【毕业学位论文】（Word原稿）棉花arf1启动子表达的特异性生物化学与分子生物学研究硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士 学位论文 棉花 动子表达的特异性研究 国农业科学院硕士学位论文 摘要 I 摘 要 虫转 基因 植物 己经 在生产上 广泛应用 。 杀虫基因在植物体内定时、定量和定点表达来增强抗虫效果，这是第二、三代植物抗虫基因工程研究及生物安全 所关注的重要 内容。启动子在基因表达调控中起关键性作用，它在很大程度上决定目的基因表达的时间、空间和强度。目前，植物基因工程广泛应用的启动子是组成型启动子，它们驱动外源基因在植物各种组织和所有发育阶段表达，这无疑增加了植物的代谢负担，并造成物质和能量 的浪费，往往还会引起植物形态发生改变，甚至影响植物生长发育。因此，本研究 对本 实验室分离到的棉花 (因启动子的功能 进行鉴定 ， 尝试在 棉花抗虫基因工程 研究中应用 。 本研究 所 构建 的 植物表达载体 A） 携带棉花 动子驱动 因的表达盒 ； 植物表达载体 B） 含有两个 因的表达盒，分别由 动子和棉花 动子驱动。 对照载体 携带 动子驱动 因的表达盒 。 将 A、 B 及 个 植物表达载体利用根癌农杆菌介导法 分别 导入烟草，经过卡那霉素筛选，最终得到再生植株 231 株。 转对照 载体的烟草再生植株为 68 株，载体 A 的烟草再生植株为 61株，载体 B 的烟草再生植株为 102 株。利用 法对阳性植株不同部位进行 虫晶体蛋白表达量测定。在烟草的蒴果中， A 系的表达量是 的 ， B 系的表达量是 的 烟草的蒴果壳中， A 系的表达量是 的 ， B 系的表达量是 的 ；在烟草的花瓣中， A 系的表达量是 的 ， B 系的表达量是 的 ；在烟草的叶中，A 系的表达量是 的 ， B 系的表达量是 的 。结果表明 动子驱动外源杀虫基因在烟草的蒴果、蒴果壳、花瓣中的表达比对照 显著提 高，而在叶中较低。并且 发现这两个启动子在功能上可叠加 。 进一步 将 上述三种植物表达载体用花粉管通道法导入陆地棉品种 ，共获得 通过卡那霉素进行筛选和 定，得到转对照载体的 转基因植株 10 株， A 系 4 株， B 系 3 株； 在 获得 A 系转基因植株 19株， B 系 8 株。并用 法 对 阳性植株 幼 蕾 及叶中杀虫蛋白的表达 进行了初步检测， 结果表明，不同植物表达载体的杀虫基因在棉花中的表达情况比较复杂，与烟草中的情况不完全一致，但数据清晰表明由 动子驱动杀虫基因表达的 A 转基因株系的幼蕾中，杀虫蛋白的表达量显著高于对照 。 本研究分析 了 动子在烟草 及棉花中表达的特异性 ， 验证了该启动子在植物生殖器官中具有优势表达特性， 为 动子应用于转基因抗虫棉研究，在棉花蕾铃中优势表达杀虫蛋白，针对性提高转基因棉花中蕾铃抗虫性的 新一代抗虫棉研究奠定了基础 。 关键词 : 动子，烟草，棉花 ，抗虫 中国农业科学院硕士学位论文 摘要 t t in or in is an in t t a to s or in is in in of of in t of a is (s in In ） by ） by K） , is in 、 B K 231 68 by K, 61 by 02 by . t in In t .5 .4 K In .5 .9 K In .4 .5 K In .3 .4 K s in in In we in we , B K 18 13 by We 0 18 30 CR 17 CK 0 A 32 13 19 by by . we t 国农业科学院硕士学位论文 摘要 in in in in by K of in in we be in of t t in 国农业科学院硕士学位论文 目录 录 第一章 绪 论 .基因抗虫棉研究进展 1 要抗虫基因及应用 1 t 杀虫蛋白及其基因 1 因 4 虫棉研究存在的问题 4 望 6 动子研究进展 . 概述 9 动子的一般结构 10 物启动子的分类和应用 13 动子的选择和改造 17 苷酸核糖基化作用因子 1（ 究进展 18 物遗传转化研究进展 20 物遗传转化方法 20 物遗传转化存在的问题与对策 23 基因植物的检测技术 24 基因整合状况的检测 24 源基因表达特征的检测 25 研究的目的、意义及研究方案 27 研究的目的、意义 27 究方案 27 第二章 动子驱动的杀虫基因植物表达载体构建 料与方法 . 试验材料 29 法 30 果与分析 . 基础质粒的酶切图谱及鉴定 33 粒载体的构建及其鉴定 36 结 .三章 烟草的遗传转化及杀虫基因表达分析 料与方法 . 材料 42 法 43 果与分析 . 烟草外植体的转化及再生植株的获得 50 生植株的 测 53 生植株的 交鉴定 58 源蛋白的 量检 测 58 结 .国农业科学院硕士学位论文 目录 V 第四章 利用 动子驱动外源杀虫基因在棉花中的表达分析 . 材料 74 法 75 果与分析 . 花粉管通道法转化棉花 79 转基因后代筛选 80 性植株的 测 80 虫蛋白的 量检测 82 结 .五章 讨论和结论 论 . 植物基因工程研究中启动子的选用 86 动子和 动子的协同作用 86 同转基因植株间基因表达的差异及处理办法 87 用 动子的抗虫棉研究 87 论 .研究的创新点 8 8 参考文献 . 谢 .者简历 国农业科学院硕士学位论文 缩略词表 略词表 苷酸核糖基化作用因子 1 35S P 5S 椰菜病毒 35S 启动子 云金芽孢杆菌 胞溶解性蛋白基因 苄青霉素抗性 那霉素抗性 硫酸链霉素 鱼碱合成酶基因终止子 I 霉素磷酸转移酶基因 光值 合酶链式反应 乙二醇 二烷基磺酸钠 联免疫吸附测定 苯二胺 基质结合区 支架附着区 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪 论 转基因农作物的产业化已成为 21 世纪可持续农业的重要发展方向之一。中国是世界上最大的棉花生产国和消费国。随着世界棉花贸易状况的改变和我国经济发展的现状 ， 作为重要的农产品和战略物资 ， 我国棉花生产得到了国家的高度重视。但通过传统育种解决棉花病虫害问题以及追求更好品质和更好产量却很难取得较大的突破 ， 因此其基因工程研究倍受瞩目。转基因 抗虫棉的成功研制和产业化 ， 是中国棉花生产的一个里程碑（郭三堆 ， 1995；崔洪志等 ， 1996）。转基因棉花是我国目前唯一大规模种植的转基因 农 作物 ， 到 2005 年占棉花总种植面积 的 60%以上。近年来 ， 大量文献报道转 因棉对棉铃虫的抗性呈时空动态变化。研究者普遍认为其根本原因是 因表达强度在不同器官中存在差异 ， 营养器官高于生殖器官。而到棉花生育后期棉铃虫主要危害棉花的蕾铃 ， 则是造成转基因抗虫棉在生育后期对棉铃虫抗性下降的主要原因之一。因此 ， 如何调控 因在花蕾等生殖器官中的表达强度是转基因抗虫棉研究所面临的重要问题。 本论文的主要研究内容是应用棉花蕾铃优势表达的 动子驱动外源杀虫基因 尝试获得后期抗虫性不下降的新一代转基因抗虫棉。下面对 相关研究领域的国内外研究现状分别进行简要综述。 基因抗虫棉研究进展 要抗虫基因及应用 目前用于植物抗虫基因工程的基因主要包括：（ 1）毒蛋白基因：如苏云金芽孢杆菌（ 虫晶体蛋白（ 因 （ 郭三堆 ， 1995）； （ 2）蛋白酶抑制剂（ 因：如豇豆（ 蛋白酶抑制剂（ 因等（ 郭三堆等 ， 1999）；（ 3）淀粉酶抑制剂（ 因：如菜豆（ 淀粉酶抑制剂基因 i 等 （ et 1990） ； （ 4）植物外源凝集素（ 基因：如雪花莲外源凝集素（ 因 （ et 1995）；（ 5）昆虫特异性神经毒素（ 因：如蝎 毒素基因 胡延章等 ， 2000）。迄今为止在棉花抗虫基因工程研究领域 ， 最成功的基因是虫基因 ， 其次 因。 t 杀虫蛋白及其基因 述 苏云金芽孢杆菌（ 毒素晶体蛋白基因 ， 克隆于苏云金芽孢杆菌。 苏云金芽孢杆菌 （ 是一种革兰氏阳性菌 ， 分类上属原核生物 ， 细菌纲 ， 芽孢杆菌科 ， 芽孢杆菌属 ， 广泛存在于土壤、尘埃、水域、沙漠、植被、昆虫尸体中。 虫晶体蛋白是苏云金芽孢杆菌在芽中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 孢形成过程中产生的。德国科学家 早从患病地中海螟中分离到了这种芽孢杆菌 ， 并命名为“ n. 。苏云金芽孢杆菌 可产生对鳞翅目 （ 、鞘翅目（ 和双翅目 （ 等作物害虫有毒性的伴孢结晶蛋白质 （ G et 993） 。由于 大部分 虫 蛋白具有杀虫 专一性和高度选择性 ， 所以对植物和包括人在内的动物没有毒害 ， 而且是环境可以接受的。 编码 虫晶体蛋白的基因广泛存在于苏云金芽孢杆菌中。 编码杀虫晶体蛋白的基因在苏云金芽孢杆菌形成芽孢的过程中表达 ， 产生 虫晶体蛋白。菌体内的杀虫蛋白以一种前体的形式存在 ， 称为原毒素 （ ， 并自发形成伴孢 晶体。晶体的形成可在一定程度上防止杀 虫蛋白在环境中的降解。不同种类的杀虫晶体蛋白可以存在于同一块伴孢 晶体中。 不同种类的杀虫晶体蛋白 （ 就原毒素而言 ） 分子量不同 ， 大致有三个区域范围 : 129138 578 2529 晶体蛋白的分子量 较大 ，多为 129138 为碱溶性蛋白。蛋白分子由 1100 1200 个氨基酸残基构成。整个分子结构可分为两部分： N 端的活性片段和 C 端的结构片段（见图 1经过蛋白酶消化后 ， C 端的结构片段及 N 端的大约 28 个氨基酸残基被降解而产生活性毒素 （ 。也就是说活性毒素是一个 65 右的原毒素抗蛋白酶核心肽段。 1989年 ， 据晶体蛋白的氨基酸序列和杀虫谱的不同 ， 将已 经发表的 42种晶体蛋 白分为 5群 14亚类。 其中具有溶血溶细胞作用的 27体蛋白基因被命名为 因 （ ， 其他只有杀虫活性的 13 亚类命名为狭义的晶体蛋白基因 因 （ 。 因可划分四群：即 鳞翅目特异性 ， 鳞翅目和双翅目特异性 ， 鞘翅目特异性 ， 双翅目特异性。由于当时发现的基因数目少 ， 彼此之间有明显的差异 ，因此各个基因的分类地位比较明确。 在 1995 年国际 无脊椎动物病理学会年会 （ 提出了以杀虫晶体蛋白氨基酸序列的同源性为唯一依据区别 因的新分类系统 ， 现已 被各图 1 1 蛋白结构示意图 国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 国广泛采纳。同源性在 45%以下 ， 为第一等级 ， 用阿拉伯数字表示；同源性在 45%78%之间 ，为第二等级 ， 用大写英文字母表示；同源性在 78% 95%之间 ， 为第三等级 ， 用小写英文字母表示；同源性在 95%以上 ， 为第四等级 ， 用阿拉伯数字表示。只要满足来自 伴孢包涵体（晶体） ， 与已 知的 有高的同源性 ， 就可以纳入这个系统（黄大昉等 ， 2000）。截止到 2004年 1 月己经发现 299 种杀虫晶体蛋 白基因。 不同基因类型杀虫谱不同 ， 晶体蛋白的大小及性状也不一样 （ 如表 1 表 1晶体蛋白基因的分类 of 基因类型 基因亚类 编码蛋白大小 （ 伴孢晶体形状 杀虫特异性 类型 I A（ a） ， A（ b） ， A（ c） 131 133 双锥体 鳞翅目 B， C， D 133 138 类型 A， B 71 立方体 鳞翅目 ， 双翅目 类型 A 73 菱形 鞘翅目 类型 A， B 134， 128 椭圆形 双翅目 C， D 78， 72 类型 V 7 细胞毒 虫晶体蛋白被敏感昆虫取食后 ， 进入昆虫中肠道。晶体溶解 ， 杀虫蛋白分子从晶体点阵结构中释放出来。在昆虫消化道内消化酶的作用下 ， 蛋白被水解 ， 释放出大约 60 70 蛋白酶的活性毒素分子。活性毒素分子可与中肠道上皮细胞纹缘膜上的特异性受体结合 ， 并发生作用而使细胞膜穿孔。消化道细胞的离子、渗透压 平衡遭到破坏 ， 最终导致昆虫死亡。 随着 组技术发展 ， 自 19 世纪 80 年代后期以来 ， 许多实验室已将 因导入到不同植物组织的细胞中（ et 1987； et 1987） ， 如表 1示。由于 因来源于微生物 ， 转基因植物中难以检测出 转录 ， 蛋白的表达量很低 ， 1991 年 人在不改变晶体蛋白氨基酸序列的情况下 ， 对 因进行了部分改造或通过人工合成进行完全改造。 将基因导入棉花后 ， 其中杀虫蛋白表达量为天然 因表达量的 50100 倍（占可溶性蛋白的 。 1992 年 ， 郭三堆等人 （ 1995） 通过双链合成方法 ， 人工合成了全长 1824 合 虫基因 ， 构建了可在植物中高效表达杀虫基因的表达载体 ， 通过农杆菌介导法和花粉管通道法导入棉花 ， 研制成功了单价抗虫棉 ， 并在 1997 年开始了商品化。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 表 1获得的转 蛋白基因植物 t 物类别 转 蛋白基因植物 粮、棉、油类 小麦、水稻、玉米、棉花、大豆、油菜、花生、向日葵 果树类 苹果、梨、甜橙、柑桔、葡萄、越桔、洋李、胡桃、草萄、山楂、悬钩子、酸果曼、唐棣、番木瓜、花楸果、板栗、黄实黑茶麓子 蔬菜 番茄、茄子、颠茄、牛角椒、芹菜、齐菜、莴苣、白菜、花椰菜、卷心菜、芜菁、胡萝卜、豌豆、豇豆、鹰嘴豆、蚕豆、石刁柏、黄瓜、马铃薯、甜瓜 林木 杨树、落叶松、白云杉、枫香树、欧洲黑杨、花旗松 ， 火炬松 花卉类 石竹、田旋花、 长眷花、玫瑰、兰花、牵牛、菊花 其它 烟草、甜菜、苜蓿、桔叶薄荷、三叶草、甘蔗 因 该基因是从豇豆中分离出的胰蛋白酶抑制因子 （ 简称 ， 其应用于植物基因工程的一个显著优点是其抗虫谱广 ， 包括了大部分鳞翅目和部分鞘翅目害虫。 0个氨基酸的小分子多肽 ， 分子中富含二硫键 ， 它可以同胰蛋白酶的活性中心紧密结合 ， 使胰蛋白酶失活 ， 阻止了胰蛋白酶对食物中蛋白质的水解消化。因此可以抑制昆虫的消化作用 ， 并引发一系列生理反 馈作用 ， 最终导致昆虫死亡。由于酶的活性中心非常保守 ， 产生变异的可能性非常小 ， 因而棉铃虫产生抗毒性的可能性也非常小（刘春明等 ， 1993）。 墨西哥大学、美国 象鼻虫和螟蛉虫 ， 郭三堆等通过花粉管通道法首次获得了转 三堆等 ， 1999）。 虫棉研究存在的问题 虫谱狭窄 现有抗虫棉的主效抗虫基因都是 抗性比较单一 ， 只对棉铃虫、红铃虫等少数鳞翅目害虫有杀虫效果。而危害棉田的害虫极多 ， 除棉铃虫外还有 棉叶螨、象鼻虫、棉蚜、红蜘蛛、盲蝽蟓、蓟马等 ， 现有抗虫棉对它们没有抗性。 因来源于微生物 ， 由于表达机制的不同 ， 在高等植物中往往表达效果不理想。基因沉默（ 是指生物体中目标基因由于种种原因不表达 ， 是遗传修饰生物 （ 实用化和商品化的重大障碍。在实际应用中人们逐渐认识到：通过各种转化手段成功导入到宿主的外源基因往往难以实现预期的目的 ， 而且在不同植株个体之间表达水平也存在着明 显的差异。一旦转基因的整合破坏了这种平衡及空间特征 ， 这种破坏后的结构便成为宿主基因组防御系统识别的信号 ， 使新整合进去的 列发生不同程度的甲基化 ， 甲基化基因序列则通过抑制甲基化 合蛋白 （ 的结合而抑制转录的顺利进行 （ et 998） 。 由于转基因技术的限制 ， 转基因均是在基因组 列的不同位置随机整合。如果转基因中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 5 整合位置处于基因异染色质区或转录不活跃区。转基因就会在该区空间结构和成分影响下形成类似结构 ， 导致转录不活跃或异染色质化而失活 （ A et 1997） 。 有研究发现 ， 以花粉管导入法导入的外源 虫基因是以多拷贝的形式存在于棉花基因组中（夏兰芹等 ， 2001）。许多研究表明 ， 而在转录水平上 ， 同源基因在同源性较高或某些因子影响下 ， 可发生相互作用而使同源序列发生甲基化并失活。 外源基因多拷贝整合容易产生基因沉默（ D et 1996； et 1989； B et 1994） ， 但也有人持相反的意见（ L A et 2001）。有研究表明杀虫基因在双价抗虫棉中以多拷 贝形式存在 ， 但却能够稳定 遗传和表达 ， 并没有产生沉默 ， 这与 人的研究结果是一致的（夏兰芹等 ， 2001）。 尽管抗虫棉研究中会出现一系 列的问题 ， 但是目前进入生产应用以及大面积推广的抗虫棉 是 由科学家和育种家合作精心研制而成 ， 抗虫效果 好 ， 给社会带来 了 巨大的经济效益 ， 深受农民的喜爱。 虫性的时空变化 对于转基因棉花中 因的时空表达的研究表明 虫蛋白的含量在不同组织器官中含量不同 ， 而且随着生长期的变化而有所变化。对转基因株系的不同植株、组织、器官的时空动态表达有不同的结论。以国内 “ 863”首批转 因棉花植株和株系的生测结果表明 ， 嫩叶对棉铃虫初孵幼虫的毒杀作用大于顶尖和蕾（王武刚等 ， 1997）。利用生测法测试了抗虫棉对棉铃虫杀虫活性的时间和空间动态变化 ， 结果表明 虫棉相同部位叶片的杀虫活性随着棉花的生育期呈下降趋势 ， 并在盛花期之后显著降低。 虫棉不同器官杀虫活性的顺序为 :叶 蕾 铃 花（张小四等 ， 2000）。束春娥也得到类似的结论 ， 同一组织的抗虫性随生育期而呈下降趋势：营养生长阶段 营养、生殖并存阶段 生殖旺盛阶段 成熟衰老阶段（束春娥等 ， 1998）。以中国农科院棉花研究 所选育的转 因抗虫品系 材料 ， 花铃期室内抗性测定结果表明 ， 棉株营养组织的抗性较繁殖组织要强。 8 种组织对棉铃虫初孵幼虫的抗性顺序为 :成熟叶 幼铃、蕾、嫩叶、包叶 花瓣 花蕊（董双林等 ， 1998）。 采用 联免疫吸附测定法）对抗虫棉各器官的 白表达量进行测定 ， 各器官表现为：功能叶、茎尖 小蕾、幼铃 花蕊、花瓣、苞叶、老叶（刑朝柱等 ， 2001）。采用 和生测法研究分析了 3 个 因棉花株系新棉 33B ， 同组织器官的杀虫蛋白表达含量、校正死亡率及它们之间的 关系。不同组织器官的杀虫蛋白表达量也有显著的差异 ， 其顺序为叶 铃、花心、花萼、蕾 花瓣 苞叶（ 李汝忠 等 ， 2002）。以转基因抗虫棉中棉所 30 为实验材料 ， 用 定植株 蛋白含量 ， 研究在大田栽培条件下 ， 中棉所 30 不同器官 蛋白含量及时空变化。结果表明： 生殖器官中毒蛋白的含量远小于营养器官。 叶片中 蛋白含量远远高于蕾、花、铃中的含量差异（王保民等 ， 2002）。 大量实验表明 ， 动子驱动的杀虫基因在棉花各组织中的表达强度依次是：叶根茎铃花 ， 而棉铃虫对棉花的危害程度却是 :花 铃叶（崔金杰等 ， 1999；孟凤霞等 ， 2003；束春娥等 ， 1998；芮昌辉等 ， 2002；陈松等 ， 2000）。据统计 80%棉花虫害损失源于害虫取食棉花的花和果实（贾士荣等 ， 2001）。在花铃期 ， 三、四代棉铃虫虫口密度大 ， 同时棉铃虫以取食蕾、花、幼铃为主 ， 这部分器官毒蛋白