【毕业学位论文】（Word原稿）花生对黄曲霉菌侵染抗性的分子标记作物遗传育种硕士论文

中国农业科学院硕士学位论文 1 密级 : 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 花生对黄曲霉菌侵染抗性的分子标记 to in 中国农业科学院硕士学位论文 2 to in 中国农业科学院硕士学位论文 3 目 录 摘要 1 英文摘要 2 第一章 文献综述 3 1 国内外研究现状 3 生产业发展现状 3 曲霉菌及黄曲霉毒素 4 响花生黄曲霉毒素污染的因素 5 生黄曲霉毒素污染的控制技术研究 7 生抗黄曲霉抗性遗传改良研究进展 8 子标记及其在作物育种中的应用 12 2 研究目的与意义 15 第二章 花生对黄曲霉侵染抗性分 子标记的建立 16 1 材料与方法 16 料 16 剂及仪器 16 法 18 2试验设计 24 本材料一致性的检验 24 本材料的黄曲霉 侵染抗性检验 24 24 染抗性鉴定实验体系的优化 24 2 群体侵染抗性检测及毒素含量测定 24 染抗性的分子标记检测 25 据统计与分析 25 3 结果与分析 26 中国农业科学院硕士学位论文 4 本材料的一致性 26 本材料的黄曲霉侵染抗性鉴定结果 27 示亲本多态性的 物 28 性鉴定实验体系的优化 29 2 群体抗性检测及毒素测定结果 29 生抗黄曲霉侵染分子标记的获得 32 第三章 花生黄曲霉侵染抗性标记的验证 35 1 材料与方法 35 料 35 法 35 2 结果与分析 35 性分子标记在花 生抗性资源材料中的分 布 35 性分子标记在后代群体中的验证 37 第四章 讨论与结论 38 1 关于花生黄曲霉菌侵染抗性的评价标准 关 38 2 关 于花生对黄曲霉菌侵染抗性的遗传属性 38 3 关于花生黄曲霉菌侵染抗性的分子标记 39 4 结论 41 参考文献 43 致谢 49 作者简历 50 中国农业科学院硕士学位论文 5 摘 要 花生是世界上重要的油料和经济作物，是众多发展中国家重要的油脂、蛋白质来源。我国是世界上最大的花生生产、消费和出口国，花生对我国农业乃至国民经济的发展具有重要意义。黄曲霉毒素（ 世界上公认的强致癌生物毒素，其对花生及加工产品的污染已成为全球花生产业发展的重要制约因素。通过遗传改良途径培育抗黄曲霉花生品种对于解决污染问题已取得一定成效，但抗性育种进展仍较缓慢，其重要原因之一是黄曲霉抗性的表现受环境因素影响较大，而且抗性鉴定费用高。因此 有必要建立快速可靠的花生黄曲霉抗性的分子标记及辅助选择手段。本研究利用抗黄曲霉侵染和感病品种杂交，通过优化抗性评价技术体系，应用 析方法，在国内外首次获得了与花生黄曲霉侵染抗性紧密连锁的 记。主要研究结论如下： 1）选择抗黄曲霉侵染的花生基因型“ 感病基因型“中花 5号”为材料配制杂交组合，以繁殖产生的 离群体为研究材料，根据抗性鉴定结果，选择极端抗感的个体组成抗池和感池，通过 子标记方法，获得了与花生黄曲霉侵染抗性基因连锁的分子标记 据 体抗性鉴定结果，结合 两点测验，标记与抗病性基因间的交换值分别为 换算成遗传距离分别为 2）在获得标记的基础上，进一步用国内外报道的 20个抗黄曲霉侵染的花生基因型鉴定了这两个分子标记的有效性。实验结果表明， 20 个抗性种质中的 16 个存在标记 在标记 有 13个资源材料，而两标记在感病品种中均不存在，证实了两标记应用于黄曲霉侵染抗性辅助选择的潜力和价值。 关键词： 分子标记， 助选择，黄 曲霉，花生 中国农业科学院硕士学位论文 6 .) is an an of in is in of a to in to of in to to of in or in is a to a in we NA . on 2 as 1) SA 40bp 452044to 2) to to of 456 443 . in 国农业科学院硕士学位论文 7 第一章 文献综述 1 国内外研究现状 生产业发展现状 花生 ()是世界范围内重要的油料和经济作物，是发展中国家重要的食用植物油和蛋白质来源。目前全球花生年种植面积 2400万公顷，年总产 3400万吨左右。花生起源于南美洲，但目前各大洲均有种植，尤其在热带和亚热带的干旱及半干旱地区种植相当普遍，在全球北纬 400至南纬 400之间的广大地区，只要热量充足，均可种植花生。亚洲是 20世纪花生种植规模最大的地区，占全球花生种植面积的 70%左右，其中印度和中国是主要花生生产国，占本地区花生种植规模的近 90%，其他亚洲国家种植花生较多的还有印 度尼西亚、缅甸、孟加拉国、越南等。非洲的花生种植规模仅次于亚洲，尼日利亚、塞内加尔、苏丹、南非等是主要的花生生产国。美洲花生种植规模居各大洲第三位。在北美洲，美国是主要的花生生产国，在南美洲，阿根廷和巴西是花生主要生产国。欧洲多数地区不适合花生生长，仅在保加利亚、希腊、西班牙、南斯拉夫等南部地区有少量种植。澳大利亚是澳洲花生主要生产国。 我国是世界花生生产和消费大国，在全球花生生产中举足轻重。据 五年(1998界花生年均收获面积约为 公顷，年均总产 吨， 顷，其中同期印度年均种植面积约 730 万公顷 (占世界花生面积的 ，居首位，总产 685万吨左右 (占世界总产 ，居第二位。我国花生种植面积 404万公顷，仅次于印度居世界第二位，占世界花生面积的 但年均总产 1370万吨，居世界首位，占世界总产的 单产比世界平均水平高一倍并已整体赶上美国的花生生产水平。 1993年以来，我国花生总产一直稳居世界第一位，因此就总产而言我国是世界最大的花生生产国。 花生在我国各省、市、自治区均有种植， 主要分布在山东 、河南、河北、安徽、广东、广西、四川、江苏、湖北等省， 其中山东、河南两省的种植面积在 80 万公顷以上 。 自 20 世纪 80年代以来的 20多年中，我国花生生产得到了稳步发展，在 1981年计划”的20 年时间内，我国花生年种植面积从“六五”期间（ 1981 260 万公顷，增长到“九五”期间的 410万公顷，增幅达 60%以上，平均每五年增长 50万公顷。花生需求量的加大和经济效益的提高是促使我国花生生产发展的主要原因。 花生在我国国民经济和社会发展中具有重要的地位和作用。花生是我国重要的食用植物 油和蛋白质来源，我国花生总产中有 50%于榨油（与全球花生榨油比例相近），是花生消费的首要用途，占我国植物油脂的比例为 17%，仅次于菜籽油和大豆油，居第三位，花生油年均消费量 200万吨左右，是我国花生主产区当地居民的主要食用油。长期以来，我国油脂供应缺中国农业科学院硕士学位论文 8 口较大， 20 世纪 90 年代国内油脂消费量的三分之一左右依赖进口，并且随着我国人民生活水平的不断提高和食物结构的改善，花生油的消费比重将呈上升趋势。花生对我国食用蛋白的供给同样具有重要作用，花生仁蛋白质含量为 28%左右，我国花生总产中有 32%左右用于直接食 用和食品加工，平均年食用花生（仁）消费量在 300万吨以上，折合优质蛋白质 60万吨左右。由于我国也是蛋白质供给缺口很大的国家，饲料蛋白质进口量逐年上升，花生生产的发展对于增加我国蛋白质供应、发展畜牧业等方面同样具有重要作用。 花生在增加农民收入和出口创汇中具有重要作用。近年来，随着我国花生单产水平的提高，花生在大宗农作物中的比较效益较高，同时受国内油脂供应短缺的影响，花生的市场价格一直较高且较为稳定，使花生的生产效益普遍高于其它多数大田作物 ,在大宗作物中单位面积收益居首位，对于增加农民收入有重要意义。花生是 我国出口量最大的油料作物，近 5年来，我国花生年出口量保持在 30国内花生总产的近 5%，占世界花生贸易量的 20长期以来，我国食用型花生仁的国内市场平均价格比美国花生价格和国际市场价格低 20%以上，具有相对较强的国际竞争力。 但是，最近几年来我国的花生出口出现了质量安全方面的问题。花生是易受黄曲霉毒素污染的农产品之一，而黄曲霉毒素是举世公认的强致癌性物质，受到各国政府和消费者的高度重视。近年来，欧盟、日本等主要花生进口国以我国生产的花生中黄曲霉毒素含量超标为理由，限制本国企业从我国进口花生 ，由于黄曲霉毒素污染而引起的花生国际贸易争端时有发生，严重地影响了我国花生在国际贸易中的地位。更为严重的是，由于我国生产的花生 95%用于国内消费，而通常用于国内消费的花生及加工原料，其黄曲霉毒素污染的严重程度远高于出口的花生，毒素污染问题已经并将继续对国内消费者健康构成巨大的威胁，是影响我国花生产业长远发展的重要限制因素。有效控制黄曲霉毒素污染，将有利于提高我国在国际花生贸易中的地位，增强花生产品国际竞争力，提高花生及制品的卫生安全性，保证消费者的健康。因此，开展花生黄曲霉毒素污染的控制技术研究具有特别重要 的意义。 曲霉菌及黄曲霉毒素 黄曲霉 菌（ 属半知菌亚门真菌，分生孢子穗球形，上生小梗1，分生孢子梗顶球状，分生孢子粗糙，圆形黄色，菌落颜色初为黄色，后变黄绿色至褐绿色。 空气及土壤中均有黄曲霉菌存在，其对农作物的危害一般发生在苗期，主要是造成烂种并导致缺苗。黄曲霉菌侵染花生荚果后产生的黄曲霉毒素（ 是这一真菌病害倍受关注的主要原因。 黄曲霉毒素是众多真菌毒素（ 的一种，在花生中主要是由黄曲霉菌及寄 生曲霉（ 产毒菌株产生的结构相似的一组毒素，花生中常见的有黄曲霉毒素 1、 中 性最强，危害最大，其中国农业科学院硕士学位论文 9 次是 曲霉毒素对人和动物的毒性主要表现为致癌和致畸， 实验结果显示，其毒性比人们熟知的剧毒物氰化钾要强 10倍；比剧毒的农药 1605的毒性还要强 30 倍。一粒严重发霉含有黄曲霉毒素 40 微克的玉米，可 使 2只小鸭中毒死亡。 黄曲霉毒素 的毒害机理主要是抑制核酸的生物合成（阻止 抑制蛋白质的生物 合成、干扰糖类和脂类代谢、抑制正常的免疫反应 。 黄曲霉毒素是上个世纪 60年代才被发现的， 当时 在英国东南部一些农场中，有大约 10万只火鸡不明原由地突然死亡，一时间在人群中造成了恐慌和不安。后来经过食品、毒理和细菌学方面专家的通力合作，终于找出了引起火鸡大批死亡的原因：他们从饲料玉米粉中分离出一种前所未知的由黄曲霉菌产生的毒素，命名为 “ 黄曲霉毒素 ” 。 之后，在非洲的肯尼亚和乌干达，也发生了大批小鸭因黄曲霉毒素中毒死亡事件。在我国南方地区也发生过因使用含有黄曲霉毒素的玉米饲料，致使家禽成批死亡的事件，相关的研究表明 ，在我国黄曲霉毒素污染严重的地区同时也是肝癌的高发区。 2001年 7月，我国广东出现了“ 900吨致癌大米 ” 的报道，其中部分 大米 已经检验证实含 有 致癌物黄曲霉毒素。 花生是最易受黄曲霉菌侵染的主要农作物之一。黄曲霉菌引起的黄曲霉病对花生植株的危害一般较轻，造成产量损失较小，其危害发生在幼苗期，症状是在出土子叶及下胚轴产生大量的黄色孢子，导致幼苗生活力下降，甚至失水而死亡，黄曲霉病在印度、非洲等热带干旱花生产区会影响花生种子出苗及幼苗生长，在我国花生产区则发病率较低，病情较轻。但黄曲霉菌侵染花生荚果后产生的黄曲霉毒 素则是这一真菌病害倍受关注的主要原因。花生黄曲霉毒素污染的产生，主要是由于在合适的环境条件下，黄曲霉菌浸染、定殖在花生荚果和种子上，并进而利用花生提供的丰富营养物质代谢产生黄曲霉毒素。一般认为，花生收获前和收获后均可能遭受黄曲霉菌的侵染并产生毒素。花生收获前的黄曲霉毒素污染相当普遍，生育后期的干旱和机械损伤是收获前花生黄曲霉毒素污染的主要原因。收获后黄曲霉毒素污染的产生主要是不能及时干燥，贮藏时，高温高湿，虫害发生严重也是原因之一。黄曲霉毒素污染在我国花生产区均有不同程度的发生，总的趋势是从北到南，黄曲霉毒 素污染逐渐加重，山东、河南、河北等北方花生产区污染较轻，长江流域和南部产区污染程度普遍较重，主要原因是我国南方高温高湿的气候特点，有利于黄曲霉菌在花生上生长并产生毒素。近年来，由于花生种植规模的不断扩大，收获后的花生不能及时干燥贮藏，北方产区的花生黄曲霉毒素污染有加重的趋势，受此原因的影响，我国出口到欧盟等国家和地区的花生由于黄曲霉毒素超标而遭到退货的现象呈增加趋势，一些花生进口国不断地降低口花生中允许的黄曲霉毒素含量的限量标准是原因之一。我国出口花生黄曲霉毒素污染的加重也是不容忽视的因素。 响花 生黄曲霉毒素污染的因素 黄曲霉菌的侵染在花生生长整个时期及收获后的种子均能造成危害，但一般只是在生育后中国农业科学院硕士学位论文 10 期和收获后的干燥、贮藏、运输、加工过程中由于霉菌对花生果（仁）的侵染而产生毒素。 生收获前的毒素污染 关于花生收获前黄曲霉菌侵染途径，目前大多数学者认为花生收获前黄曲霉菌感染源来自土壤，土壤中的黄曲霉菌直接侵染花、果针和荚果，特别是受损的荚果。影响花生收获前黄曲霉毒素污染的因素很多。黄曲霉菌的产毒能力、花生品种的抗性、害虫及机械损伤、生育后期的干旱、收获方式和收获时期等均能影响黄曲霉毒素污染的 发生。 由于不同花生品种抵抗黄曲霉菌侵染和产毒的能力有很大的不同，种植抗病品种能够直接和间接降低毒素污染的程度。地下害虫的侵袭直接造成花生荚果的损伤，破坏花生的机械保护机制，导致土壤中的黄曲霉菌可从伤口感染花生，加重毒素污染程度，因此受地下害虫危害的花生荚果黄曲霉毒素含量通常很高。生育后期的干旱胁迫也会加重黄曲霉毒素污染，干旱使一种叫作“反二苯带乙烯” (植物抗毒素 (产生受到抑制，抗毒素能够抑制黄曲霉菌的生长和产毒，具有抵抗黄曲霉菌侵染和产毒的作用，这是一种自然 抗性。当花生种子水分含量高时，在遇到黄曲霉菌侵染时花生种子就能产生这种抗毒素。有研究显示，田间生长情况下，只要花生种子的含水量高，即使有黄曲霉菌的侵染也不发生毒素污染，在土壤温度较高、种子的水分活性 Aw(降到 毒素就停止合成，但在这个含水量黄曲霉菌又还能正常生长和产毒，因此就可产生毒素污染 ， 尤其土壤温度高的情况下时更加严重。如果干旱继续加剧，花生含水量继续下降，黄曲霉菌也无法生长，已侵染的霉菌也不能产生毒素。所以花生种子的这个水分状态维持时间的长短是影响毒素污 染的关键因素。因此，在干旱情况下提倡在收获前 3干 旱条件下某些虫害会加重，由此引起的机械损伤可加重毒素污染。另外，花生的收获时期对毒素污染也会产生影响，适时收获的花生黄曲霉感染很少，延迟收获的花生，黄曲霉毒素通常较高。现有的资料表明，在不同地区黄曲霉菌株的产毒能力存在很大差异，一般认为，在我国南方花生产区的黄曲霉菌侵染和产毒能力高于北方。 生收获后的毒素污染 花生收获后的干燥、贮藏、运输和加工过程中，黄曲霉菌均可对花生侵染和产毒。 花生收获后的干燥速度对黄曲霉毒素污染的产生至关重要 。收获的花生荚果含水量降到20容易受黄曲霉菌侵染，原因是在这一含水量花生荚果停止产生抗毒素，但黄曲霉菌能正常生长和侵染。国内外研究证明，当花生仁含水量在 12%右，环境中的相对湿度 85%左右，温度 22中 29，黄曲霉真菌 (菌丝 )在侵染后 246就产生黄曲霉毒素污染。因此，花生收获季节的高温、潮湿、多雨的气候是花生感染黄曲霉菌的重要环境因素，这也是我国花生黄曲霉毒素污染在南方产区比北中国农业科学院硕士学位论文 11 方严重的主要原因。 贮藏、运输、加工过 程中花生含水量、空气相对湿度、温度、贮藏时间长短也是影响黄曲霉感染和产毒的因素。贮藏的花生含水量愈高，黄曲霉毒素污染程度愈高。花生容易吸收空气中的水分，因此空气湿度愈大，毒素污染的程度愈重。另外贮藏时间越长，虫害严重，也会加重黄曲霉毒素污染的程度 (王圣玉， 2003)。 生黄曲霉毒素污染的控制技术研究 黄曲霉菌在收获前、干燥过程、贮藏加工过程等三个阶段均能侵染花生荚果并产生毒素污染，不同阶段黄曲霉污染产生的主要原因有所不同，因此，在不同的时期，应分别采取对应的措施，减轻或避免花生中黄曲霉毒素的污染。 生生产过程 花生荚果破损，延期收获，地下害虫，生育后期的干旱和高温等因素是收获前黄曲霉毒素污染的主要原因。因此，在生产上采取如下措施可有效地控制花生收获前黄曲霉毒素污染： 1）种植抗黄曲霉的花生品种是最经济有效的途径。 2）避免机械损伤。在盛花期中耕和培土时，不要伤及幼小的荚果。尽可能不在结荚期和荚果充实期中耕，以免损伤荚果。 3）积极防虫治病。花生应尽量与其它作物轮作，减轻病虫危害。播种前应喷施杀虫剂，杀死地下害虫，花生生育后期应及时防病，减少病菌的交叉感染。 4）避免花生生育后期干旱。花 生收获前一个月的严重干旱是黄曲霉毒素污染的重要因素，因此，在该阶段要保证花生生育后期对水的需求，做到遇旱及时灌溉。 5）及时收获。花生成熟后要立即收获，延期收获的花生一般黄曲霉毒素污染程度加重。 燥和贮藏过程 由于田间土壤中含有丰富的黄曲霉菌及其它真菌群体，收获后的花生不可置于田间时间过长，挖出的花生如不能及时脱粒，应尽量避免荚果直接接触土壤。刨起的花生鲜果应迅速摊开，晒（催）干，严禁堆放。收获后一周内应将花生鲜果的含水量降至安全贮藏限度（ 8下）。花生在干燥催干过程要注意防止回潮，已催 干的花生应迅速包装。 花生贮藏前要检测含水量，一般花生仁安全贮藏要求的临界水分在 25下为 花生果10%以下。花生含水量愈高，黄曲霉毒素污染的程度愈高。花生仁（荚果）容易吸收空气中的水分（吸潮），因此花生贮藏的空气相对温度越高，黄曲霉毒素污染程度越重。花生安全贮藏的相对温度应控制在 70%以下。黄曲霉菌最适宜生长的温度为 29温度越高，黄曲霉菌生长越快。花生在贮藏过程中应尽量保持低温。赤拟谷盗、谷蛾、粉虫甲等昆虫是花生贮藏的主要害中国农业科学院硕士学位论文 12 虫，常嚼食花生，并将所携带的霉菌传染给花生，受损的花生极易感染黄 曲霉菌。另外，花生贮藏时间长，黄曲霉毒素污染程度增加。 毒 由于黄曲霉菌在空气和土壤中的广泛存在，花生生产、贮藏和加工过程中控制黄曲霉毒素污染的措施并不能总是起作用，一旦花生感染了黄曲霉菌，毒素的产生将不可避免，采取一些物理和化学的方法脱毒，能够降低花生及制品中的黄曲霉毒素。主要的脱毒措施包括： 1）拣出霉粒。由于花生颗粒较大，黄曲霉毒素主要集中在霉变、破损或变色的少量颗粒中，只要将这些霉变的颗粒拣出，黄曲霉毒素含量就可显著降低。据报道 , 在美国，花生在出售之前有较为严格的程序来去除被污染的花 生，花生果首先通过传送带方法去掉那些荚壳松软的荚果，剥壳后去掉小粒不饱满花生，通过电子设备去掉变色的花生，这样就能基本保证被污染的花生不会进入加工产品。 2）脱皮去毒。黄曲霉毒素在花生上的分布是不均匀的，毒素含量种皮部分要比胚部分高 2倍以上，加工时只要去除种皮，可大大的降低毒素含量。 3）碱炼去毒。该方法适合于去除花生油中的黄曲霉毒素。碱能破坏黄曲霉毒素 成豆素钠，而豆素钠能溶解于水，能够通过水洗去毒。方法是用 1%的烧碱精炼后，再用水洗两次，分出废水，去除毒素。利用其他一些化学方法如氨、氯化钾等 处理也可改变黄曲霉毒素的特性或结构，达到脱毒的目的。 生黄曲霉抗性遗传改良研究进展 性类型 目前，关于花生对黄曲霉毒素污染的抗病性，普遍的认识是花生中存在两种不同类型的抗性：一种是基于种皮结构及生化成分的抗性，即抗侵染（ to 黄曲霉菌在具有这种抗性的花生上很难侵染和定殖。许多研究者通过接种黄曲霉菌的方法，比较了不同的花生基因型，结果表明，品种间存在极大的差异，一般感病品种在接菌后的第二天就可观察到花生种子表面产生白色的菌丝，而抗 病品种直到第四天才产生少量的菌丝。另一类型的抗病性是抗产毒（ to 即黄曲霉菌侵染后抑制毒素产生的抗性。该抗性与花生种皮及胚部分均有关系。大量的实验研究表明，抗侵染和抗产毒由相对独立的抗性基因所控制。通过控制环境条件能够部分解决花生中黄曲霉毒素污染的问题，但通过遗传改良培育抗黄曲霉的花生品种，乃是目前国际上公认的解决黄曲霉毒素污染问题最经济有效的途径。 花生对黄曲霉菌的侵染抗性和产毒抗性都具有降低黄曲霉毒素污染的作用。现有研究结果表明，侵染抗性 比产毒抗性表现更为稳定，并且相对产毒抗性而言，培育和利用抗侵染的花生中国农业科学院硕士学位论文 13 品种，避免和抵抗黄曲霉菌的侵染和繁殖是解决黄曲霉毒素污染问题的根本途径。抗侵染的花生品种可显著降低黄曲霉毒素污染， 986)曾利用抗侵染花生品种与感病花生品种进行对比试验，结果表明抗侵染品种可降低 70%田间黄曲霉毒素污染。从上世纪 60 年代开始，印度国际半干旱研究所就开始了花生抗性种质鉴定和抗性育种研究，获得了一批抗黄曲霉侵染的花生种质。我国在上世纪 80年代开始进行这方面的研究，尤其是近年来由于花生黄曲霉毒素污染问题受到 更为广泛的关注，抗性育种及相关的研究报道越来越多，已成为花生遗传改良最重要的目标之一。 性资源 同任何一种植物抗病育种的研究历程相似，花生抗黄曲霉遗传改良研究的起点也是首先在花生品种资源中筛选鉴定抗性种质，从上世纪 60 年代以来，开展花生抗黄曲霉研究的单位对收集到的大量种质资源进行了广泛的筛选鉴定，从中鉴定出了 40 多个抗性种质（包括抗侵染和抗产毒），部分种质的抗性已经得到一致认可，有些种质已经作为亲本材料，在抗性育种中应用。966)首先在世界范围内鉴定出了第一个抗黄曲霉产毒种 质 （ 1967）的研究结果证实了 抗性，但 969)的研究表明， 不具有黄曲霉产毒抗性。974) 、 978)分别报道 4有抗产毒性。 986) 在对502 份花生种质接种鉴定后，未发现完全抗黄曲霉产毒的种质，但品种间存在极显著差异，其中 990)也得出了与 并鉴定出低产毒花生品种 达人等（ 1999）鉴定出 两个产毒量较低的花生种质 91322、 91048。在抗黄曲霉侵染花生种质的鉴定中， (1973) 最早报道了两个抗黄曲霉侵染的花生种质种质均为瓦伦西亚型（即多粒型），种子侵染率均在 5%以下 ,而感病品种达到 95%以上。 987) 证实了 与 分析认为，抗性的差异主要来自于接种时所使用的菌株和接种条件的不同 。 1986) 又鉴定出 6个抗侵染种质，编号为 985)在 350份花生种质中鉴定出 16 个抗性种质。 986) 报道了 4个抗侵染种质 990) 证实了 55 抗侵染性，并认为来自 性遗传及机制 关于花生黄曲霉抗性遗传，目 前的研究报道较少。仅有的研究表明，籽仁抗侵染的广义遗传率变化幅度较大，为 27%抗产毒的广义遗传率较低，为 20%；周桂元 (2001)用抗侵染种质和感病种质杂交，分析其 代材料抗病性分离情况，结果表明花生抗黄曲霉菌中国农业科学院硕士学位论文 14 侵染抗性表现为一对主基因和微效多基因混合遗传模式。对于抗侵染和抗产毒的关系，不同的研究者得出了不同的结论。印度 1980）的研究表明，田间黄曲霉菌侵染率与毒素含量无关 (r= 987)的研究得出了相反的结论，即抗侵染的基因型产毒量较低，并认为抗侵染和抗产毒存在高度的正相关，他分析认为，两个实验结果的差异可能是由于实验取材的差异。 995) 的研究结果表明，在长期的干旱和高温环境条件下，所报道的抗侵染和抗产毒种质，没有一个基因型比感病品种表现出更高的抗性。关于抗侵染和抗产毒两种抗性产生的机制，目前普遍的认识是，两者属于完全不同的两种抗性机制，侵染抗性的产生主要是由于花生种皮组织结构和生理特性的差异，梁炫强等 (2003)详细研究了抗黄曲霉侵染和感病基因型间在种皮组织结构上的差异，认为种皮破损的花生黄曲霉菌侵染率和毒素含量显著高于种 皮完整的种仁，并且种皮蜡质含量和角质层的厚度与品种的抗性有关。种植抗侵染的花生品种可以降低田间毒素污染程度而起到间接抗产毒的作用，一旦花生种皮破损，种子抗侵染性被破坏，这种抗性即丧失。 生抗黄曲霉育种研究现状 抗黄曲霉育种的进展依赖于抗性种质资源的获得，如前所述，虽然在世界范围内已经鉴定出为数不少的抗性种质， 但由于黄曲霉毒素污染问题的复杂性，已经鉴定和培育的抗病花生品种并不多，真正在生产上利用的更少。目前开展花生抗黄曲霉育种工作的有印度、美国、塞内加尔、泰国、中国等国家的花生研究机构 ，印度从 1976年开展花生抗黄曲霉育种研究工作，在对几百份花生种质进行了抗性鉴定后，于 1995年审定（登记）了两个抗黄曲霉侵染的花生种质国的研究者对 4个花生抗黄曲霉侵染种质 91279、 91283、91284 进行了产量和农艺性状的考察，肯定了其生产利用价值。印度 育的抗侵染种质87094、 87110在西非干旱条件下种植，也表现出很强的抗性。在泰国和塞内加尔，已鉴定的抗性种质（ 作为抗病亲本在杂交育种中应用，我国广东省农业科学院培育的花生新品种粤油 79 和粤油 20 被认为具有相对较高的黄曲霉侵染抗性。中国农业科学院油料所培育的抗青枯病花生品种中花 6号经检测具有一定的黄曲霉菌产毒抗性。 由于至今在花生中并未筛选到完全抗黄曲霉（抗侵染和抗产毒）的花生种质，致使花生抗黄曲霉育种研究进展缓慢，主要的原因是花生黄曲霉毒素污染问题的复杂性，在不同的环境和实验室条件下，抗性鉴定结果可能存在较大的差异， 可能是徒劳的，因此他建议使用抗旱性、抗虫性等间接筛选的方法培育抗黄曲霉的花生品种。花生在干旱和遭受虫害的环境条件下，黄曲霉毒素污染程度会显著提高，抗旱和抗虫性的花生品种具有间接的黄曲霉抗性，美国农业部 1983）的研究结果表明，在干旱胁迫下抗旱抗虫性与黄曲霉毒素污染程中国农业科学院硕士学位论文 15 度显著相关，抗旱抗虫的花生品种黄曲霉毒素含量显著低于感病品种，他们的研究成果为培育抗黄曲霉的花生品种提供了间接的方法。 美国的花生研究者正尝试开展培育转基因的花生品种，用于抵御黄曲霉菌对花生 的浸染和毒素的产生， 1993 年 道了全球第一例转基因花生，他们利用基因枪方法将 因导入花生，成功地使 虫性鉴定表明， 90%的转 因花生植株可以避免严重的地下害虫危害，而其在抗黄曲霉污染中的作用已经得到初步证实。美国农业部和 种蛋白质具有抑制黄曲霉菌生长的作用，并且在美国申报了专利，目前正进行该蛋白质编码基因的克隆和分离工作，其预期目的是将该基因导入花生等易受黄曲霉菌浸染的作物中， 如果该基因能够在花生中高效表达，将有助于解决黄曲霉毒素污染问题。 曲霉抗性改良中存在的问题 综上所述，国内外花生黄曲霉抗性遗传改良中存在如下一些共性问题： 1）缺乏高抗黄曲霉的花生种质资源。国内外曾对大量的种质资源进行了筛选研究，虽然得到了一些抗黄曲霉侵染的花生种质，但抗性级别均不高，至今尚未发现稳定表现高抗的花生种质 (侵染率 15% )。姜慧芳（ 2002）曾对来自我国不同生态区的 700份花生材料进行黄曲霉侵染抗性分析，没有发现高抗的种质，表现中抗的仅有 1个材料，其余材料均表现高感，实验结果 表明，目前在我国广泛种植的花生品种和用于育种的种质资源中几乎不存在抗黄曲霉侵染的材料。而目前国外报道的抗性资源材料一般农艺性状较差，很难在我国直接种植利用。 2）黄曲霉抗性遗传机制不明。关于花生黄曲霉抗性的遗传研究开展的较少， 主要原因是花生繁殖系数较低，人工杂交成活率又低，很难满足遗传分析所需要的杂交后代种子量，另外黄曲霉抗性鉴定的准确性相对较差也是原因之一，产毒抗性的鉴定需要专门的实验设备。目前，普遍的共识是花生黄曲霉侵染抗性是含有主效基因控制的数量性状，并受母体遗传的影响，但尚缺乏大量的实验数据证实。 3）缺乏有效的抗性鉴定技术。花生黄曲霉抗性遗传改良研究主要采用有性杂交的方法聚合有利性状基因，根据目标性状表现，在分离群体中选择农艺性状好且抗病的个体，进而培育成能在生产上利用的品种（品系）。由于分离群体大小随着世代的增加，试验规模随个体数量的增多将越来越大，如能在早期世代（ 目标性状进行选择，可大大提高杂交后代选择的速度和效率。然而，与其他病害发生在植株生长期间不同，花生黄曲霉抗性是针对种子而言的，并且由于田间抗性鉴定实验结果受环境的影响较大，目前主要采用实验室接种的方法进行抗性鉴定，但接种后 的花生种子即丧失活力，不能生成植株和后代种子。因此，花生黄曲霉抗性遗传改良研究主要集中在对现有育成花生品种的鉴定和筛选，而以抗性基因转移为目的，对大量杂交后代个体的筛选工作很难进行，即使可对遗传稳定的高世代（ 行接种鉴定选择，中国农业科学院硕士学位论文 16 由于试验规模的限制，必然会造成一些优良基因型个体在进入高世代之前已经被淘汰掉。另外，抗性鉴定的可靠性和重复性差，也是影响抗性改良的重要因素，因此对黄曲霉侵染抗性的确认需要多次重复实验，而对杂交后代进行多次重复的鉴定实验是根本不可能的。由于目前已经鉴定的抗性种质往往农艺性状较 差，很难在生产上直接应用，而对杂交后代抗性的鉴定又存在诸多困难，因此，非常有必要采用新的技术对黄曲霉抗性进行筛选和鉴定，避免由于采用接种鉴定对花生种子造成破坏，提高抗性鉴定的速度和效率，增强抗性鉴定结果的重复性和可靠性。分子标记技术的发展为花生抗黄曲霉育种提供了有力的研究手段。 子标记及其在作物育种中的应用 分子标记是在分子生物学基础上发展起来的新一代遗传标记，与原有的形态标记、细胞标记、生化标记不同，分子标记是建立在对 基因的直接反应。分子标记能对各个发育时期的生物体（如 叶片）进行检测，且不受基因表达与否以及环境条件的影响。利用获得的与目标基因紧密连锁的分子标记进行辅助选择育种，为克服常规抗性育种由于采用接种或自然胁迫进行抗性鉴定而产生的实验结果准确性、重复性差，育种周期长等弱点提供了强有力的技术手段。目前在多种作物上已经获得了大量的与作物抗性基因紧密连锁的分子标记，部分已开始应用于分子辅助选择育种 。 由于花生黄曲霉侵染抗性主要表现为种皮对霉菌生长的抵抗，对该抗性的鉴定均会导致种子生活力的丧失，对杂交后代而言，抗性实验所采用的接种方法，将使获得的抗性个体不能繁殖产生后代。因此 ，如果能够获得与抗性紧密连锁的分子标记，通过提取植株 行抗性选择，将对种仁抗性的直接接种鉴定转化为对植株 服常规抗性鉴定产生的破坏性，即可对杂交后代分离群体进行大规模、早世代的抗性鉴定，可减少田间工作量，加快选择效率。 用分子标记类型及特点 目前，国内外已经开发出十几种 据技术原理的不同，分子标记可分为四大类： 1）基于 限制性片段长