【毕业学位论文】（Word原稿）TGF-β3对脂肪间充质干细胞向纤维软骨细胞诱导分化的影响脂肪干细胞的研究进展

兰州大学硕士研究生学位论文 脂肪间充质干细胞 向纤维软骨细胞诱导分化的影响 1 文献回顾 脂肪干细胞的研究进展 1. 引言 脂肪干细胞 (存在于脂肪组织中的间充质干细胞 (具有多向分化的潜能。该细胞 由 于 2001年首次从人抽脂术中抽取的脂肪组织悬液中分离获得 1。目前，发现脂肪干细胞广泛分布于不同物种，如人、鼠、猪、犬及兔等不同部位的脂肪组织中。由于提取方法简单、创伤小、获得的细胞数量大，脂肪干细胞已成为组织工 程中种子细胞研究的热点 2。 2. 脂肪干细胞的分离 分离脂肪干细胞的脂肪组织主要来源于抽脂术后废弃和切取的脂肪组织。从脂肪组织中分离细胞的方法最早由 0世纪 60年代报道，随后又不断的被改进 3。显然，良好的分离技术可获得更多数量的脂肪干细胞，保证脂肪干细胞的活性功能和维持其多向分化潜能。脂肪组织供体的差异可能也影响分离的脂肪干细胞活性。一般认为，脂肪干细胞的附着和增殖能力随供体年龄增加而降低。但 肪干细胞的衰老与供体的体质指数呈负相关，而与年龄无关。由于不同部位脂肪组织的生 物代谢特点不同，来源于不同部位的脂肪干细胞数量和分化潜能可能不同 4。 腹部、大腿和乳房来源的脂肪组织相比，人前臂脂肪组织中含有更多的脂肪干细胞 5。有研究还发现，不同脂肪组织中的脂肪干细胞含量不同。脂肪干细胞在鼠白色脂肪组织中的含量明显高于棕色脂肪组织 6。 3. 脂肪干细胞的培养 脂肪干细胞在培养过程中，同样需要保持细胞增殖活性和多向分化潜能。很明显，培养条件是影响脂肪干细胞的重要因素。 报道，低糖可能更有利于维持脂肪干细胞的多分化潜能，而培养液中的抗生素对脂肪干细 胞的细胞表型和分化能力无影响。由于脂肪干细胞在体内常处于低氧环境中， 研兰州大学硕士研究生学位论文 脂肪间充质干细胞 向纤维软骨细胞诱导分化的影响 2 究了氧浓度对脂肪干 细胞的影响，发现氧浓度和血清浓度过高、过低均不利于维持脂肪干细胞的生物特性 7。最近，有学者发现，经硒处理后的脂肪干细胞增殖活性和多向分化能力均明显增强，其机制可能是通过抑制 调节2 和 号通路发挥作用 8。脂肪干细胞的需求量大，常需冻存。研究表明，长时间冻存对脂肪干细胞的表型、增殖和分化没有影响 。有学者比较不同冻存液对脂肪干细胞的影响，结果发现 存 液保存的脂肪干细胞活性最高，但各冻存液对脂肪干细胞的分化能力没有影响 9。 4. 脂肪干细胞的鉴定 人的脂肪干细胞和骨髓来源的间充质干细胞 (面抗原 90 以上都是一致的。但有学者发现脂肪干细胞存在存 骨髓间充质干细胞情况正相反 10。有研究表明，不同来源和分离培养的脂肪干细胞表面抗原基本是一致的，其中， 为多向分化标志，表明脂肪干细胞具有多向分化潜能。已 经证实 一种干细胞因子受体，在全能或多能干细胞中表达，包括胚胎干细胞 (而且脂肪干细胞还表达胚胎干细胞的标记物，如 4， 可能是脂肪干细胞跨胚层分化的分子基础 11。最近有研究发现，脂肪干细胞的标记物会随着培养时间的延长而有所改变。早期原代培养的脂肪干细胞中存在造血干细胞以及内皮祖细胞的标志分子，培养 3-5 d 后显著下降，这可能与原代培养的脂肪干细胞含有多种细胞成分有关。但也提示脂肪干细胞可能存在不同的 “干细胞 亚群 ”12。众所周知，干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。由于目前尚未发现脂肪干细胞的特异细胞标记物，因此，通过诱导细胞分化为多种成熟功能细胞的方法可鉴定获得脂肪干细胞 13。 5. 脂肪干细胞的多向分化潜能 软骨细胞分化 多次传代后的脂肪干细胞仍能保持向软骨分化的能力。 研究表明，脂肪干细胞向软骨分化后，长时间培养，其软骨细胞表型稳定。有研究发现，不同部位来源的脂肪干细胞诱导成软骨细胞能力不同，关节周围组织来源的诱导成软兰州大学硕士研究生学位论文 脂肪间充质干细胞 向纤维软骨细胞诱导分化的影响 3 骨的能力更强 14。一 般认为，低浓度胎牛血清有利于脂肪干细胞向软骨细胞分化。但最近国内有学者报道，含 10 软骨诱导液更利于脂肪干细胞向软骨细胞方向增殖和分化。研究还发现，高密度种植更利于脂肪干细胞向软骨细胞分化，这可能因为密集种植脂肪干细胞，减少了细胞间的间隔，使细胞间相互作用增加而促进脂肪干细胞向软骨细胞分化 15。目前，常用的生长因子有转化生长因子 、胰岛素样生长因子 I、骨形态发生蛋白、表皮生长因子等。对于哪种生长因子最好，目前还不了解。有学者发现，单纯应用生长因子可使脂肪干细胞表达胶原 X、软骨细胞发生退变，而且 ，单一生长因子在体外可能不能诱导脂肪干细胞表达 型胶原。由于体内环境复杂，生长因子众多，因此联合应用生长因子效果可能更好。大剂量的生长因子能提高诱导后的脂肪干细胞中 型胶原和蛋白多糖的含量，改善组织工程软骨的生物品质 16。 脂肪细胞分化 已证实诱导后的脂肪干细胞可表达脂蛋白、脂肪酶、过氧化物酶体增殖物激活受体 等多个脂肪细胞基因，而且细胞质内可见脂滴形成。多次传代后，脂肪干细胞仍有向脂肪细胞分化的能力。目前，对脂肪干细胞分化为脂肪细胞的机制仍不清楚。有报道认为，抑制脂肪干细胞中的 号通路 可提高脂肪干细胞的成脂能力 17。值得注意的是，多个独立研究发现，脂肪干细胞的成脂与成骨密切相关。 发现，大约有 65 个基因参与调控脂肪干细胞成脂与成骨的平衡。深入研究这些基因，可能有助于理解调节脂肪干细胞的成脂成骨分化的机制。与诱导脂肪干细胞分化成软骨细胞一样，不同的培养条件对脂肪干细胞的影响不同。有研究称无糖的 高糖的 能促进脂肪干细胞成脂分化 18。 成骨细胞分化 脂肪干细胞具有向成骨细胞分化的能力，并且不受供体年龄的限制。供体性别可能对 脂肪干细胞的成骨分化有影响。雄性新西兰大白兔的脂肪干细胞的成骨能力高于雌性大白兔。目前，多个研究小组对脂肪干细胞的成骨机制进行了研究，发现 号通路对调节脂肪干细胞向成骨细胞分化起重要作用 19。 认为，抑制 号通路可促进脂肪干细胞向成骨细胞分化，同时也降低了脂肪干细胞的增殖 ， 但也有相反报道。也有学者报道，降低 表达，可抑制脂肪干细胞的增殖，促进脂肪干细胞的成骨分化，同时不影响脂肪干细胞的成脂分化。可见，可能有多个信号途径参与调节脂肪干细胞的成骨分化。研究还发现，兰州大学硕士研究生学位论文 脂肪间充质干细胞 向纤维软骨细胞诱导分化的影响 4 适度的机械刺激能 促进脂肪干细胞向成骨细胞分化，这可能有助于组织工程构建大块骨组织 20。 其他细胞分化 现发现脂肪干细胞还可跨胚层分化成中胚层以外的细胞，如肝细胞、内皮细胞、心肌细胞、胰腺细胞和神经细胞等。目前，对脂肪干细胞的这种跨胚层分化机制仍不了解。尽管对脂肪干细胞在体内能否分化成具有功能的中胚层以外的细胞还有争议，但这已经预示了脂肪干细胞具有广泛的应用前景。作为组织工程的种子细胞：现认为应用于再生医学或组织工程的理想干细胞必须符合以下条件：含量丰富；分离方法无伤害性；多分化潜能具有可调控性和可再生性；自体 或异体移植具有高效性和安全性；具有符合目前医疗实践指南的操作标准。已知脂肪干细胞含量丰富，分离方法简单，吸脂术安全，对患者伤害小，脂肪组织易再生，可反复获取 21。应用于直接细胞治疗：脂肪干细胞能分泌多种细胞因子，如白细胞介素 管内皮生长因子、肝细胞生长因子、肿瘤坏死因子等。因此，脂肪干细胞还有可能通过旁分泌细胞因子促进组织修复。经静脉注射的脂肪干细胞可自主聚集于病灶部位参与修复损伤。脂肪干细胞的这种 “归巢 ”作用，其具体机制不明。有报道称通过增加膜型基质金属蛋白酶 1 表达和促进 原的激活可增 强脂肪干细胞的迁移。近期研究发现，脂肪干细胞能释放新的线粒体至损害的细胞，从而挽救有氧代谢的过程。这说明脂肪干细胞可通过多种机制参与组织的修复 22。基因治疗的载体：由于体外条件下外源基因容易导入脂肪干细胞，并且在体内可稳定表达，因此，脂肪干细胞还可作为基因治疗的目的基因载体。最近， 利用脂肪干细胞作为药物细胞载体，通过其 “归巢 ”作用成功抑制了小鼠黑色素瘤的生长 23。 6. 存在问题与展望 虽然对脂肪干细胞的研究越来越深入，但仍然有许多问题尚未解决。由于体外不能充分诱导脂肪干细胞的分化，且分 化后的细胞功能与正常成熟细胞存在差异。如何高效、廉价、安全的诱导脂肪干细胞分化和应用是目前急需解决的难题。现多数脂肪干细胞的研究为体外试验，对于体内微环境特别是病理状态下的微环境与脂肪干细胞的相互作用，以及脂肪干细胞如何被调控定向分化，几乎一无所知，而这恰是理解体内脂肪干细胞作用机制的关键所在。脂肪干细胞是一种来源广泛、含量丰富、分离简单的成体间充质干细胞。随着作用机制的深入研究，脂兰州大学硕士研究生学位论文 脂肪间充质干细胞 向纤维软骨细胞诱导分化的影响 5 肪干细胞有望成为临床上良好的种子细胞。 兰州大学硕士研究生学位论文 脂肪间充质干细胞 向纤维软骨细胞诱导分化的影响 6 参考文献 1 A,et 001,7(2):2112 ,et of of SC)an in 007,359(2):313 of of (of on 966,241(1): 4 ,J,et of 004,6(1):75 ,G,on of 008,60(5):5386 ,et to in 006,312(6):727 7 T,E,E,et of in 008,122(3):7258 H,R,H,et of in 008,26(10):2724 9 , ,et of 008,17(135 10 A,A,et of on 003,89(2267 11 ,J,C,el of by . 008,375(4):547 12 W,S,C,et of 008,17(4):681 13 ,et of 007,327(3):449 14 , ,et of of in 006,54(3):843 15 胡生锁 ,胡蕴玉 ,魏义勇 ,等 J中国矫形外科杂志 ,2007,15(11):860 16 ,et of of 州大学硕士研究生学位论文 脂肪间充质干细胞 向纤维软骨细胞诱导分化的影响 7 008,26(3):132 17 P,W,S,et nt of J008,41(6):859 18 ,fo of . 009,11(1):5219 R,E,M,et in 008,19(2):360 20 J,T,C,et in of 008,83(25851 21 M,J,007,100(9):1249 22 W,et in in a of 009,27(3):295 23 , ,et in 008,10(10):1071兰州大学硕士研究生学位论文 脂肪间充质干细胞 向纤维软骨细胞诱导分化的影响 8 第一部分 脂肪间充质干细胞向纤维软骨细胞诱导分化的影响 由于 纤维软骨缺乏自我修复能力，颞下颌关节盘软骨损伤的修复一直是口腔科医生面临的巨大挑战 1。近年来 纤维软骨组织工程技术的发展为解决这一难题提供了新的方法。但由于 纤维软骨细胞来源少，增殖有限，不能满足临床需要。脂肪 来源 的间充质干细胞 (由于具有强大增殖和多向分化能力，且易于获得，已成为纤维软骨组织工程研究的重要细胞来源 2脂肪组织来源的脂肪干细胞，与其它成体 干细胞一样具有自我更新和多向分化的能力，在适宜诱导条件下经诱导可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等 5,6。因此诱导 成纤维细胞样细胞分化，合成与纤维软骨相似的细胞外基质 (有可能是纤维软骨组织工程中解决细胞来 源问题的重要途径。转化生长因子 (广泛用于脂肪 干细胞的 纤维软骨分化 7。国内外许多研究表明使用转化生长因子 导干细胞向软骨细胞分化 8,9。但使用 转化生长因子 导脂肪间充质干细胞向纤维软骨细胞分化 的研究 却很少见。 族的生物化学结构及功能：转化生长因子 一族多肽类生长因子，胚胎形成期可诱导原始的间充质干细胞 (化形成软骨组织 2。所有 族成员都具有一些共同的结构特征 3，是由多种细胞和组织产生的一类同源二聚体多肽分子，分子量约 25条多肽链含 110氨基酸残基。所有 关因子显示与 序列相似性，是 家族的一员，通过 体及其细胞内信号系统 将信号传递到细胞核内而起到多种不同的生理调节作用 4。 本研究采用聚集体培养通过使数量较多的 鼠 合在一起，选用转化生长因子 用于 察 分化和生物合成情况 ，充分发挥 自分泌及旁分泌作用，有可能促进纤维软骨细胞胞外基质分泌以及表型的表达； 通过观察细胞的形态变化，组织学和免疫荧光染色等 检测生 括 I/胶原和蛋白多糖 )的情况，初步评价 为工兰州大学硕士研究生学位论文 脂肪间充质干细胞 向纤维软骨细胞诱导分化的影响 9 程化纤维软骨种子细胞的可行性。 1. 材料与方法 材料与仪器 鼠 购自 司 ； 胞培养液购自 司 ； 胎牛血清购自杭州四季青公司 ； 兔抗鼠 I 型胶原抗体， 胶原抗体购自 司 ； 记的羊抗兔抗体 购自 司； 阿利新蓝染色购自 司 ； 荧光显微镜 号 1 鼠 培养 胞解冻后种植于细胞培养瓶中，加入 10%胎牛血清的 养液，置于 37 5% 培养箱内培养。 48 小时首次换液，以后每隔 2 天换液一次，逐渐除去非贴壁细胞，约 5后细胞达到融合，当细胞融合至 80加入 酶消化液，按 1:3 的比例传代。 导 纤维软骨细胞分化的细胞形貌观察 选择第三代细胞以 度接种于离心管中进行三维培养。随机分为两组：第一组加入含 0g/成纤维软骨诱导液 (含 10%胎牛血清 (杭州四季青公司 )和高糖 养基 (诱导分 化培养 14 天；第二组加入不含 基础培养液培养作为对照组。通过显微镜动态观察细胞生长 状态。 兰州大学硕士研究生学位论文 脂肪间充质干细胞 向纤维软骨细胞诱导分化的影响 10 阿利新蓝染色 细胞培养 14 天后，采用 4多聚甲醛 固定细胞后石蜡包埋组织制作显微切片，阿利新蓝染色液 (50浸染 30 分钟。蒸馏水终止染色。 95%乙醇分化 10秒，显微镜下观察染色 结果 。 免疫组织化学染色 消化细胞种植在离心管中进行培养。细胞数量为 2 天换培养液， 4多聚甲醛固定后石蜡包埋组织制作显微切片，加入 300l 穿透液(穿透 30 分钟。吸去穿透液，加入正常山羊血清封闭液 140l，封闭 50 分钟后，吸去封闭血清，分别加入 100l ， 1： 200， 在保湿盒中 4 孵育过夜。 胶原兔抗鼠抗体 (I， 1:200， 在保湿盒中 37孵育 1 小时。吸出抗体溶液后加入 记的羊抗兔抗体 H+L)， 115 1:100 稀释，分别加入 100l， 37光孵育 1 小时，然后取出 入 140l 液 (室温避光孵育 30 分钟。吸去染液，加入 涤；最后添加 用荧光倒置显微镜观察各抗体表达情况。 2 结果 导分化前后的细胞形态变化 倒置荧光显微镜观察结果显示 胞在 导下呈现 明显 不同的形貌特征。图 1（ a）显示 在未加入 长因子下，细胞呈聚集生长，细胞外基质分泌较少；经 长因子诱导之后，细胞有明显的聚集生长现象，形态呈多角形、多边形，细胞外基质分泌增多（图 1（ b）。 兰州大学硕士研究生学位论文 脂肪间充质干细胞 向纤维软骨细胞诱导分化的影响 11 图 1 倒置显微镜下观察 用前后形态变化情况（ 200）。 （ a）未加入 b）加入 a) b) 00). 利新蓝染色 阿利新蓝染色结果显示 未有 导下，未见明显的蓝色，空泡多见（图 2a）。而经 导后 胞染色呈蓝色，并且可见明显的异染性着色，空泡少见（图 2b）。这表明 长因子诱导下能合成大量的 糖胺 聚糖。 图 2 糖胺聚糖阿利新蓝染色（ 400）。 （ a）无 照组；（ b） 。 00). (a) (b) 兰州大学硕士研究生学位论文 脂肪间充质干细胞 向纤维软骨细胞诱导分化的影响 12 型胶原和 型胶原免疫组织化学染色 图 3 显示了合成胶原基质的免疫组织化学染色。 I 型胶原免疫化学细胞染色结果显示，在没有 诱导下，没有明显的 I 型胶原合成，表达不明显，胞浆呈浅黄色，而胞核染色为蓝色（图 3A）；在 诱导下 , I 型胶原免疫化学细胞染色显示染色结果明显，呈强阳性，胞浆呈明显的棕褐色，胞核染色呈蓝色，且在 I 型胶原表达越密集的区域染色越强（ 图 3C）。 对于 胶原的染色结果显示，在对照组中， 胶原免疫化学染色阴性，细胞及细胞外基质均少见，偶见胞浆呈浅黄色（图 3B）；而在诱导组的细胞染色显示 , 胶原合成较多，细胞外基质内可见棕黄色颗粒，胞核蓝染（图 3D）。 图 3 I 和 胶原免疫组织化学染色（ 400）。 I 型胶原对照组未见明显表达（ A）； I 型胶原 呈阳性表达（ C）； 胶原对照组未见明显表达（ B）；而 胶原 呈明显的阳性表达（ D）。 (400). A); C)； I B); I D)； 兰州大学硕士研究生学位论文 脂肪间充质干细胞 向纤维软骨细胞诱导分化的影响 13 3. 讨论 关节软骨损伤的修复仍是临床面临的挑战之一。传统的治疗方法如软骨移植及关节置换术并不 能完全恢复软骨的结构，组织工程学的兴起为关节软骨损伤治疗提供了新的选择 10。组织工程软骨的构建中，关键的任务是寻找合适的种子细胞。多能干细胞因为具有多向分化能力 11，近 20 年来成为研究的热点。 12于 2001 年在人体皮下脂肪组织中提取到了具有多向分化能力的细胞，并称之为脂肪来源的成体干细胞 ( 实验表明吸脂手术吸取的每 100 脂肪组织中， 数量相当于等量骨髓中 40 倍，且成纤维细胞集落形成单位 (验中表明， 干细胞数目至少是骨髓的 500 多倍 13,14，而且 其他的干细胞分化时间要短，是目前生长最快的干细胞 15，因此有望成为优秀的纤维软骨组织工程的种子细胞。 但是，体外培养条件下 纤维软骨细胞的分化受多种因素的影响，如细胞培养基、细胞密度、细胞因子、空间组织以及机械力等 16,17。目前对干细胞的定向分化和扩增尚缺乏有力的调控手段，干细胞作为移植物定向增殖分化为器官 18，用于组织损伤修复的技术瓶颈成为阻碍其进入临床的难题 19。 转化生长因子 系列生长因子是一族具有多种功能的多肽，它能够促进细胞增殖，调节细胞分化，促进细胞合成并分泌细胞外基质 20。 一种具有双向调节作用的生长因子。关节软骨合成 无活性的形式贮存在基质，能被局部下降的 和蛋白酶激活， 用于间充质来源的细胞，促进软骨细胞增生、分化和蛋白质合成 21。 组织学实验结果表明，经 用后， 胞开始向成纤维细胞样细胞分化。阿利新蓝染色，实验组为阳性，表明诱导后细胞有合成 能力。免疫组织化学染色结果显示 I、 胶原呈强阳性，表明诱导后的细胞产生胶原的能力明显增强。 本研究在体外聚集体培养条件下证实了 以在 作用下，细胞向成纤维细胞样细胞分化，能够合成 I 型胶原及 型胶原，细胞形成许多有功能的聚集体，这些聚集体中可能具有接近的细胞 形成兰州大学硕士研究生学位论文 脂肪间充质干细胞 向纤维软骨细胞诱导分化的影响 14 类似于体内组织的结构，因而表现出比早先单层贴壁培养的细胞更好的生理功能。说明经过适当微环境诱导， 以向纤维软骨细胞方向分化，有望成为纤维软骨组织工程的种子细胞。 兰州大学硕士研究生学位论文 脂肪间充质干细胞 向纤维软骨细胞诱导分化的影响 15 参考文献 1 2010. 2006. 2 郝伟 ,胡蕴玉 ,魏义勇 ,等 中国矫形外科杂志 ,2006;21:16573 , , , et of an in 2007;2:314 H, J, Y, Y, C, M, H, C. in , 2012;18:21145 S, I. of on of , 2010;16:35696 T, , A, M, J, . of 2008;372:2307 A, A. of on 2005;11:11418 N, J, A. of on MJ 2011;7:17108. 9 J, A. of as a 2011;32:20528. 10 A, P. m,1994;27:26311 , K. 010;85:64712 A, , , et 001;7(2):21113 K, , , et an of 006;24:15014 K, , , et 008;449:5915 , 010;42:12416 ,et of on in 006;290: 17 I,A,F,et of 004;113:58518 of in 2008;22:262兰州大学硕士研究生学位论文 脂肪间充质干细胞 向纤维软骨细胞诱导分化的影响 16 19 M,. of of J 009;218:920 r J, D, et of on of 000;61:100321 , ,et of on in 004;10:1414兰州大学硕士研究生学位论文 脂肪间充质干细胞 向纤维软骨细胞诱导分化的影响 17 第二部分 诱导时间对 脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的影响 关节软骨损伤的修复一直是骨科医生面临的巨大挑战。近年来，利用软骨组织工程原理修复软骨缺损已经成为该领域研究的热 点。它是结合细胞生物学、工程学、材料科学和外科学，旨在重建新的 功能组织，为关节软骨的修复奠定物质基础，以期能够获得最终的长期的功能恢复，目前成为解决软骨修复难题中较有前景的一种途径 1但种子细胞和生物活性因子是该组织工程的难题 3目前应用的以软骨细胞为种子细胞修复关节软骨缺损的自体软骨细胞移植等方法存在诸多缺点，如种子细胞来源有限，软骨细胞体外扩 增培养时易发生去分化、无法维持其生物学特性，软骨供区损伤等。因此，该方法的应用受到了很大限制 5 因此，具有强大增殖和多向分化能力的干细胞，尤其是脂肪来源的间充质干细胞 (成为软骨组织工程研究的热点 7脂肪间质干细胞是来源于脂肪组织的干细胞，与其它成体干细胞一样具有自我更新和多向分化的能力，在适宜诱导条件下可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。脂肪间质干细胞在组织工程和细胞治疗方面具有广泛的应用前景，吸