【毕业学位论文】阳离子聚合物基因载体的成及其性能研究-有机合成博士论文

学校代号 10532 学 号 分 类 号 密 级 博士学位论文 阳离子聚合物基因载体的合成 及其性能研究 学位申请人姓名 吴运东 培 养 单 位 化学化工学院 导师姓名及职称 向建南 教授 学 科 专 业 有机 化学 研 究 方 向 有机 合成 论 文 提 交 日 期 2013 年 10 月 学校代号： 10532 学 号 ： 级 ： 湖南大学博士学位论文 阳离子聚合物基因载体的合成 及其性能研究 学位申请人姓名： 吴运东 导师姓名及职称： 向建南 教授 培 养 单 位： 化学化工学院 专 业 名 称： 有机化学 论 文 提 交 日 期 ： 2013 年 10 月 10 日 论 文 答 辩 日 期： 2013 年 11 月 29 日 答辩委员会主席： 徐伟箭 教授 u B. S. (2005 A in of in 2013 博士学位论文 要 研究证明 ， 人类多种疾病都与基因的结构或功能改变密切相关，基因治疗已经成为改善人类健康的新兴医学治疗手段，基因治疗的关键在于合适的基因载体的选择。发展生物能降解的具有 高转染效率和低毒性兼具靶向特异性的基因载体已经成为当今该领域的主要任务。 聚乙烯亚胺（ 于其本身具有 质子海绵 效应，是高效的基因载体，目前已经成为研究热点。其 质子海绵 效应的结构特点使其既能绑定大量 适当的条件下又能有效释放 其细胞毒性限制其在生物体内的应用。壳聚糖 (有其他阳离子类聚合物载体所无法比拟的低毒性和高度生物相容性，其转染效率不够高，在中性或生理 乙二醇（ 有良好的生物相容性，其亲水链可结合大量的水分子将纳米粒子包裹起来，改善其 他高分子材料的水溶性增加在血液系统中的循环时间。 由于 有良好的水溶性， 有很强的绑定 力和高的基因转染效率， 有其他阳离子类聚合物载体所无法比拟的低毒性和高度生物相容性，本 论 文 合 成 了 一 种 新 颖 的 生 物 可 降 解 的 阳 离 子 聚 合 物 基 因 载 体通过 考察 生物性能 ， 显示该聚合物具有良好的亲水性，较低毒性，具有高的基因转染效率和良好的生物相溶性。合成的新载体将 者的优点相结合并避免各自的缺点。 因此 该阳离子聚合物作为基因载体具有良好的应用 前景。 论文主要开展了以下工作 ： （ 1）聚乙二醇 壳聚糖共聚物 (合成与表征 合成了一种 新型 的可生物降解阳离子 聚合物 基因载体 首次研究了 硼酸保护下，亲水性 修饰成双官能团化合物 反应 , 为饰提供了一种新方法 。不 溶于 水 的 壳聚糖通过 羧化反应 得到羧甲基化壳聚糖（ ， 不仅具有较高的 水溶性， 同样具有较强的 反应活性。 得到 新 聚合物 并通过 1H 定其结构 。 双亲性 使其在水溶液中 易 自组装成 “ 壳 结构的纳米粒子。 （ 2） 制备及与表征 设计合成了一种以壳聚糖为原料的无毒并具有生物相容性的新型共聚物载体(。 环 氧 乙 烷 在 萘 钾 作 用 下 开 环 聚 合 形 成 再水解生成该合成方法具有定量的产率 ， 所合成的 需分离，可直接用于下步反应 。 生酰胺化反应得到 着 对氨基苯甲醛发生酰胺化反应生成 两亲性共聚物 有醛基 和 胺基， 可望 用作基阳离子聚合物基因载体的合成及其性能研究 /药物共传输载体。 （ 3）聚乙二醇 壳聚糖共聚物 (生物性能 测试与 评价 研究 了 为基因载体的生物性能。通过琼脂糖凝胶电泳 法 证实 了 聚合物 结合能力， 摩尔比 达到 6 时 ， 全绑定系统中的 研究表明， 胞的毒性为 1 级（ C5 mg会因为与 5 mg1.5 mg应体系外观同样呈现出上述 3种变化趋势：在反应初期，由于滴入 液澄清，随着反应时间的延长， 量比接近 6:1时，溶液开始呈现 乳光样，随着 光有所加重，当质量比低于 2:1时乳光悬液内即出现细颗粒状悬浮物，光 学显微 镜博士学位论文 - 27 - 下观察可见大量细小颗粒团聚物。 应体系 米微粒制备的影响 为了研究不同 含有 缓冲液中，发现 在 种不溶于生理 米微粒在生理 示它可以提供对携带的生物大分子和药物免于被破坏的保障。 乙二醇 壳聚糖纳米粒子扫描电镜 离子凝胶法是制备 速的方法，该方法反应条件温和，无需使用有机溶剂，能得到坚固、稳定性好、粒径均匀的 持:1 6:1之间，反应体系 5.0 mg1.5 mg见微粒的粒径较为均一，基本位于 30 50 态均匀呈球形，分散度较好，无团聚粘连表现， 该纳米粒子 满足生物医学应用要求。图 2描电镜观察 2.0 mg.6 mg见粉体表面呈现粗糙的微米级凹凸和沟壑状形貌及纳米级颗粒凸起。 章小结 利用硼 酸的保护，将 到了新颖的 ， 为 氯乙酸与 难溶于的 壳聚糖反应获得了羧 甲 基化壳聚糖 羧基在 H 确认 了聚合物的结构。通过反应条件的控制调控聚合物中氨基和自由羧基的含量以满足基因和药物共传输的要求。共 聚物 - 28 - 具有双亲性特征，在水溶液中自组装形成壳 体系 共聚物 浓度在 1 5 mg1.5 mg描 电镜照片， 显示 微粒的粒径较为均一，形态均匀呈球形，分散度较好，无团聚粘连表现。 博士学位论文 - 29 - 第 3 章 单羧基聚乙二醇的制备及其与壳聚糖接枝共聚物载体的合成与表征 言 近些年来，聚乙二醇 (其无毒、生物相容性好、具免疫原性以及在水中和有机溶剂中都有良好的溶解性等优异的特性在生物学、药物学、表面化学、电子化学等领域得到了广泛的应用。研究证明 97经 性过的生物分子可以有效的避免被 统识别和吞噬，从而延长在血液中的循环时间。通常把这种利用 制剂或分子进行的改造的方法叫做 。 为了提高药物的疗效并且减少药物对健康组织的损害，我们一般选择合适的药物载体和方法将其改造成具有靶向性、低毒性、高效性等良好性能的药物分子。通常癌细胞及其组织周围相对于健康的组织细胞一般具有更高的温度较低的 高的细胞通透性等特点，正是基于这些特异性为我们设计靶向给药系统提供了一个合理的依据。靶向给药相对于一般的给药方式一般具有：将药物最大限度地运送到靶区，使药物在靶区浓集，直接作用于病变组织、器官和 细胞，延长药物与靶部位的作用时间， 增加 需药部位的药量，从而减少用药量、药物的毒副作用，达到高效低毒的治疗效果的优点。在这里我们正是基于肿瘤细胞 低的特点选择壳聚糖这种无毒可生物降解的原料对其羧甲基化， 以达到我们所期待的效果 100 本文第二章已经从两端都是羟基的 子出发对其经行了异端化改性，但是由于所得到的分子和未反应的分子以及反应副产物在分子量 、 性质等方面上具有很大的相似性所以很难进行分离。在前面通过硼酸和丁二酸酐对其进行改性的基础上，我们采用阴离子聚合的方法，以碱金属离子为 引发剂引发环氧乙烷开环活性聚合一步得到异端 子，然后在其基础上进行改性。 前文已经对壳聚糖进行了修饰，使其水溶性得到较大的提高。壳聚糖分子结构决定了它的转染效率和绑定 能力差，限制了其使用范围，为解决上述问题，本文合成了一种聚合物 图 3 阳离子聚合物基因载体的合成及其性能研究 - 30 - C H C C C C 2C 2 O C - C 2C 2O 2P A 4E D 1E D 22O C H 2O C O 2O HO n - 2O C 2 2C 2O C O O 2O HO n - 2O C 22C 2C a p h t h a l e n e p o t a s s i u ma r g o nh y d r o l y s i 乙二醇 验部分 剂、仪器 环氧乙烷（ 未处理使用，上海国药；乙腈，用氢化钙干燥 24小时后蒸出，上海国药；乙醚（ 用 乙醇重结晶三次后干燥，天津大茂；萘，用乙醇重结晶三次后干燥，上海国药；氯仿，用氯化钙干燥 ， 天津大茂；盐酸，稀释后使用，天津大茂；氢氧化钠（ 天津大茂；壳聚糖，浙江金华；一氯乙酸，天津大茂；异丙醇（ ，天津大茂；无水乙醇（ 天津大茂； 国瓦里安公司； 国尼高力公司 ； 凝胶渗透色谱 （ 美国仪器集团。 羧基甲基聚乙二醇（ 制备 环氧乙烷在常规的碱金属 醇盐引发体系下，聚合速度较慢，且环氧乙烷聚合过程中存在链转移副反应，分子量难以达到很高。 103现，向聚合体系中添加烷基铝，可以提高反应速度，同时减小 聚合体系由于实验条件所限，要求开环聚合反应时间越短越好，以减少活性种的损失。因此，我们采用文献报道的这种添加烷基铝的方法进行 望可以得到较快的反应速率，同时避免聚合过程中副反应。 博士学位论文 - 31 - 萘钾合成过程如下：将 250 氩气，如此反复 3次，冷 却后加入萘 g(0.1 加入事先在煤油中切好 7.8 g(0.2 钾屑，然后倒入精制的四氢呋喃 150 色马上变为萘钾的墨绿色先 30 下快速搅拌 8 h，再低速搅拌 16 h，以免形成过细的钾粉影响后续过滤。停止搅拌，使用砂心漏斗过滤。合成及滴定的所有操作均在氩气保护下进行。滤液为较深的墨绿色，用标准盐酸滴定萘钾浓度。氩气保护下储藏备用。 反应容器及加料方式。所有阴离子聚合反应均在装有玻璃磁力搅拌转子的应瓶的处理方式为：将装有玻璃转子的反应瓶在煤气灯烘烤下抽真空充氩气，如此反复 3次，冷却后充入氩气备用。试剂及溶剂用针筒从带有乳胶管的支管处加入，针筒放置于烘箱中干燥并在使用前用干燥氩气洗气。 样品处理：合成 氯甲烷为溶剂，反复沉淀 /溶解 3次以上。所得固体样品在室温下真空干燥至恒重。 先在氩气保护下用针筒向处理好的 250 50 l (24.7 慢速滴加 36 ， 24.7 萘钾的墨绿色迅速退去，滴加在 30 温下搅拌 30 反应充分进行。酒精冷浴冷冻反应瓶，用冷冻并氩气洗气过的针筒加入 44 O(869.9 聚合反应先在酒精冷浴下搅拌 1 h，然后 50 下反应 6 h。用洗气处理过的干燥针筒取出 5 乙醚中沉淀，室温真空干燥。 将 3.0 g 于 40%的氢氧化钠溶液中，回流 8 h，然后冷却至室温，将体系的 至 8 后，用氯仿萃取五次，合并氯仿层，浓缩后用大量的乙醚沉淀，然后将沉淀再次溶解入水中，进 行冷冻干燥得到产物 2.3 g（产率 。用 10%的盐酸将 室温条件下酸化，然后用氯仿萃取五次，浓缩后，用大量的乙醚沉淀得到 其溶于水中进行冷冻干燥。 合成 由于壳聚糖的溶解性很低，在很大程度上限制了它在生物以及化学领域的应用， 本文第二章对壳聚糖进行了改性，但其取代度较低，对水溶性的影响还有待提高 。为了防止和减少反应在壳聚糖的氨基上的反应，我们选择了强碱性的条件，这样既可以增加反应发生在羟基上的量又可以相应的减少的发生在氨基上的量，用二甲亚砜 (替溶剂异丙醇，制备高取代度的羧甲基壳聚糖 (一种新方法 非质子溶剂法，所得 取代度（ 达 体实验如下：在锥形瓶中 3.0 g 壳聚糖（ 6000）和 15.0 g 氢氧化钠加入 100 有异丙醇的水溶液中（体积比， =80： 20）在 50 条件下搅拌碱化 1.5 h。可以看到壳聚糖变为极其粘稠的糊状，将其放入冰浴中然后慢慢的在 30 加入含有氯乙酸的 20 丙醇溶液（ g15 g）滴完后在室温下反应 0.5 h，阳离子聚合物基因载体的合成及其性能研究 - 32 - 在将其移入 55 的 油浴中继续反应 5 h，加入 200 水乙醇来终止反应。然后将乙醇倾出，加水将反应产物溶解，进行常压过滤，滤出不容的未反应壳聚糖。将溶液浓缩后装入相应的透析袋中经行透析 3 d，去除大量的小分子。浓缩后进行冷冻干燥即得到可溶性的 白色粉末 羧甲基壳聚糖（ 2.8 g(产率 )，电位滴定法测定。 依次 分别对分子量为六千、五万、十五万、二十万的壳聚糖经行羧甲基化改性，得到了分子量不同的 可溶性 羧甲基化壳聚糖。 制 备 将 于一定量的二次水中，在冰水浴 中搅拌 0.5 h 后加入 13-（ 3二亚胺盐酸盐 （ 当其完全溶解后加入 并在室温下活化 24 h，然后加入 ，在室温条件下在反应 3 d， 反应完毕，抽滤除去不溶的副产物 N， N将反应液用透析袋透析，以去除 未 反应的改性 过量的 透析后的液体浓缩冷冻干燥即得到 性的羧甲基壳聚糖。本文分别做了 5 万分子量的羟甲基壳聚糖和 2000， 4000 的 接 枝 ； 6000 分子量的改性壳聚糖和 2000， 4000 分子量的 接枝 ； 15 万和 20 万改性壳聚糖和 2000，4000 分子量的 枝。另外还把用环氧乙烷阴离子聚合的后水解得到的改性别和 50000、 6000 的改性 行了 接 枝 。 氨基的反应比例通过加入 无聊摩尔比来控制 ，分别得到的产物中氨基的含量不同，从而来考察与 绑定效果。 氨基苯甲醛的合成 称取 5.0 g 对硝基甲苯，倒入 250 三口瓶中，同时量取 38 水乙醇 2 8 滴二甲基甲酰胺（ 入其中，加热回流至对硝基甲苯全部溶解后将多硫化钠溶液倾入其中，控制温度在 90 左右，回流 3 h。反应完后快速的用水蒸气蒸馏除去副产物（对硝基甲苯，对氨基甲苯）直到蒸出的液体为清液为止，大约需要 1.5 h，反应瓶中大约 150 液体，旋出一部分。然后放 4 的冰箱中冷却五个小时得到亮黄色的针状结晶，低温过滤，并将其放在低温条件下进行干燥得到枯黄色的黄色粉末 4.4 g(产率 88 )，用熔点仪测其熔点（熔点 79 ）。 合成 称取少量上述 枝的羧甲基壳聚糖将其溶于适量的二甲亚砜（ 液中，在常温下搅拌 5 h 使其完全溶解，随后将其移入冰水浴中，加入适量 室温下活化 24 h，随后将适量的对氨基苯甲醛溶于少量的 液中，慢慢滴入上述活化的溶液中，大约需要 20 完后该体系在室温条件 下 反应72 h。将反应 完全后的溶 液装入 透析袋中透析 ， 除去小分子对氨基苯甲博士学位论文 - 33 - 醛和有机溶剂 析后的溶液进行浓缩，冷冻干燥得到目标产物 标物的表征 红外光谱（ 征：采用 立叶红外光谱仪（ 片，美国尼高力公司）表征。用 片 测定聚合物的基团的特征峰。 核磁共振（ 征：采用 核磁共振仪（美国瓦里安公司）表征，氘代氯仿（ 为溶剂 ，四甲基硅氧烷（ 为内标，测定式样的 1谱，从而确定各聚合反应阶段的单体聚合转化率。 凝胶渗透色谱仪 (征：聚合物分子量及其分布用 胶渗透色谱仪测量，流动相用 速为 1.0 mL 果讨论 氧乙烷的开环聚合 合 的可能 机理 选择恰当的带功能基引发剂引发聚合是 在聚合物末端引入功能基的重要手段之一，本文选择乙腈钾引发环氧乙烷开环聚合。由于乙腈中氰基基团的强吸电子效应使得乙腈分子中的甲基上的质子呈一定的酸性，所以它可在强碱萘钾的作用下失去一个电子成为碱金属盐。环氧乙烷是一个三元环醚，环易开裂，性质非常活泼，容易在酸或碱的引发下发生阳离子或阴离子聚合。采用乙腈钾作为阴离子引发剂引发环氧乙烷开环聚合，在聚合的过程中甲基氰作为亲核试剂进攻环氧乙烷上的碳从而被引入链段的末端，得到一端为氰基，另一端为羟基的异端官能化环聚合过程入图 3 C H 2 K + H 2 2 C H N 2 C H 2 C C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 O C H 2 C H 2 O H 2 C H 2 - O 氧乙烷的开环聚合机理 析 把聚合物样品配制浓度为 1 mg/行 测，结果如图 3示 。 阳离子聚合物基因载体的合成及其性能研究 - 34 - 图 3凝胶色谱（ 从 均 聚物的 3可以看出其分子量 尖峰位置 为 2169，分布大致 范围在 21002200 之间， 均 聚物的截留时间大约在 24 右，为单峰分布。由检测结果可以得出聚合物 布 符合预期 。 图谱解 析 生成可以用核 磁共振谱图来证明：如图 3示 3.7 近有 链上氢原子的特征峰， 2.3 为氰基附近 位亚甲基上的氢 ， 位亚甲基上的氢，这充分表明氰基已经在链端， 经生成。 p p m ( f 1 )1 . 02 . 03 . 04 . 05 . 06 . 07 . 0图 3磁谱图 氰基是个不太活泼的基团，一般不发生发应。但是在酸碱存在的条件下可以发生水解反应，由于醚键在酸性条件下不稳定， 本实验 选择在碱性条件下发生水解。从图 3红外光谱可知，图中出现了 1580 右出现来羧酸盐的特征吸收峰， 2129 氰基的峰消失，而且增加的峰的大小和减小的基本一 致 ，说明氰基基本水解成羧基（为了防止醚键的断裂，我们采用 10% 氢氧化钠 在室温下对博士学位论文 - 35 - 其进行 碱 性 水解）。 图 3 谱 外 谱 分析 由图 3见， 1600 1411 出现了羧甲基钠盐的特征吸收峰，分别为 对称和对称伸缩振动吸收峰 (聚 合 物 S)无1411 收峰，说明 生了羧甲基化反应生成了 1598 形振动峰 ， 称伸缩振动吸收峰叠加变为单峰 (1600 且强度增加，但位移很小，可以认为 的 有参与羧甲基化反应。由图 3可以看出， 伯羟基和仲羟基的碳氧键的伸缩吸收峰分别为 1031 1091 在 分别对应为 1025 1077 强度减弱，说明 伯羟基和仲羟基发生了羧甲基化反应， 氨基氢的位置并没有大量的减少证明大多是发生在羟基的位置上。 图 3 谱 阳离子聚合物基因载体的合成及其性能研究 - 36 - 核磁 共振谱 分析 图 3 核磁 共振 谱 通过一系列的试验发现如果羧甲基壳聚糖的分子量太大或者 子接枝率太低都会在反应的后半段出现少量的浑浊现象，并且在透析的时候会变成乳白的胶体溶液，这种胶体溶液具有一定的 应性 ， 在弱碱性条件下可以变为溶液 。为了防止这种现象的发生以制取溶解性更好的载体，通过大量试验选择壳聚糖分子量为 6000 和 50000 的分子作载体作为下一步反应的原料。在加上 子量过大在生物体内无法排出，不利于在生物体内使用， 本文 选择分子量为 2000 和4000 的羧基化的聚乙二醇。 并且选择羧基量的三倍 摩尔量和两倍的 于大分子反应一般比较慢而且效率较低，所以我们选择 3 过核磁光谱（图 3较 ， 发现在 3.6 出现明显强烈的醚键 上 氢的峰 ， 壳聚糖上面羟基的氢的 吸收 峰减小 明显 ，同时比较改性 核磁谱图可以更加明显的看出， 特有的峰（由于未反应的 透析过程中已经除去）。 醛的核磁 共振谱 和红外 谱 分析 对氨基苯甲醛不稳定，在合成的过程中要特别的注意 操作 要点，防止其发生自 身 聚 合 ， 反应时间 选择 3 h，反应时间 过长容易发生聚合而反应时间过短又反应不充分副产物 过 多 。 水蒸气蒸馏的时候如果产物的浓度不断的增加也会造成自聚合的发生，反应的时候反应瓶中溶液的体积 不能 低于 100 过滤的时候在低温下进行 ， 温度过高也会造成自聚合的发生，并且在低温冰箱中抽干。防止酸性环境的出现，酸性环境也可以造成自聚合的发生。干燥的后的产物 熔点 经 为 79 ，在理论范围以内。 博士学位论文 - 37 - 图 3磁 共振 谱 比较图 3图 3以看出，聚乙二醇接枝羧甲基壳聚糖 现了苯环质子的特征化学位移，在 近出现了醛基质子化学位移，结合红外光谱图 3以证明制备了目标聚合物 图 3 谱 章小结 本章合成了 一种基于壳聚糖为载体的无毒且具有生物相容性的新的共聚物载体 组成和结构用 1行了确认 。首先用阴离子聚合的方法合成了 单 羧基的聚乙二醇 （ 该方法得到的产物分纯净。用 替异丙醇大大提高了壳聚糖的取代度，达 聚合物 为基因载体获得了更多的胺基。 用 进行对羧甲基壳聚糖改性 得到 的 羧基在 作用 下阳离子聚合物基因载体的合成及其性能研究 - 38 - 与 对 胺 基苯甲醛 的胺基用过酰胺键键合得到 含有 活性基团醛基的两亲性共聚物 聚乙二醇 ， 此两亲性共聚物含有醛基和相当数量的胺基，所以可用作基因 /药物共传输载体。 博士学位论文 - 39 - 第 4 章 聚乙二醇 壳聚糖共聚物的生物性能 测定与 评价 言 近 40 年来，医用生物材料的研究得到迅速发展，而且大量的研究产品正被广泛的用于临床。由于由于各种医用生物材料都将入体内与组织和细胞直接接触，因此，医用生物材料不仅必须具备临床所需要的良好的治疗功能，还必须具备良好的生物安全性 107。为保证生物医药材料的安全性，国际标准化组 1992 年发布了 (992) 医用生物材料的生物学评价等系列国际标准，目前已颁布了18 个相关标准 ,被各国政府采纳 。 我国为了保证 医用生物材料和医疗器械的研究、生产的质量和临床使用的安全性于 1997 年采用了 际标准 ，据此发布了医疗器械生物学评价标准 16886并于 同 年 12 月实施，从而我国的医用生物材料及医疗器械的生物学评价 与 国际完全接轨。 医用生 物材料的安全性检测手段之一是 细胞毒性 实验 。 毒性试验分为体外试验和体内植入试验。由于动物个体差异及体内许多复杂因素的影响和干扰，体内试验难以定量考察材料对机体的影响和获得客观准确的实验资料。根据国际评价标准 ， 在研究生物材料的细胞毒性及其对细胞的功能影响时，体外细胞培养方法常被列为首选实验方案。体外细胞培养的优点主要包括 :对有毒材料敏感 ， 易于控制实验条件 ， 可重复性好 ， 不涉及动物实验或人体实验的伦理问题 ； 与体内种植实验相比简便、迅速、易行 ； 给药剂量范围与梯度比体内实验更易于控制 ； 易于进行定量分析测定 108。利用体外细胞培养法从细胞水平去观察生物材料是否具有细胞毒性即材 料对细胞的数量、形态及分化的影响是检测生物材料生物相容性的一项重要指标 109。 细胞毒性的评价方法采用的是目前美国药典采用 测定。 1983 年 110根据活细胞在能量代谢中，线粒体内琥珀酸脱氢酶将 唑蓝还原产生甲瓒，而在毒性环境中，其琥珀酸脱氧酶活性会降低的原理，利用噻唑蓝比色分析法（即 ）测定细胞的活性。该方法简便、灵敏，广泛用于细胞毒性检测。 在 本文第二 章成功合成了一种新型基因载体聚合物聚乙二醇 壳聚糖。作为一种医用生物材料，安全性是最重要的考 虑因素。共聚物中的 三个组成部分 ： 聚乙二醇 、 聚乙烯亚胺和壳聚糖 的 细胞毒性已在文献中有大量报道，可由此推测共聚物的细胞毒性作用。 聚乙二醇 （ 是公认无毒和抗免疫原性的生物相容性大分子，已被美国阳离子聚合物基因载体的合成及其性能研究 - 40 - 国药局 准用于体内应用。 壳聚糖是来源于生物体的多糖，与人体有很强的亲和性和相容性。作为一种天然的高分子材料，它在体内可被相关酶降解成单糖或多糖等无毒的小分子，容易被生物体吸收。聚氨基酸尽管也能降解为小分子，但由于酸性物质的聚集也会对局部的组织产生刺激作用，引起炎症反应。相比之下，壳聚糖则具有更为可靠的安全性能。 等 111认为，高分子量 具有的对细胞膜外表面的高亲和力是导致其高细胞毒性的主要原因。 细胞毒性与细胞摄取与聚合物的尺寸和结构有关，其电荷密度、高分支结构与高分子量都对 生物相容性具有负面的影响。目前， 用 最为广泛、效果 最佳 。 在 因载体的合成片段中， 壳聚糖和聚乙二醇相对聚乙烯亚胺是无毒的 ，乙烯亚胺本身具有较强毒性。通过无毒、抗免疫原性的水溶性大分子 和可生物降解的壳聚糖的修饰 ， 可降低 其 毒性 。 本 章主要研究工作如下： 1、通过琼脂糖电泳实验来考察 绑定作用。 2、 采用 比较了不同分子量的 合成的 别对 人肝癌细胞（ ， 人宫颈癌上皮细胞 (胞 )， 人鼻咽癌细胞（ 胞）的 毒性 。 3、采用基因转染实验来考察 对 胞转染效率 。 考察了复合物形成时间、复合物对细胞作用时间、不同 N/P(复合物聚合物中 N 原子和 P 原子的摩尔数之比 )、不同的作用细胞 （ 人肾上皮细胞 293T、 乳腺癌细胞 和血清对 胞转染效率的影响细胞转染效率的影响 。 验 料和仪器 阳离子聚合物 司，均为树状） ； 阳离子聚合物5按本文第二章制备）， 00， 谭拥军教授实验室制备 )， 养基，琼脂糖，均购于鼎国生物试剂公司；人肝癌细胞（ ， 人宫颈癌上皮细胞 (， 人鼻咽癌细胞（ 胞）以上细胞均用含 10 胎牛血清 ( 转染腺病毒 因的人肾上皮细胞 293T， 乳腺癌细胞（ 电泳仪 ， 天能凝胶成像系统 酶标仪 (赛默飞世尔上海仪器有限公司 )； 12(司 )；胰蛋白酶 (司 )； 溴乙锭 (； 小牛血清 (杭州四季青公司 )；胎牛血清 (司 )； 四甲基偶氮唑 ( 司 )； 二甲基亚砜 (司 )； 苯酚 (分博士学位论文 - 41 - 析纯 )；细胞计数器 (上 海 )。 扫描 电镜 动态光散色仪（ 国 司）； 超净台 （ 苏州安泰净化设备厂 ）； 核酸蛋白分析仪（ 800UV/国） 合物的制备 B 液体培养基的配制 将 10.0 g 胰蛋白胨， 5.0 g 酵母提取物， 10.0 g 入 900 离子水中， 搅拌至完全溶解，用 l.0 约 节 至 定容至 1L， 高压灭菌（ 110C ， 20备用。 粒 小量制备 (按照试剂盒说明书进行 ) (1) 在超净台中打开容量为 10 无菌试管，加入 3菌的 养液和 3 那霉素 （ 50 将 冻存的菌液取出解冻，向试管内加入适量菌液 （ 菌量等同于一单菌落 )， 放入摇床中振摇过夜 （ 37 C ， 250 14 16h)。 (2) 将 3 养物倒入微量离心管中，用微量离心机于 4 X， 12000心30 s， 弃去上清，保存离心管底部的细菌团块。 (3) 将细菌团块重悬于 0.3 1 中，吹打或振荡使细菌 均匀 分散。 (4) 加入 0.3 2， 盖紧管口，轻轻颠倒离心管 5 次，充分混合内容物，然后室温放置 5 (5) 加入 0.3 冷过的 3， 盖紧管口，温和颠倒 4 6 次，使内容物充分混合，之后置于冰上 5 (6) 用微量离心机于 4C， 最大转速离心 l0 转移上清至另一离心管中。 (7) 将 l 入 0 柱，通过重力作用使液体自然流过柱子，然后将步骤 (6)中的上清液倒 入柱中，依靠重力使液体自由通过。 (8) 用 4C 分两次冲洗 ,再加入 0.8 F 溶解 液收集于干净离心管中。 (9) 加入 体积的异丙醇沉淀 用微量离心机于 4 C ， 最大转速离心 30 心弃去上清液，收集 淀。 (10) 用 l 0%的乙醇冲洗 去掉上清液将离心管倒置于一张纸巾上， 使所有液体流出 ， 将管壁液滴除尽 ， 在通风橱中让 淀干燥至没有多余液滴的透明状，用 50 L 的 E 重新溶解 储存于 冰箱中备用。 (11) 以 E 作为空白，质粒 E 稀释 30 倍后用核酸蛋白测定仪测定 含量和纯度。 合物 的制备 根据不同的 N/P 比，即阳离子聚合物 的氨基基团与 的 磷酸基阳离子聚合物基因载体的合成及其性能研究 - 42 - 团的摩尔比，用 备一定的聚合物溶液，涡旋 30 s， 再加入质粒 旋 5 温静置 30 获得聚合物 合物。 形态和粒度分析 用透射电 子显微镜观察上述复合物溶液中纳米粒的表面形态、大小； 动态光散色 粒度分析仪 (定复合物的粒径及其分布。入射激光波长 A=532 射角 90o，温度为 25 ，所得数值为 3次测量的平均值。 脂糖凝胶电泳试验 为了证明阳离子聚合物 用琼脂糖凝胶电泳阻滞试验。将 N/:6； 1:3；1:2； 1； 2； 3； 6； 8； 10； 20； 30； 40混合，在 温静置 30 泳条件： 1g/含 化乙锭 )， 1压 80 V，电泳时间 30 细胞毒性测定采用 色法进行 胞培养 0%小牛血清， 100 37 ， 5% 养液使用前在超净台内过滤除菌。 合物储备液的配制 配制各聚合物适宜浓度的储备液用于细胞实验。用分析天平精密称取5别置于一小培养皿中。将 盛有聚合物的培养皿放入超净台，半盖上培养皿盖，阻挡紫外光对聚合物的直接照射，但保证空气能自由流通，开紫外灯灭菌 20 然后关紫外灯，在超净台里将灭菌后的聚合物用 30 无菌 解，存放于 50 菌离心管内 ， 4 保存。 色法测细胞活力 将 *103细胞 /孔的密度接种于 96孔细胞培养板中，每孔加入 100 L 含 10 37 ， 5 4 h。取 100 5胞孔中，实验前溶液超声分散。溶液浓度分别为 5， 10， 15， 20 每个浓度设 4个复孔，同时设立 5 胞在同样条件下培养 24 孔加入 5 mg/0 L，37 孵育 3.5 h，翻板法弃去孔内所有液体，可见 蓝色 结晶形成于细胞内。加入二甲基亚砜 100 L，振荡 10 色 结晶充分溶解，在酶联免疫检测仪上测定各孔在 492 算细胞存活率。细胞存活率 =(试验组吸光度 /对照组吸光度 )求平均值。 博士学位论文 - 43 - 胞转染试 验 粒 大量制备 参考鼎国生物公司柱式质粒大量抽提试剂盒，并再次酶切鉴定，用分光光度计测定质粒的浓度及纯度，具体如下： (1) 取已扩增的含 粒的菌液 150 4 ， 6000 心 15 (2) 弃去上清液，加入 10 1重新混匀细菌，再加入 10 2，轻轻倒置 4 6次，室温静置 5 加入 10 3，立即轻轻倒置 4 6次，不要在冰上放置，立即下一操作步骤。 (3) 将上述 的裂解液倒入 温放置 10 (4) 用 10 要施加外力使液体自然流出，然后将步骤 3管中的澄清的裂解液注射入平衡后的 中，弃去自然流出的液体。 (5) 加入 60 中得到固体 (6) 用 15 入 10.5 异丙醇沉淀 温放置 5 (7) 取出 30 步骤 6 中的稀释液 和异丙醇的混合 液 倒入注射器中， 插 入活塞使液体经过 (8) 从 30 出活塞，重新放 加入 2 0乙醇进入注射器，插入活塞使乙醇彻底通过 过拔出与插入活塞使