【毕业学位论文】（Word原稿）Twist2和E-cadherin在宫颈鳞癌中的表达及意义

第一章 前言 宫颈癌是 危害女性健康 最常见的 恶性肿瘤之一。 1 报道，全球每年发生宫颈癌的人数为 女性新发癌症病例的 15%，其中，约有 发展中国家，宫颈癌的发病率占全球总数的 80%，它已成为发展中国家女性死亡的主要原因之一 2。 在我国，宫颈癌的发病率占女性生殖道恶性肿瘤的第一位， 它的 发生发展是一个多因素参与、多阶段改变的过程， 目前其病死率及预后主要取决于肿瘤的侵袭与转移 。虽然随着医学技术的不断提高，宫颈癌的发病率明显下降，但是它的转移病死率仍然很高。因此，对 于宫颈癌发生、侵袭转移的研究对于女性生殖健康的意义重大深远。 宫颈恶性肿瘤的癌前病变称为宫颈上皮内瘤样病变（即 它是一组疾病的统称，主要包括有宫颈不典型增生及宫颈原位癌。 宫颈原位癌是指宫颈上皮细胞发生癌变，但癌变未突破基底膜，也没有间质的侵害。宫颈不典型增生是指宫颈上皮细胞部分或是大部分被不同程度的异型细胞所代替，根据其侵害上皮的程度，可以分为三个级别。 各种级别的宫颈上皮内瘤样变都有可能进展为浸润癌的可能，一般来讲，级别越高，进展为浸润癌的机会越多；级别越低，恢复正常的机会越多。宫颈上皮内瘤样变主要 是反映 宫颈癌连续的 发生发展过程，经历由宫颈不典型增生 (由轻到重 )发展为原位癌，再由早期浸润癌 浸润癌的一系列病理变化。美国国立癌症研究所（ 出的 断标准：将鳞状细胞异常从细胞学的角度上分为 3 类：不典型鳞状上皮（ 轻度鳞状上皮内病变（ 重度鳞状上皮内病变（ 相当于 少发展为宫颈浸润癌。- 相当于 能会发展为宫颈浸润癌。 碱性螺旋环螺旋（ 白家族结构上非常 保守，它们都含有一个碱性氨基酸链 (100p)连接 2个 螺旋结构，在胚胎肌组织、神经、造血和心脏、骨形成等的过程中起重要的作用，同时也可以负性调控细胞的分化、组织的形成 3. 性结构域则拉在一起形成一个双向的 异性的识别 指任何核苷酸 )，即所谓的，来激活或抑制靶基因的转录。 于于 1983年最早在果蝇中发现， 之后在鱼类、水母、线虫、青蛙、鼠类、人类中相继发现。 们均能编码碱性的螺旋 螺旋 且 ,在小鼠和人类的氨基酸序列中，它们具有 96%的同源性，在不同种属中它们的00%的序列保守性，均能结合 的 含有 1个内含子， 2个外显子。其中 第 1个外显子长为 772 整个编码区域都包含于其中；内含子长为 538669 发挥转录因子的作用是通过形成二聚体的方式实现的 5。脊椎动物有两种 号染色体， 号染色体 6， 7。人类 995年 被发现 ,它的 80码蛋白和 者在 末端结构域相似率 90%以上， 参与 8，但是 9，因此两者的氨基端有些不同。 60个氨基酸，分子量为 18电点为 03个氨基酸，分子量为 21守的 59氨基酸到第 118氨基酸，其中包括 20个氨基酸碱性0个氨基酸的螺旋 螺旋的结构域。靶基因启动子与是通过其羧基端的结构域与转录因子 2发挥转录的功能。 多种组织细胞中，包括真皮、肌肉、脂肪、成骨细胞、软骨等的分化中起重要作用。研究发现，小鼠的 10。 在分化的早期阶段增加，晚期则降低。对将 验结果 证明比 3天未分化的骨母细胞，在 21天己分化的骨母细胞中 个实验提示 11。在小鼠脂肪细胞分化的过程中 12。因此，我们推论 果蝇胚层发育的过程中， 物模型提示： 及异源同组双突变的小鼠表型与 同，都会在出生后出现严重的能量耗竭，这提示 于人类， 对胚胎发育过程中的细胞重建及迁移发挥着重要作用。研究发现，括骨骼的轴部及其附属物的间叶细胞前体、颅面部的腭部上颌骨发育的间叶细胞）形成的整个过程中，并且它在真皮发育中的作用与一型胶原发生重叠。在人类的周围中胚叶细胞及成软骨细胞（软骨盘的早期）中，均可检测出 现在手、足趾的末端。在人体皮肤的表皮下未分 化的早期间叶细胞层也可见 外， 中包括分泌酶的胃主细胞，也可见于前列腺上皮细胞、肝细胞、肾上腺皮质、肾集合管和分泌管、细支气管和肺泡、睾丸生精管、卵巢滤泡粒层细胞及一些发育中的内脏、肾脏、肺脏、结缔组织 6。 胞中也表达，提示它可能在能量自稳态的调节中起一定的作用 。研究表明： 列腺组织中高表达，在心脏、脊髓、肾脏、肝脏、肌肉中较多表达，在胰腺、脑中度表达，但是在胸腺、脾脏中却不表达。结合以上研究成果，并对人、鸡和鼠源的 基因组中符合这一特点的基因大多是具有复杂功能且在调控细胞生长、分化等方面发挥重要作用的基因。 恶性肿瘤是一类细胞周期失控性疾病， 肿瘤发生的主要表现特征是细胞增殖失控和细胞凋亡抑制。 当细胞促凋亡基因活性受到抑制和 (或 )抗凋亡基因被激活，导致细胞增殖 /凋亡失平衡，则造成恶性肿瘤形成。 13 发现， 而 转录和翻译两个方向抑制 而来对抗 鼠双微体 2/制细胞凋亡的出现，使得细胞大量增殖 14 。 在 ， 丝氨酸 20的自身磷酸化是不可或缺的重要步骤， 止 外 , 300介导的乙酰化， 间接抑制 15 。实验发现，在 16 。 目前对小鼠细胞的研究认为 急、慢性凋亡刺激起保护作用。 抗由 17， 仅该细胞的 且对 验构建一组将 现删除 够去除该蛋白抑制 而缺乏 们抑制些实验说明 65活性的部位在羧基端。实验证实， 激活参与组蛋白脱乙酰化。 8等研究证实 活性，减少在成熟 1的表达，从而抑制了由半乳糖凝集素 外。作用于 细胞中的表达。 著降低 不是增加 比 实 肿瘤 是人体器官组织的细胞在外来和内在的有害因素的长期作用下所产生的一种以细胞过度增殖为主要特点的新生物。 由于表观遗传学或遗传基因等各种因素的改变，会导致正常的细胞发生一些生理学的改变，从而引起肿瘤的发生。这些生理学的改变主要包括 : 对生长抑制信号的不敏感；获得自给自足的生长信号；抵抗细胞凋亡；获得血管新生的能力；获得无限增殖的潜能；获得浸润与转移能力。其中，浸润和转移是大部分肿瘤致死率高及预后不良的主要因素。研究表明 改变过程 19。 上皮细胞向间叶细胞的转变）是指在一些因素的作用下，上皮细胞失去了细胞极性 , 丢失了细胞间的紧密连接和黏附连接 , 细胞骨架得以重塑 , 从而获得了浸润性和游走迁移的能力 , 变成了具有间叶细胞特性和形态的细胞。 0于 1982年研究发现晶状体的上皮细胞在胶原凝胶中能够形成伪足，转变为间质细胞样的形态，遂提出了上皮间质转变这一概念。随后陆续有报道称神经嵴、颅面部、心脏、神经系统、骨骼肌系统是胚胎细胞通过 着非常重要的作用 但同时它也可能会导致器官纤维化并通过多种机制来促进肿瘤的发生与发展。是早期肿瘤获得侵袭性表型的重要步骤30。 可以防止细胞凋亡和衰老 ,导致免疫抑制。 在皮细胞间的黏附结构逐渐消失，导致细胞间黏附力下降，细胞的极性和骨架被改变，进而使抗凋亡能力增强 21,22 。研究报道，一些上皮来源的肿瘤细胞能够通过发生 而获得间充质细胞的表型，肿瘤细胞也在此基础上获得了侵袭 和转移的能力。另外研究报道当恶性肿瘤细胞中出现 可以视为肿瘤浸润转移的开始 23。因此 质降解蛋白酶及间质标记物如 24。 上皮组织中一类依赖 细胞间粘连跨膜糖蛋白分子，参与 赖性细胞粘附的过程。它的编码基因位于 16号染色体上，主要由含 合位点的胞外区、疏水的跨膜区、保 守的胞内区共同组成，其中胞内区包含环连蛋白（ 其他调节蛋白的结合位点。当 在时，邻近细胞间的 此复合体再直接连接到肌动蛋白的细胞骨架上，从而介导细胞间的紧密连接和细胞内外的信号转导，它对于维持上皮的极性和完整性发挥着重要的作用 25。这对于成体器官中上皮组织的功能发挥及动态平衡是必不可少的。研究发现，在上皮性肿瘤进展的过程中，均发现 程度的丢失或功能抑制，并与肿瘤的分化、分期密切相关。它还 与肿瘤的浸润、转移及复发呈负相关，能够预示肿瘤的进展和预后。 体外实验还发现侵袭性肿瘤细胞可通过转染 26。 够触发 将 它在肿瘤细胞株和移植瘤小鼠模型中表达上调，促进了肿瘤的侵袭，并与临床预后差的人类癌症相关。根据近几年的研究表明， 27 研究发现当 路受到抑制时， 而诱导间质向上皮逆行转换。胎发育，炎症和癌症）中上调，主要信号有氧，配体结合的受体酪氨酸激酶的激活和炎症细胞因子受体 28,29。如 30。目前， 道 表达下调 31。实验发现，肿瘤细胞 的结构越混乱、癌细胞的异型性越高、侵袭性越强 , 集中、染色越深 32。迄今为止，很多研究均提示 制非恶性细胞分化 33,9,8,11，是诱导非恶性细胞肿瘤的发生，促进恶性细胞肿瘤形成、发展和转移的一种新型癌基因。 可能在人类肿瘤的发生、发展中同样发挥着重要作用。 2 研究依据 与 达的重叠性，功能上的部分一致性的特 点。但是， 两者的表达强度在不同组织中存在着很大的差别，虽然 是对 有研究证实，在膀胱癌 34胃癌、前列腺癌 35、食管癌 36、鼻咽癌 37、口腔鳞状细胞肿瘤 38、妊娠滋养细胞肿瘤 39中出现 为与 在人类肿瘤的发生、发展中是否如 究表明： 是在不同器官的表达 量不同；而 有研究证实，乳腺癌中 布在细胞质中，细胞核也有少量的表达； 要分布在细胞膜和细胞质上；而在胃癌组织中， 40研究发现 对肝癌的浸润与转移无影响，与 是， 在乳腺癌中的表达虽然也增加，但分布在细胞核中；在胃癌组织 、非癌的胃组织、癌旁组织中虽都有表达，主要是分布在细胞质，但未存在着明显的差异性； 对肝癌的浸润与转移有影响，与 据以上这些研究，结果提示 不同的肿瘤中亦有不同的功能。目前 有初步研究显示它与肿瘤发生发展相关 17,33。作为一种新的癌相关基因， 是发挥与 制 导 是有其自己独特的功能 ?因此 本文主要探讨 否与宫颈癌的发生相关，分析 袭以及转移中的功能。对于 助于我们对同一基因在不同肿瘤中差异作用的认识，将对宫颈肿瘤的发生、发展机制有进一步的了解，同时对宫颈癌的预防、早期诊断、治疗与判断预后均有重要的指导意义。 第二章 材料与方法 料 织标本 1、选取 2010 年 06 月 04 月 兰州大学第一医院妇产科行 宫颈癌手术或宫颈组织活检切除的 162 例宫颈组织，其中 正常宫颈组（ 30 例）、低度病变组（ ）（ 35 例）、高度病变组（ - ）（ 44 例）、宫颈鳞状细胞癌组（ 53 例），（按国际妇产科联盟 (009 年手术分期，宫颈鳞状细胞癌组中 a 期 22 例， b 31 例；根据术后病检证实是否存在淋巴结转移，分为无淋巴结转移组（ n=23)和有 淋巴结转移组（ n=30)；根据患者的年龄，分为45 岁组（ n=37)和 45 岁组（ n=16)；根据癌细胞组织学分级分为高、中分化组（ n=14)、和低分化组（ n=39)）。这些标本用于免疫组织化学的检测。 2、另取 60例 (20例宫颈癌、 20例 20例正常宫颈 )新鲜的宫颈组织，于离体后 30理盐水冲洗干净，立即放入液氮中冻存，以备 3、所有标本均经两位病理医师诊断证实，术前均未接受放化疗及其他特殊治疗。 验所需的 主要仪器 恒温水浴箱 上海荣计达实验仪器有限公司 酶标仪 瑞士帝肯（ 超净工作台 山东博科 纯水器 北京亚兴泰机电设备有限公司 学倒置显微镜 日本 低温高速离心机 美国贝克曼公司 燥箱 上海艾测电子科技有限公司 5 无锡盟合试验仪器有 限公司 量移液器（ 5ul,0ul,200 上海亚荣生化仪器厂 垂直电泳槽 美国 司 转移电泳槽 美国 司 分析天平 日本岛津电子 浴恒温振荡器 上海雷韵试验仪器制造公司 北京君意 显恒温水浴箱 北京中科三 研科技有限责任公司 胶电泳仪设备 湖南东大科学仪器设备有限公司 平摇床 太仓市科教器材厂 包埋机 轮转式组织切片机 德国 病理组织漂烘处理仪 冰箱 海尔冰箱 普通电磁炉 海尔 湿孵育盒 自制 隔水式电热恒温培养箱 厦门华之鑫商贸有限公司 通高压锅 苏泊尔 实验所需的器械 眼科镊，枪状镊，组织剪，玻璃平皿，量筒（ 1005001000烧杯（ 10005000移液管，冻存管， 纸， 普林瓶，避光片盒，载玻片，盖玻片，片盒等 验所需的主要试剂、来源及配制 兔抗人 美国 兔抗人 武汉博士德生物技术有限公司 兔抗人 武汉博士德生物技术有限公司 武汉博士德生物技术有限公司 北京中杉金桥生物技术开发有限公司 免疫组化 北京中杉金桥生物技术开发有限公司 北京百泰克公司 蛋白电泳预制胶、 美国 上海碧云天生物技术研究所 蛋白提取试剂盒 ( 上海碧云天生物技术研究所 二甲苯 上海试剂公司 3% 封闭用血清工作液 北京中山金桥生物技术有限公司 4的多聚甲醛 苏木素染色液 柠檬酸盐修复液 兰州大学第一附属医院病理科免疫组化室提供 其他化学试剂如下： 1、 2% 分离胶 和 5% 浓缩胶胶版。 12%分离胶 的配制：体系 5成成分 12分离胶 (蒸馏水 0%丙烯酸胺 0%0%过硫酸胺（ 用移液器将 上述 组分 依次加入到 10燥清洁 的 小烧杯中，轻轻吹打 使其均匀 。 将其 紧贴玻璃板沿制胶板一角缓慢灌入凝胶板间（高度大约离开口 高影响浓缩胶的灌制），使用超纯水封顶压线，室温静置 20钟。此时在水和胶之间可清楚的看到一条折射线，表明胶已经凝固。小心倒去玻璃板间上层蒸馏水，并用吸水纸将水吸干。 5%浓缩胶 的配制： 体系 成成分 5%浓缩胶（ 蒸馏水 0%丙烯酸胺 0%0%过硫酸胺（ 用移液器将上述组分依次加入到 5轻吹打均匀，紧贴玻璃板沿制胶板一角缓慢灌入至玻璃板口，迅速将齿梳插入玻璃板 间，室温静置20浓缩胶充分凝固后，两手缓慢向上平行拔出齿梳。蒸馏水冲洗玻璃板表面残胶及板间浓缩胶梳齿孔以清理残胶碎片，之后使用微量注射器吸净齿梳间水，固定与电泳槽中备用 ， 4保存。（注：凝胶液注入玻璃板夹层时要将气泡充分排出，梳齿插入玻璃板时每孔中都不应该有气泡） 2、 5蛋白上样缓冲液 ： 1 的 H g； 溴酚蓝 50油 5水定容至 10匀。 3、 1蛋白电泳缓冲液 ： g；甘氨酸 g； 定容至 200 4、脱脂牛奶封闭液： 5g 牛奶溶于 5液 20，加 定容至100 5、 5液： 0g； 入 定容至500 溶液 到 储液稀释成为 1， 500入 250 膜液。 6、 1000酸氢二纳 化钠 化钾 匀，测 偏离此范围，可用 存于室温。 7、 柠檬酸盐抗原修复液：用 1000g，匀，测定 温保存。 8、苏木素染液配制：原料为苏木素 1g、无水酒精 50醋酸 5油 50馏水 50酸铝钾 5g，将苏木素溶于无水酒精中，硫酸铝钾溶于蒸馏水中后将所有原料都加在一起，充分搅拌均匀。 2 2 实验方法 蛋白印记法（ 目前对蛋白进行定量及定性检测最常采用的检测手段，其核心步骤是使用 先是将提取的膜蛋白标本与 蛋白质变性并解离为多肽，随后在电泳过程中将已经解离的蛋白多肽与强阴离子去污剂 成带负电荷的 通两极间的电流后，在凝胶中形成正、负极移动界面，带动 先在浓缩胶层上进行初步蛋白分离，之后进入分离胶层进一步按分子量大小对蛋白质进行 区带分离，然后通过转膜仪将凝胶上的蛋白质转移到 行随后的抗原抗体反应及荧光显色。实验中参照系的设置对于实验本身及数据的分析至关重要。如蛋白 握电泳结束时间，确定目标蛋白位置等。而 表达相对恒定，受环境影响变异不大的标准内参基因的设置不仅有助于实验数据误差矫正，对转膜效率及显色系统（显影液、定影液质量等）也具有一定的检测作用。 颈上皮内瘤变和宫颈鳞状细胞癌中 蛋白提取 （ 1）将收集的新鲜宫颈组织取 50织剪剪碎，将样本收集到 5 （ 2）按 1001000匀浆器中反复研磨以裂解细胞。 （ 3）在冰浴中超声波彻底破碎组织样本，超声波程序为：脉冲 3秒，停顿 10秒，50% 功率，共 15秒。 （ 4） 4 ， 12000r/心 10分钟，上清液即为样本总蛋白悬浮液，吸取上清液到一个新的微量离心管中，弃沉淀。 （ 5）取 20浓度的测定，从剩余样品中取出 160入到另一个含有 40L 5蛋白上样缓冲液的 量离心管中，混匀，盖紧盖子并用封口膜密封，于 95 沸水浴中煮 5分钟，所得样品可直接用于冻存于 冰箱。 白含量检测： 目前常用比色法测定样品蛋白的含量： （考马斯亮蓝法）、 等。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据使用的裂解液的不同，需要采用 适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大，本实验采用 。 是 定法的一种改进方法，是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与 蛋白定量相似，即在碱性条件下蛋白质分子中的肽键能够与 合，生成络合物，并且将 原成 二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，和 合形成稳定的紫蓝色复合物，在 562有高的光吸收值，并且化合物的颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。与 相比 ， 白测定方法操作更简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性更好，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度高（微量检测可达到 应用更加灵活。与 敏感度最高，且与一系列干扰 应的还原剂（如 基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。 检测具体步骤：将 5u 试剂与 250应色呈嫩绿色。用100l）与 4000ug/100l）混合，总体积为 200000g/ 100 000 g/m 。依此倍比稀释共 7次，得到的 2000 g/250g/125g/行蛋白浓度的测定：将 2005温静置 30分钟，紫外分光光度仪测定 562计算蛋白浓度。 验流程： （ 1） 胶的浓度与目标蛋白的分子量相关， 子量为 18于小分子量蛋白，因此使用 12分离胶， 5%的浓缩胶。 制备 12% 分离胶和 5% 浓缩胶胶版。 （ 2）上样及电泳： 按照电泳槽的要求将做好胶的玻璃板固定放好，将 1蛋白电泳缓冲液倒入 两玻璃板之间至玻璃板的上缘，检查是否漏液。使用微量加样器加入蛋白样品和蛋白 孔样品的上样量约为总蛋 白 60g。电泳槽内灌入电泳缓冲液至电泳槽二分之一的高度， 上样时尽量保持上样量体积一致，每次上样结束都要清洗微量上样器，防止标本交叉污染。上样结束后 以恒流 15方式进行电泳。 直到溴酚蓝移至胶底，蛋白 离清楚。 关闭电源终止电泳。 (注意 :应选择合适的胶浓度和电压电流参数，确保蛋白有效分离，条带清晰整齐。 ) （ 3）转膜：将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体上。（杂交膜的选择是决定 败的重要环节 ）根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小，本实验选用 。 A将 1阳极缓冲液 I、 1阳极缓冲液 1阴极缓冲液、蒸馏水各 100一定次序摆放并标明。 (应根据蛋白大小，选择合适的转膜体系及电流参数和时间，通过调整缓冲液成分，提高转膜效率及蛋白与膜的结合力。 ) B切胶：将凝胶从电泳仪中取出，依据蛋白 标蛋白、内参蛋白位置切除周边废胶及所有浓缩胶，直尺测量胶长与胶宽，放阴极缓冲液中侵泡20 C依据胶长及胶宽准备 及滤纸： 比胶小 1极滤纸比胶大 极滤纸依次比 小 1 D将裁剪好的 置甲醇中活化 15 秒（以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合），水中侵泡 2在阳极缓冲液 泡 5极及阳 I、阳 纸分别置相应缓冲液中侵泡至少 1 E依据如下顺序自下而上（从阴极到阳极）放置在转膜仪 中：阴极滤纸 胶 阳 阳 I。各层间自下而上依次减小， 并使用玻璃棒清除各层间气泡。 F连接电源， 以恒流 200方式电泳 2 小时，全过程在冰水中进行。 （ 4） 封闭：将转膜完成的 泡入由 1冲液配成的 5%脱脂奶粉封闭液中，载有蛋白面的一侧朝上，于室温在脱色摇床上慢摇 2 小时。 (应根据实际情况，选择合适的封闭物和缓冲液，以及封闭液浓度和封闭时间，以降低非特异性反应，达到最高的信噪比。 ) （ 5） 杂交抗体反应：将上一步转膜完成的 取出，放入一抗 （ 兔抗人克隆抗体（稀释度 1 1000）、兔抗人 克隆抗体 （稀释度1 500） 缓冲液中，载有蛋白面的一侧朝上，于 4 在脱色摇床中慢摇过夜。 （ 6） 洗膜：取出 ，放入 冲液中，在脱色摇床上缓慢洗脱 8分钟，倒掉 ，继续加入新鲜 冲液进行洗脱，一共洗三遍。 （ 7） 杂交二抗反应：将上一步洗净的 放入二抗缓冲液中，载有蛋白面一侧朝上，室温在脱色摇床中慢摇 2 小时。 （ 8） 洗膜：取出 ，放入 冲液中，在脱色摇床上缓慢洗脱 5分钟，倒掉 ，继续加入新鲜 冲液进行洗脱，一共洗三遍。 （ 9） 显色：取 光液 A 液、 B 液各 50l 等体积混合，孵育 1适当大小的保鲜膜平铺与暗盒内，把 正面朝上平铺在暗盒中间，将混合好的发光液滴于膜表面，将暗盒水平摇晃使发光液均匀分布于膜表面，之后将其用保鲜膜包好，于暗室中准备曝光。 （ 10）曝光：打开暗室红外灯，将显影液，定影液倒入塑料盘中，裁取适当大小的 置在 上面，盖紧暗盒，记时。曝光时间依据蛋白信号强弱选择，一般需要 5 （ 11）显影和定影：曝光完成后，打开暗合，用镊子将底片置显影液中侵泡至出现清晰条带（一般 1 终止显影并将底片在清水中漂洗后置于显影液中定影 1来水冲洗表面后常温挂晾至干燥。 （ 12）图片扫描及数据分析：将底片扫描后保存图片，采用 像分析软件对蛋白质条带进行灰度值测定，分析数据并计算各组 对表达量。 2 疫组织化学法的实验原理 免 疫 组 织 化 学 （ 又 称 免 疫 细 胞 化 学（ 它有很多种方法，本实验所采用的是 步法。与传统的三步法相比，它的优势在于 ，它所采用的的二步法免疫组化广谱检测试剂能把酶和二抗抗体分子的单价 段聚合在一起，它直接替代了传统方法中的二抗和三抗，放大了抗原与抗体结合的信号，既可以保留抗体特异性结合抗原的能力，又能够避免聚合分子过大而造成的空间位阻。与传统的 步法相比，此法具有简单、敏感、快速等特点，系统中不使用生物素，可以避免由于内源性生物素所造成的背景染色。由于本试剂盒独特的 够使细胞的通透性发生改变，这有利于大分子的检测系统更有效地结合检测的一抗分子，这个检测系统是目前已知的灵敏度最高的免疫组 化检测系统。 用 免疫组织化学法（ 步法）检测 正常宫颈、宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中的表达。 （ 1）将收取的宫颈组织标本用 复冲洗， 4的多聚甲醛固定组织，（固定的目的在于保持组织的形态和结构的完整，尽量保存组织中的抗原，使其不被破坏或扩散，以减少非特异性染色或假阳性，假阴性的结果）常规石蜡包埋、 4处理载玻片，捞片后置烤箱 60 60 分钟使切片紧密粘附，防止脱片。 (2) 玻片脱蜡：将玻片放入二甲苯 5甲苯 5甲苯 中15水乙醇 I 5水乙醇 5水乙醇 595乙醇 55乙醇 5馏水 次， 5（时间和次数均可按需延长）。 （ 3）热修复抗原：将约 800入高压锅内，调至1700 ，待锅底冒气泡开始，放入切片，盖好锅盖，待排气开始，约 10隔 10分钟，待排气停止后打开锅盖，于室温下自然冷却（约 45 （ 4）取出切片， 次， 5。 （ 5）每张切片滴加 1 （ 50注：要将 全覆盖组织）放入湿盒内，室温阻断约 10 （ 6）取出切片， 洗 3 次， 5。 （ 7）滴加 5%闭液，于湿盒内室温下静置 20去多余液体，不洗。 （ 8）擦干组织周围，滴加一抗兔抗人 释浓度 1:100）、兔抗人 释浓度 1:100），阴性对照用 盒中 4 冰箱孵育 16 h。 （ 9）取出湿盒，室温下复温 45见盒盖上有小水珠。 （ 10）倾去一抗， 次， 5。 （ 11）滴加通用型二抗 ,室温下孵育 10 3分钟 5 次。 （ 12）滴加通用型二抗 ，室温下孵育 103 次，5。 （ 13） 边观察边显色）使用 1,B,滴加入试剂盒中，混匀后加至切片。室温显色。镜下控制反应时间，一般在 5旦变色，适时终止，甩去多余水分。 （ 14）终止显色后，用自来水洗泡 5干水分。 （ 15）蒸馏水 冲 3 遍，浸入苏木素复染核 3来水冲洗片刻至无色，蒸馏水冲洗 1 遍， 75%的盐酸酒精溶液分化 15 秒 ,自来水冲洗 5化（至切片呈紫蓝色），流动的自来水冲洗返蓝，流水 4持切片湿润（切记切片不可干）光镜下观察细胞核呈蓝色。 （ 16）蒸馏水 3切片晾干或吹干。 （ 17）脱水： 85%乙醇 3 分钟 95% 乙醇 3 分钟 无水乙醇 I 5无水乙醇 5二甲苯 I 中 5二甲苯 5干后中性树胶封片。 （ 18）日本 微图像采集系统拍片采图。 结果判断 疫组化法结果判定： 按胞质、胞膜和胞核 3种表达部位的染色情况分别制定染色评判标准。 主要位于细胞核与细胞 质中， 性信号为棕黄色颗粒，主要定位于胞膜，少许细胞质亦出现 。 参照文献 41， 性细胞百分率：每例标本选择 10个含有阳性细胞的高倍视野，分别计数100个肿瘤细胞，取其平均值计算阳性细胞百分率。 0为阳性细胞 50。染色强度： 0为无色阴性（ -）； +）； 2为棕黄色（ +）； 3