蓿根瘤已构建成功，并作为第一个可提高固氮效率的基因工程根瘤菌肥而投放到国际市场；与粮食作物联合固氮的固氮螺菌的固氮调控机制研究也已逐步明朗，为构建铵阻遏条件下也能固氮的基因工程菌株 打下了理论基础。最近，对以苜蓿根瘤菌为代表的模式菌株的基因组工作已经完成，对其功能基因组学研究也刚刚兴起，这必将在一个新的层次上揭示根瘤菌与宿主中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 植物相互作用机理。我国科学家在深入研究在调节基因（ 表达及其产物（ 性调节机制的基础上，构建了携带有能组成型表达（不受铵阻遏） 粒，将其引入阴沟肠杆菌和大豆根瘤菌后，其固氮作用不再受铵抑制，用此基因工程菌接种水稻和大豆可获得增产。近年来，开展了我国特有的华葵中生根瘤菌（紫云英根瘤菌）的结瘤固氮基因表达调节的研究，最近，发现了微生物体内碳 代谢与固氮及氮代谢的基因表达调节之间，存在着偶联关系。这一发现不仅对生物固氮调控有重要意义，也是对基因表达调控的基础研究中的一项重要贡献。它为进一步研究光合和固氮之间的联系，提供了理论基础。另外，培育具有氢酶的固氮微生物的研究也在进行，因为如果固氮微生物体内具有氢酶，可以吸收氢产生的能量。这样，就能提高其固氮效率而增加产量。可见，生物固氮遗传工程的研究，不仅有科学意义，而且有重要的实用价值。 氮基因表达调节机理的研究进展 生物固氮是指某些种类的原核生物可利用体内的固氮酶将空气中的氮气还原为氨的 过程。迄今为止生物固氮现象仅在原核生物的细菌和古细菌中存在。可进行生物固氮的微生物种属范围分布比较广泛，包括厌氧、兼性厌氧和好氧微生物。其固氮作用方式又可分为自生固氮、联合共生固氮和共生固氮等。虽然固氮微生物种类较多，分布广泛而且作用方式多样，但是其固氮作用的基础都是一类大型的金属酶蛋白复合物 固氮酶。研究的最多的是来自以下微生物的固氮酶：棕色固氮菌 氏固氮梭菌 炎克氏杆菌 深红红螺菌 固氮蓝藻菌 7120及 大豆慢生根瘤菌 生的根瘤菌是农业上最为重要的固氮菌，而自生固氮菌和联合固氮菌对固氮酶机制的研究最具科学意义。 目前公认的生物固氮的理想计量式为： H+8622+166上式可见，每还原 1 分子的 时放出 1 分子 消耗 8 个质子、 8 个电子和 16 分子的 一个非常耗能的过程。固氮 酶按照这一反应在常温常压下即可将 原为 同一过程在人工条件下需 300 500的高温和 300 个大气压以上的压力才能实现。对这种耗能反应，固氮菌必然具有一套相应的调节系统，以对各种环境因素做出反应，从而最大限度地节省自身的能量。因此对固氮酶的表达调控机制的研究兼有应用和理论两方面的意义。 目前已鉴定出四种固氮酶体系（ et 2001），其中三种固氮酶体系非常相似，差别在于其活性中心原子簇含有钼，钒或仅含有铁， 分别叫作钼铁固氮酶，钒铁固氮酶和铁铁固氮酶。第四种固氮 酶体系是最近从 放线菌 分离的依赖超氧化物歧化酶的固氮酶，此固氮酶体系非常独特。 钼铁固氮酶是最为普遍的一类固氮酶体系，钒铁固氮酶和铁铁固氮酶只在某些固氮微生物中和特定的条件下才能形成并起作用。在本 论文 中的叙述中，若非特别指出，所提固和氮酶即是指钼铁固氮酶。 根据固氮生物与植物之间的相互关系，通常将自然界中存在的固氮体系分为自生固氮、共生固氮和联合固氮三种。 (1)自生固氮菌：指各种自由生活、能独立固定大气氮的原核生物，包括多种生理类型的种类 。迄 今为止，共有 5 种自生固氮菌的固氮基因组成已基本研究清楚，包括 国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 褐球固氮菌 成团肠杆俊 固氮分子调节方面，以 究得最清楚，成为研究固氮作用的模式菌株。 (2)共生固氮菌：指必须与它种生物共生时才能固氮的原核微生物。包括与豆科植物共生结根瘤的根瘤菌属 (与非豆科植物共生结根瘤的弗兰克氏菌属 (线菌以及与地衣共生的鱼腥蓝细菌属 (。 对共生固氮菌的研究已有 100 多年历史，然而对其固氮遗传学方面的了解远不如自生固氮菌清楚。目前有三种共生固氮菌的固氮基因组成及相应固氮调节研究得较多（ 1994）： 苜蓿根瘤菌 耐氧田菁茎瘤菌 (3)联合固氮菌：指必须生活在植物根际、叶面或动物肠道等处才能固氮的原核生物。包括在热带植物根际固氮的固氮螺菌属 (及在叶面固氮的拜叶林克氏菌属 (。所有的固氮菌都有固氮酶，在有氧障保护的严格厌氧微环境中进行固氮。生物固氮对全球生物圈的存在、繁荣与发展极端重要，对人类的生存和农业增产也有极其重要的作用。 联合固氮菌与非豆科作物和牧草的根际有密切的关系，它们定植于根表，但不形成特异化结构，其实他们大多也是属于自生固氮菌的范畴， 其中包括 （ 1983; 1976; et 1988; et 1986）。 联合共生固氮中研究的最早以及最多的为固氮螺菌（ 该菌是 际分离得到的。 源性分析以及生理生化特征等将立为新的种属，命名为 et 1978）。由于固氮螺菌分布广泛，可与许多禾本科植物联合固氮，提高作物产量，如玉米，水稻和小麦等，又能产生植物生长激素，增强植物的抗逆性，因此成为最后重视的联合共生固氮菌。人们对它的形态、分类、生理生化、遗传、生态、与植物的关系以及田间的应用等方面作了大量的工作，并取得了一些进展（ 981， et 1991；et 1995；