【毕业学位论文】（Word原稿）小麦白粉菌诱导早期的基因表达分析生物化学与分子生物学硕士论文成稿

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 小麦白粉菌诱导早期的基因表达分析 o. I 摘 要 由白粉菌 C 引起的小麦白粉病是我国小麦生产中的严重病害。它可导致大规模的粮食减产，严重地威胁着我国的粮食 安全 。因此，迫切需要应用现代分子生物学的方法从整体水平上深入研究抗病机理，以寻找提高抗性的行之有效的方法。 在本研究中，为了从整体水平上研究 抗病相关基因的表达情况，我们利用抑制差减杂交的方法构建了小麦抗白粉病的 库。以诱导的 等基因系为实验方，以其轮回亲本未诱导的 驱动方。根据 本实验室 李爱丽 等 对白粉菌侵染 小麦 细胞学的研究 （ 2005, In 以及相关文献 我们确定了 1、 3、 6、 12、 16、20种后小时 ) 7 个时间点为取材时间点。 所构建 库 中 共保存了 4224 个克隆， 提取了 864 个 质粒 , 将质量好的 667 个质粒进行测序， 共获得 637 条 质量好的表达序列标签 )。 在 用 合 件对其进行序列同源性比对。结果表明 共有 373 条 有蛋白质编码功能 ， 254 条 码产物与已知蛋白质序列同源性较低或找不到任何同源序列 ,将 这 254 条 中比对，发现 6 条新 在 373 条具有蛋白编码功能的序列中，有 74 条序列编码未知蛋白， 经过 进一 步筛选 得到 207 条 据 结果进行功能注释， 以及根据998)对 拟南芥基因的分类标准进行了功能的分类。 在 所获得小麦白粉菌诱导早期表达的基因中 ， 已知功能的 同源 基因涉及多种代谢和应答过程，如初级代谢、能量代谢、细胞内运输、信号识别、抗病防御、蛋白质合成、加工以及次级代谢等。与相同材料白粉菌诱导 24、 48、 72基因表达 情况 （骆蒙等， 2002）进行比较，结果显示诱导 24前的 基因 表达中，抗病基因上游的 R 基因 表达较多， 占抗病 /而诱导 24后的基因表达中，此类基因所占比例较小， 信号传导途径的基因大量富集 ，占 所分析基因 的 12%，是 诱导 24后的 基因 表达中 此类基因比例的两倍。其中， 相关信号分子、泛素降解相关蛋白表达较多，尤其是 26S 蛋白酶体相关蛋白以及转录相关蛋白仅在诱导 24前的 基因 表达中发现。相比之下， 诱导 24后的 基因 表达 的特点是 系统获得性抗性相关基因以及防卫基因的表达较为丰富。通过对 本实验中 基因 表达 的 分析 并结合相关文献可以看出， 某些信号传导类，胞质转运类，转录因子 类，次生代谢类，以及细胞结构类 基因在多种植物材料和多种胁迫诱导中均 有 表达。这似乎暗示着植物对于外界环境胁迫的基础防御机制的一致性。 最后，本研究针对 24前诱导表达的基因情况，对小麦抗白粉病可能的分子机制进行了初步的探讨。 关键词 ：小麦， 近等基因系， 抗白粉病， 库，基因表达 分析 ，抗病机制 is a of is by C. It So it is to at to in In a by on as a of of a m2 as a is to by C) in we to of 1, 3, 6, 12, 16, 20 i et (2005, In 64 to be 73 or 4 254 to 207 in As a 4in SH 4, 48, 72et 2002), of of 12% of in SH 4 In 26S In SH 4 of , 6% of of R(to a of in SH in of to in of on of 录 摘 要 . 一章 文献综述 . 1 物抗病性研究概况 . 1 物的抗病性 . 1 物抗病基因的克隆及其结构特点 . 2 物抗病机制及抗病信号传导路径 . 5 麦抗白粉病基因的研究进展 . 10 麦抗白粉病基因的研究背景 . 10 麦抗白粉病基因克隆的研究现状 . 11 麦抗白粉病机制的研究 . 11 制差减杂交的原理和应用 . 13 理 . 13 术评价 . 13 术的应用 . 14 题意义和技术路线 . 16 题意义 . 16 术路线 . 17 第二章 材料与方法 . 18 物材料及处理 . 18 提取 . 19 提取 . 19 纯化 . 20 库的构建 . 20 一链 成 . 20 二链 成 . 20 酶切 . 21 头的连接 . 22 一次杂交 . 24 二次杂交 . 24 次 增 . 25 物的连接转化 . 26 减差异片段 库的构建 . 27 入片段检测 . 27 粒的提取 . 27 增克隆的插入片段 . 27 序 . 28 序质粒的提取 . 28 序反应 . 28 序反应产物纯化 . 29 序结果分析 . 30 第三章 结果与分析 . 31 检测 . 31 切结果 . 31 头连接效率 . 32 制性差减杂交结果 . 32 减杂交效率检测 . 33 减文库库容和插入片段的 增 . 34 序结果 . 35 列分析和功能注释 . 35 诱导 24、 48、 72 小时的差减文库的比较 . 44 类功能的基因所占比例的比较 . 44 抗病反应全过程来看两个差减库的差异 . 46 第四章 讨 论 . 48 种胁迫反应的共性 . 48 白粉病识别机制初探 . 48 A 信号途径在抗病反应作用中的可能性 . 49 烯在抗病反应作用中的可能性 . 49 抗病反应作用中的意义 . 49 泛素降解相关的可能机制 . 50 第五章 结 论 . 51 参考文献 . 52 致 谢 . 60 作者简历 . 61 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 物抗病性研究概况 自人类文明开始 以来 ，植物病害 就 对农业生产 产生 巨大影响，进而威胁人类生存。 同时 植物病害总是造成巨大的经济损失 和 资源 的 浪费。 18 世纪 40 年代的马铃薯晚疫病 的流行导致了整个爱尔兰的大饥荒即是一例。人口的日益增长以及耕地的逐渐减少迫使人类必须想尽办法保证世界粮 食 的 稳定供给。虽然杀虫剂的使用成功地控制了病害，但是它们持续和日益扩大的使用将严重危害人类的健康和生存环境。 此外， 高产作物品种的应用也可以提高产量，但是却带来了风险 ，即 如此大面积种植的遗传背景一致的品种极易 发生 破坏性的流行病。这一切都在告诉我们，只有深入探讨植物自身抗病机制并结合当今世界复杂的病害发展生态学研究才能够 找到 防御植物病害的最好方法（ et 1997）。 物的抗病性 在纷繁芜杂的生态圈中存在着大量的病原物，如病毒、细菌、真菌、线虫等，但是只有相对较少的病原物能够成功 地 侵染寄主细胞并导致病害（ et 1997）。这是因为在长期的进化过程中，它们与病原物相互影响，相互作用，甚至协同进化，从而逐渐获得了一系列防御机制来保护自己。 这种机制既有专一性的抗性 ,也有非专一性的抗性；有组成型表达的，也有诱导型表达的抗性。植物的抗病性可总结为四类 非寄主抗性、非小种专化性抗性、小种专化性抗性及基础防御（表 1 表 1础抗病内容 （ et 2003） et 2003） 术语 (解释（ 抗病性表现（ 非寄主抗性 （ 抗病发生在种间，有效抵抗所有已知病原 无症状 非寄主专化性抗性（ 抗病性发生在种内，有效抵抗所有已知病原， R 蛋白介导 仅有某些植物基因型表现完全抗性 小种专 化性 抗性 （ 抗病性在种内有所变化，仅在 植物具有 R 蛋白，同时受到病原体专化性小种产生相应激发子的情况下有效抵抗 每一植物基因型表现出对不同病原菌分离小种不同的抗病性及感病性 基础防御（ 在病原成功侵染后阻止病原的生长扩大 感病性在不同的感病基因型中有所变化 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 物抗病基因的克隆及其结构特点 为了抵御自然界不计其数的病原种类的侵袭，植物逐渐演化出一组抗病基因 (R) 来识别和应答病原中互补的无毒基因（ 早期的遗传研究认为 R 基因编码高度选择性的受体来检测病原的存在。这些受体的激活打开了在某种寄主抗性中 设置的信号通路的开关（ ., ., 2002）。 近十几年来，世界上的许多实验室经过艰苦卓绝的努力 ，目前已 从 12 种植物或作物当中鉴定出了 44 个 R 基因（表 1 表 1克隆的 R 基因 et 1996 et 1995 M et 1997 P et 2000 et 1997 et 1999 et 1998 et 1996 et 1994 et 1998 et 1998 et 2000 et 2000 (et 1999 et 2000 et 1996 et 1998 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 ri et 1997 et 1999 et 1999 ai et 1999 et 1998 et 2000 et 2000 et 1998 et 2000 et 2001 et 2003 et 2003 et 2003 et 2004 et 1994 et 1996 1998 ai et 1997 et 1993 et 2002 et 1995 un et 2004 C et 2001 et 2001 et 1992 et 1997 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 4 细胞介素受体结构域； 苷 酸结合结构域； 亮氨酸重复结构域； 胞外 富亮氨酸重复结构域； 膜结构域； 白激酶； 脯氨酸谷氨酸丝氨酸苏氨酸序列位点； 受体介导的内吞信号结构域。 1 这些 R 基因抵御细菌、病毒、真菌、卵菌甚至线虫和昆虫等无论胞内或胞外的不同生命形式的病原物。尽管这些病原物的种类很广，并且可能的致病机理也很不相同，但是已经克隆的 R 基因却仅仅编码主要的五类蛋白质 (图 1。 最大的一类 R 基因编码一个核苷酸结合位点（ 富亮氨酸重复（ 白家族( 这一类蛋白一般存在于细胞质中 ，但是至少有一种 白是与质膜相关的（ et 1998）。它们最吸引人的结构特征是 C 端 量的变化。不同类型的蛋白质常具有不同数量的 构，行使不同的生物大分子之间结合的作用。此类蛋白常带有特定的 细胞介素受体（ 构域等类型。 第二类具有跨膜结构域和胞外的 构 ( 如番茄抗叶霉病不同生理小种的基因 甜菜抗包囊线虫的 因，其产物都是锚定于细胞膜上的糖蛋白受体 ,它们的 而在 第三类是蛋白激酶类（ 如番茄 因 , 其产物是一个位于细胞内的丝氨酸 它没有 构域，但是可能通过其 N 端的豆蔻酰化位点与膜相关联。大麦 因编码的蛋白则包含两个激酶结构域。 第四类是 跨膜结构域 加 胞外 胞内蛋白激酶类（ 如水稻抗白叶枯病基因 产物 。 第五类是新克隆的 编码产物 的 N 端带有信号锚（ 结构并且与CC(构相 融合。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 5 图 1种主要的抗病基因编码的蛋白的代表性位置和结构（ et 2001） 1of of of （ et 2001） 除 上述 五类之外 ， 最特殊的是最早克隆到的抗病基因玉米 R 基因 它负责对真菌种 1 的抗性。它编码依赖于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 ( 还原型辅酶 ) 的 , 活 种 1 产生的致病因子 , 它决定该病菌只能感染玉米的某些基因型 (et 1992) 。另外，大麦抗白粉病（ f. 因 是不符合上述模式的抗病基因。该基因编码的蛋白中含有至少 6 个跨膜 蛋白螺旋（ , 但没有其它 R 基因的类似结构。最近发现的一类特殊类型是番茄抗病基因 们包含一个胞外 构域，并连有一个与蛋白降解相关的 构域 (仅在 发现 ) 以及一个短蛋白结构域，其功能可能是靶定受体介导的内吞（ 白（ et 2003）。 物抗病机制及抗病信号传导路径 别机制 1971 年 出 基因对基因 的 假说，揭示了植物的抗病性是由植物的抗病基因 (R 同源的病原物的无毒基因 (产物相互作用，既而引起下游一系列的抗病信号的表达和传递 ,最终 导致抗性。然而，当时对于 R 产物与 物的具体识别机制并不清楚。之后的近 30年的研究，使我们对这种识别机制 可 见一斑。 1981 年 先提出抗病基因和无毒基因产物的直接相互作用构成了基因对基因 的 抗性。这种由经典的受体 所示。 对 大量的 R 基因的克隆及其产 物结构分析表明 R 蛋白在结构上存在相当的保守性，主要分为五类（上文提到），迄今为止最大的一类编码氨基端为 或 细胞介素受体（ 构域，中间的 羧基端的富亮氨酸重复结构域（ 个部分融于一体的蛋白。这些基因在这里叫做 在这一类中，识别特异性决定部分在 ，在这一结构域中假定的暴露在外的疏水残基位点是高度变化的，因此，推测 et 2003）。这似乎成为人们证实 直接相互作用 的依据。然而，以后的研究表明，这种识别机制并不是最初想象得那么简单。例如， 型的抗病基因产物 其同源的无毒因子 间的相互作用并不能引发下游信号。相反， 受体似乎是 种细胞质内的不带任何特定受体结构域的蛋白激酶（ et 1996;et 1996）。此外，第二大类编码具有细胞外 构域的蛋白，这是一类来源病原物配体的潜在受体（ et 1997）。然而，对此类抗病基因的代表 相互作用的研究中并没有中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 6 发现二者之间直接的作用（ et 2001）。直到 2000 年， 体外酵母双杂交实验才证实了导致抗病反应的 抗病基因与无毒基因产物之间的直接相互作用。也就是说，虽然直接的识别机制早以提出，后来也确实证明了这种假说在某些植物抗病中的正确 性 ，但是，大量的研究和证据表明，这种直接的识别机制是较少发生的，目前仅证实了两种： et 1996）和 ia et 2000)。 图 1原无毒基因产物与植物抗病基因产物的相互作用 (et 2003) vr et 2003) 假定的病原物 (灰色 )附着到植物细胞上，并表达了一系列的致病蛋白 (红色 )。 这些 蛋白通过第三类分泌机制 (对细菌来说 ) (et 2001)或其它未知机制 (真菌线虫等 )被转运至植物细胞内。一旦进入它们就靶向结合寄主蛋白 (绿色 )来控制防御应答、代谢或其它植物细胞中影响病原物致病的生理过程 (注意致病蛋白也可能结合胞外蛋白 )。 (a) 在这种模式中植物细胞不能表达 R 蛋白来识别致病蛋白。因此，植物不能有效地探测到病原物，防御最多微弱地被诱导。 (b)这种模式描述了经典的受体 R 蛋白直接结合到致病蛋白上。这种识别事件激活了一种复杂的信号传导网络，并随之引发防御应答。 (c) 这种模式描述了保镖假说，即 R 蛋白 (保镖 )探测 被修饰的寄主蛋白 (保卫物，以红星表示 )，这种修饰蛋白可能以一种和侵入的致病蛋白形成的复合物形式出现。 当前，随着大量实验证据的积累，一种称为 保镖假说 的间接识别机制已成为研究者们广泛讨论的热点。这种假说最早是由 人在研究为什么 白激酶在与无毒因子中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 7 别中需要 型的蛋白 激活抗性时提出的（ et 2001）。在这种模式中， R 蛋白实际上与细菌第三类因子（ II 其他细菌因子在寄主细胞内的目标物相 联系。这种目标物可能是某种植物抗病组分，或者是能被致病因子修饰从而滋养胞外细菌的寄主蛋白。一般说来，当第三类因子进入抗病的寄主细胞，与其目标物相互作用，形成的复合体被R 蛋白所识别，从而引发抗性。在特异 R 蛋白不存在的时候，寄主体内的目标物不能被保护从而使第三类因子的致病作用得以发挥，植株随之感病。例如， 寄主抗性中普遍存在的组分，可能存在于应答植物病原细菌非专化激发子的路径中。其无毒因子 作用是锁定 阻止非专化防御路径。 一种 的蛋白保卫着 测无毒因子 破坏作用，然后激活抗性（ et 2001）。 保镖假说 虽然没有被证实，但是它在人们过去一直持有的简单的 R 蛋白与无毒蛋白直接相互作用的观念上前进了一步。为人们最终弄清识别机制 提供 了崭新的思路。 图 1镖假说中 R 蛋白的作用 （ et 2001） et 2001） 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 8 (a) 一 种细胞蛋白复合物 （ 蓝色 ） ，包含保卫物 （ 分子 （ 红色 ） 和一个 白 （ 灰色， N 端以深色阴影表示 ） 是细菌第三类致病因子 （ 橘红色 ） 的 目标物。 (b) 第三类因子与复合物结合后，释放并激活 白，从而导致抗 病性。 (c)或者， 白开始不是目标复合物的一部分，直到第三类因子结合 后才也结合上去。 (d) 第三类因子与目标物的结合激活了 白。 前已知的信号传导途径 R 基因识别后的早期事件是钙离子流，胞外碱性增强，蛋白