【毕业学位论文】（Word原稿）ISSR在食用菌遗传多样性研究中的应用农业微生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 食用菌遗传多样性研究中的应用 摘 要 本 研究 以 黑木耳 （ 、 白灵菇 （ 、灰树花 （ 、金针菇 （ 、滑菇 （ 、茶树菇 （ 、杏鲍菇 （ 和鸡腿菇 （ 等 8 种食用菌 105 个菌株 为 材料 ， 针对菌丝体 中 多糖等物质 丰富 的 特点 ，改进 取方法， 获得 高 质量 设计引物， 优化 反应体系和扩增条件 ， 进行 传多样性分析，形成了适合多种食用菌菌株遗传鉴别鉴定和遗传分析的技术和方法。 研究 表明 ， 我国食用菌栽培菌株遗传多样性丰富 ，多数 种内 不同 菌株 之间 遗传距离在 上 。 21 个 黑木耳 （ A. 菌株 ， 10 个引物扩增出 185 个位点， 多态性 位点 比例（ P）为 平均每个位点 的观察等位基因数（ 平均每个位点的有效等位基因数（ eiH）平均为 s 信息指数（ I）为 省际 间 菌株基因流（ 为 20 株 白灵菇 （ P. ， 11 个引物 共 扩增出 70 个位点， P 为 ， H 为 I 为 13 株 灰树花 （ G. ， 12 个引物 共 扩增出 178 个位点， P 为 ， H 为 I 为 12 个 13 个金针菇 （ F. 株 扩增出 124 个位点， P 为 H 平均为 I 为 16 个引物将 12 株 滑菇 （ P. 扩增 出 146 个 位点 ，P 为 H 为 I 为 13 个引物将 10 株 茶树菇（ A. 扩增 出 194 个 位点 ， P 为 H 为 为 9 株杏鲍菇 （ P. ， 13 个引物扩增 出 250 个 位点 ， P 为 e 为 H 为 I 为 7 株鸡腿菇 （ C. ， 14 个引物扩增 出 141 个 位点 ，P 为 H 为 I 为 基于菌株间 传距离的 类分析 表明 ，我国栽培食用菌菌株 的分布与 地理 区域无关 ， 表明 我国食用菌菌株适应栽培地域性强，生产菌株在全国 范围内引种频繁 。 以 白灵菇 和杏鲍菇 为材料，进行 酯酶同工酶分析 ，将 分析 结果与 析结果 相比较， 结果表明两种方法 对菌株的 分析 结果 大致相同， 都是鉴别菌株的良好方法，但对遗传关系的分析结果有差异 。 对 不同 白灵菇 菌株 的 增 位点 进行连接、转化、克隆、测序，获得了 24 个位点 的序列，对 序列初步分析结果表明： （ 1） 5锚定引物对扩增的特异性 相对较弱 ， 相似的引物间存在非特异扩增 位点 ； （ 2） 同一个引物对不同菌株的扩增 得到的相同 位点 ，虽然在分子量大小上没有差异，但位点内部 存在着 单个 核苷酸 位点 的 差异 ； （ 3） 增 位点 序列在 对结果发现，与已登录的 功能 基因序列无同源性 ； （ 4） 增位点序列内 存在着大量的串联重复序列，说明这些 增区域 正 是微卫星的活动频繁区域 。 关键词 ： 大型真菌 ， 简单重复序列区间 ， 分子标记 ， 遗传距离 ， 聚类分析 05 in in NA to 20 We a to D) .4 in 1 . 10 85 of P) of of eis H) s I) 0 . 11 0 P Na Ne H I 3 . 12 78 P Na Ne H I 3 . 12 24 P Na Ne H I 2 P. 16 46 P Na Ne H I 0 . 13 94 P Na Ne H I . 13 50 P Na Ne H I . 14 41 P Na Ne H I eis of of of of ST . . to of 24 . 1) 5 on 2) in in 3) no to in 4) in SR 录 第一章 引言 . 1 述 . 1 国人民对食用菌的认识和利用 . 1 用菌产业在农村经济中的作用 . 1 国食用菌生产的现状和特点 . 2 外食用菌生产简述 . 3 国食用菌菌种现状 . 3 用菌遗传多样性研究进展 . 4 态学研究 . 4 胞学研究 . 5 白质研究 . 6 子生物学研究 . 7 子标记技术研究进展 . 11 技术原理 . 12 术特点和操作 . 12 遗传育种中的应用 . 13 题意义和研究内容 . 14 题意义 . 14 究 内容 . 15 第二章 基因组 获得 . 16 验材料 . 16 要仪器和设备 . 16 要试剂 . 16 试菌株 . 17 法步骤 . 21 丝培养 . 21 丝收集 . 22 菌 取 . 22 质菌 取 . 22 脂糖凝胶电泳 . 23 外分光光度计检测浓度 . 23 果分析 . 24 丝培养 . 24 伞菌 取结果 . 24 质菌不同材料 取 比较 . 24 度结果 . 25 论 . 25 第三章 物初步筛选及 应体系确定 . 26 料和方法 . 26 验仪器和试剂 . 26 料和引物设计 . 26 应体系和参数确定 . 26 物凝胶和电泳条件 . 27 果分析 . 27 性温度 . 27 脂糖凝胶浓度和电泳电压 . 27 论 . 28 第四章 食用菌遗传多样性的 析 . 29 料和方法 . 29 验仪器和试剂 . 29 引物 . 29 增和凝胶电泳 . 29 据分析 . 29 果与分析 . 30 木耳（ A. . 30 灵菇（ P. . 33 树花（ G. . 36 针菇（ F. . 38 菇（ P. . 40 树菇（ A. . 42 鲍菇（ P. . 45 腿菇（ C. . 47 物扩增结果 . 50 传多样性分析 . 51 论 . 51 记方法的可行性 . 51 传距离与同物异名 . 52 物与微卫星 . 52 V 传多样性 . 53 第五章 酯酶同工酶分析结果比较 . 54 料和方法 . 54 验仪器和试剂 . 54 试材料 . 54 胶制备 . 55 酶液提取 . 55 样及电泳 . 55 据观察与分析 . 55 果与分析 . 55 泳图谱 . 55 据处理和聚类分析 . 56 论 . 57 第六章 列特征分析 . 58 料和方法 . 58 验材料与仪器 . 58 应和电泳 . 58 收与纯化 . 58 A 克隆和转化 . 58 化子检测 . 59 列分析 . 59 果和分析 . 59 隆结果 . 59 列拼接 . 60 物扩增非特异性 . 61 核苷酸多样性 . 61 列 对 . 62 复序列寻找结果 . 63 论 . 64 第七章 结论 . 65 参考文献 . 66 致 谢 . 75 作者简历 . 76 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 增片段长度多态性 ) 碱基对 六烷基三甲基溴化铵 氧核糖核酸 化乙锭 乙胺四乙酸 单重复序列区间 密度 丙烯酰胺凝胶电泳 合酶链反应 乙烯吡咯烷酮 机扩增的多态性 制性片段长度多态法 分钟转数 二烷基磺酸钠 单重复序列 羟甲基氨基甲烷 加权算术平均对群法 of 个位点的观察等位基因数 of 个位点的有效等位基因数 H s eis 基因多样性 D 传距离 I s s 信息指数 P of 态 性 位点 比例 准偏差 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 述 估计地球上现有 150 万种真菌，预计其中 14 万种是能产生 较大个体 和相应结构子实体的大型真菌。 目前我们已知 约 14 000 种，只占预测 大型真菌 种类总量的 10 （ 2002） 。在 14 000 种已知 大型真菌 中，约 5 000 种具有不同程度的可食性，其中 31 个属的 3 000 多种被当作食用菌 （ 2 000 种具有药用功效 ） 。 约有 95的食用菌属于担子菌门 （ 少数属于子囊菌门（ 我国 幅员辽阔， 气候多样 ， 地形复杂 ， 孕育了丰富的 大型 食用 真菌资源。估计 我 国目前有 3 800 种 以上 大型 真菌 ，其中 900 多 种 为食用菌 ，栽培生产的 近百种 （卯晓岚， 2000）。 国 人民对 食用菌 的认识和利用 我国人工栽培食用菌的历史悠久，是世界人工栽培食用菌最早的国家，为世界人民提供了极为宝贵的技术经验（杨新美， 1996）。中国人民早在数千年前就已开始观察和采食大型 食用 真菌，在历代农业和文学作品中都有大量记载。 “ 味之美者，越骆之菌 ” ，两千多年 前的吕氏春秋 就向人们推荐了食用菌。 秦汉以前的哲学家 和 思想家指出： “ 无华而实者名栭芝属也 ” ；又说： “ 朝菌不知晦朔 ” ， “ 朽壤之上，有菌芝者，生于朝，死于晦 ” ，说明其生长在腐殖质土壤上 ，且子实体出现时间短暂。秦汉以后，随着唐、宋文化的昌盛，我国人民对大型真菌的观察与认识，也从零星记载，逐步走向深入与系统化，并从生产与生活实践中积累经验，编辑撰写为专著或某些农学和药物学著作中的专题。如唐代段成式的酉阳杂俎和韩鄂所著的四时纂要，宋代陈仁玉的菌谱和陈景沂的全芳备祖，元代王桢的农书，明代潘之恒的 广菌谱和李时珍的本草纲目中的菜部第二十八卷，以及清代吴林的吴菌谱等 （ 吕作舟 ， 2006） 。 我国劳动人民 在 长期的生活和生产实践 中 ，逐步形成的生产 技术 ，至今仍然有很大的实用和参考价值。 唐代韩鄂所著的四时纂要中有关于 “ 种菌法 ” 的最早记载：