【毕业学位论文】（Word原稿）番茄青枯病拮抗菌的筛选、鉴定和应用研究微生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士 学位论文 番茄青枯病拮抗菌的筛选 、 鉴定和应用研究 摘 要 番茄青枯病是一类危害严重的 世界性 土传细 菌 病害 ， 它的有效防治已经成为番茄生产中亟待解决的难题。 本研究从生物防治的角度出发，分离筛选了对番茄青枯病有拮抗作用的菌株，通过温室盆栽试验和田间小区试验进行了防治效果和田间应用效果评价。旨在为高效芽孢杆菌 的研制和使用 提供理论依据和技术支持。 主要研究内容有以下几个方面： 1. 从山东寿光和苍山不同种植年限的蔬菜大棚中分离得到 的 45 株菌株以及中国农业微生 物菌库中 保存的 19 株菌株中， 利用点接法 筛选到 14 株对茄科劳尔氏菌 有拮抗作用的菌株，然后通过牛津杯法复筛得到 6 株抑菌效果较好的菌株。通过温室盆栽试验表明拮抗菌 防治效果最好，液体菌剂防治效果达到了 ，固体菌剂防治效果达到了 。 2. 对番茄青枯病拮抗菌 行了形态学特征、生理生化特征测定，结果表明它与侧孢短 芽孢杆菌种的特征一致。测定了菌株的 16S 列并根据其构建了系统发育树，在系统发育树中， 侧孢短芽孢杆菌形成一个类群，序列同源性为 99 %。因此将 定为侧孢短芽孢杆菌 （ 。 3. 从 侧孢 短 芽孢杆菌 酵液中提取的拮抗蛋白粗提液具有抑制茄科劳尔氏菌生长的效 果，该抗菌蛋白粗 提液具有良好的热稳定性，能耐 90 的高温；用蛋白酶处理，其抑菌活性受胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶 K 的影响；对氯仿敏感；随着紫外照射时间的延长，活性受到影响；拮抗物质 25 保存，活性 28 d 内基本不变；作用活性 围较宽， 这对于芽孢杆菌用于生物肥料的生产和保藏具有一定的理论指导作用。 4. 根据温室盆栽试验的结果，制备侧孢短芽孢杆菌 固体菌剂，在山东 莱阳赵旺庄乡 露地蔬菜栽培区和山东 肥城科技示范园的蔬菜大棚里 进 行了 小区试验，对田间应用效果进行了测定。 结果表明 固体菌剂的两种接种量对 番茄青枯病的防治效果分别达到了 和 ， 固体菌剂 蔬菜大棚施用能够促进番茄植株生长和增加产量 。 5. 提取了 侧孢短 芽孢 杆菌 基因组 绿色荧光蛋白（ 为报告基因 ,以启 动子探针 载体 ,通过鸟枪法在 大肠杆菌 构建了 启动子文库 。 通过筛选获得了 14 个阳性克隆 ,编号为 对 隆中的重组质粒的插入片段进行了测序和在线启动子预测 。 结果显示插入片段 有典型 的原核启动子的特征，其它五个插 入片段则没有典型的原核启动子特征。 将 入到穿梭载体 建了含侧孢短芽孢杆菌 身启动子和 质粒载体，为监测 侧孢短芽孢杆菌 番茄根际的定殖提供了有利的工具。 关键词 ： 番茄青枯 ， 筛选 ， 鉴定 ， 侧孢短芽孢杆菌 ， 拮抗物质 ， 启动子is a in It is a to on of on of by It of 1. in by a in 10 , 2. of 10 10 6S 10 10 in 9 %. So 10 . 3. 10 is 0 . is by . It is to of is 8 d 5 . pH of to is .0 4. to of we on of in In of in 5. NA 10 10 . as by 14 1 by in 2, 14 to 3 6 35t. P6 of a to 10 in of 录 第一章 引言 . 1 茄 青枯病研究进展 . 1 科劳尔氏菌的分类地位 . 1 科劳尔氏菌的存活、侵染和传播 . 2 茄青枯 病的防治 . 2 孢杆菌在植物病害生物防治中的应用 . 3 云金芽孢杆菌 （ . 3 草芽孢杆菌 （ . 3 状芽孢杆菌 （ . 4 衣芽孢杆菌 （ . 4 小芽孢杆菌 （ . 4 动子克隆的几种方法 . 5 用启动子探针载体克隆启动子 . 5 用 术克隆启动子 . 5 研究的目的和意义 . 9 第二章 番茄青枯病拮抗细菌的分离和筛选 . 10 验材料 . 10 样来源 . 10 试病原菌和供试植物 . 10 养基 . 11 验器材 . 11 验方法 . 11 病力茄科劳尔氏菌的筛选和保存 . 11 株的分离和纯化 . 11 抗菌的初筛 . 11 抗菌的复筛 . 12 苗土的制备 . 12 体菌剂的制备 . 12 体菌剂 吸附基质的制备 . 12 体菌剂的制备 . 12 抗菌株的温室盆栽试验 . 12 验调查和数据的 统计分析 . 13 果与分析 . 13 离及筛选结果 . 13 抗菌液体菌剂的防治效果 . 14 抗菌固体菌剂的防治效果 . 15 论 . 15 第三章 番茄青枯病拮抗细菌 鉴定 . 16 验材料 . 16 种和培养基 . 16 剂和克隆载体 . 16 验方法 . 16 养特征和形态特征 . 16 理生化特征 . 17 菌 16S 定 . 19 果 . 21 养特征和形态特性 . 21 理生化特征 . 22 株的 16S 定 . 23 6S 列相似性分析 . 24 论 . 25 第四章 侧孢短芽孢杆菌 抗物质的提取和特性分析 . 26 验材料 . 26 试菌株 . 26 养基 . 26 验方法 . 26 体最适吸收波长和生长曲线的测定 . 26 抗物质抑菌活性测定 . 26 菌滤液的制备 . 27 抗物质的提取 . 27 抗物质的稳定性测定 . 27 验数据的统计分析 . 28 果与分析 . 28 体最适吸收波长和生长曲线 . 28 菌滤液对番茄青枯病原菌的拮抗作用 . 29 孢短芽孢杆菌 菌滤液盐析得到物质的拮抗作用 . 29 孢短芽孢杆菌 菌滤液乙醚萃取物的拮抗作用 . 29 抗物质对热的稳定性 . 30 抗物质对蛋白酶的 稳定性 . 30 抗物质对氯仿的稳定性 . 31 抗物质对紫外线的稳定性 . 31 抗物质活性的有 效时间 . 31 菌滤液酸碱稳定性测定 . 32 论 . 32 第五章 侧孢短芽孢杆菌 间应用效果评价 . 33 V 料 . 33 试菌株和培养基 . 33 间小区试验地点和番茄品种 . 33 体生防菌剂吸附基质 . 33 法 . 33 体菌剂的制备 . 33 东莱阳露地小区试验 . 34 东肥城蔬菜大棚小区试验 . 34 验数据的统计分析 . 34 果 . 35 东莱阳露地小区试验结果 . 35 东肥城蔬菜大棚小区试验结果 . 36 论 . 38 第六章 启动子的克隆和 记载体的构建 . 39 验材料 . 39 株与质粒 . 39 养基 . 40 生素及其工作浓度 . 40 和试剂 . 40 验方法 . 40 粒 大量提取 . 40 粒 小量提取 . 41 粒 切体系的建立 . 41 切片段的回收 . 41 动子探针 I 酶切片段的 脱磷酸化 . 42 10 总 制备 . 42 10 总 酶切反应体系的建立 . 43 10 总 酶切片断与脱磷载体 粘端连接 . 43 肠杆菌 . 43 化 . 44 性克隆子的筛选 . 44 隆片段的序列测定 . 44 隆片断的序列分析 . 44 记载体的构建 . 44 光检测与照相 . 44 果与分析 . 45 孢杆菌 提取和 A I 酶切 . 45 动子文库的构建和阳性克隆子的筛选 . 45 动子测序结果和分析 . 47 记载体的构建 . 52 论 . 54 论 . 55 参考文献 . 56 致谢 . 62 作者简介 . 63 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 引言 茄青枯病研究进展 番茄青枯病是由 茄科劳尔氏菌 （ 引起的一种毁灭性土传 细菌 病害，广泛分布于热带 、亚热带和温带地区 （ 陈永芳等， 2003； 1991） 。 该病可造成植株大面积萎蔫死亡，一般田块的发病率为 10 % 15 %，重病田的发病率高达 80 % ，导致番茄产量的严重下降， 造成 了 巨大的农业损失（ 卢同 , 1998； et 2002）。 R. 有广泛的寄主， 可以侵染 50 多个科的 200 多种植物， 其中 番茄、 马铃薯和烟草等茄科作物受害最为严重（ 1991）。 由它引起的 青枯病被称为植物的“癌症”， 是世界上分布最广、危 害最严重且最难防治的重大细菌性病害。 近年来 由于“温室效应”所带来的全球气候变暖，该菌还表现出向高纬度冷凉地区蔓延的趋势，给作物生产带来极大的威胁 （李林章等， 2005），在我国该病已经延伸到了内蒙古和宁夏地区（何礼远等， 1995） 。 科劳尔氏菌的分类地位 青枯病从发现至今已有 140余年的历史， 1896年美国 人 1992 年 根