【毕业学位论文】（Word原稿）蛋白酶激活受体2对大鼠缺血预处理心肌NF-κBp65表达的影响

兰州大学硕士研究生学位论文 蛋白酶激活受体 2 对大鼠缺血预处理心肌 达的影响 1 第一章 前 言 进入 21世纪，我国心血管疾病的死亡率已超过肿瘤，成为严重危害人民健康的第一位杀手。研究发现动脉粥样硬化（ 致的冠状动脉粥样硬化性心脏病（ 为最主要的心血管疾病之一，动脉粥样是导致急性心脑血管事件的病理学基础，其发生机制包括血管内皮细胞损伤、氧化应激、脂代谢失衡、慢性炎症、免疫应答、细胞凋亡等。 动脉粥样硬化为血管的慢性炎症性疾病 1，免疫应答参与调节动脉粥样硬化过程 2。多种免疫细胞，如巨噬细胞、 大细胞等参与了动脉粥样硬化的形成、进展及斑块破裂过程。动脉粥样硬化的免疫应答反应包括固有免疫及获得性免疫，参与固有免疫的细胞主要为单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞及肥大细胞， 细胞参与获得性免疫。核因子 ， 参与炎症因子表达的转录因子之一，参与动脉粥样硬化不同阶段重要的信号转导途径 3。巨噬细胞通过核因子 括白细胞介素 肿瘤坏死因子（ 、白细胞介素 白细胞介素 巨噬细胞可表达 以感知微生物的配体并激活核因子 4, 5。冠状动脉粥样硬化 过程中的细胞 凋亡和坏死（包括内皮细胞、平滑肌细胞和间质细胞） 可影响斑块的形态结构和稳定性。内质网是新合成跨膜蛋白、分泌蛋白折叠与成熟的场所，未折叠或错误折叠蛋白增多可引起内质网应激，内质网通过激活未折叠蛋白反应以保护内 质网应激引起的细胞损伤，未折叠蛋白反应为一种保守性自我保护性措施，但持久激活未折叠蛋白激活可导致细胞凋亡而参与动脉粥样硬化形成过程 6。氧化应激、氧化型胆固醇、饱和脂肪酸等可引起长期激活未折叠蛋白反应，内质网应激引起的内皮细胞凋亡促进斑块进展，巨噬细胞通过激活核因子 症因子，参与形成坏死核 7相关研究发现，通过抑制凋亡而延缓动脉粥样硬化的进展对纤维帽中血管平滑肌细胞及维持斑块具有积极的作用 11 针对冠状动脉粥样硬化慢性炎症、凋亡的发生机制进行有效靶向治疗是治疗动脉粥样硬化可能的潜在方法。 兰州大学硕士研究生学位论文 蛋白酶激活受体 2 对大鼠缺血预处理心肌 达的影响 2 当冠状动脉粥样硬化引起冠心病尤其发生急性冠脉综合征（ ，应尽早进行缺血心肌再灌注治疗。目前缺血心肌再灌注治疗主要包括静脉溶栓、经皮冠状动脉介入术（ 和冠状动脉旁路移植术（ 。然而，在恢复缺血心肌血液再灌 注的临床治疗过程中发现，有时缺血再灌注治疗后，不仅不能使心肌功能恢复，反而加重心肌组织的功能障碍和结构损伤。 1960年 5等明确提出了心肌再灌注损伤概念。随后的研究发现了其他组织器官也可发生缺血 即在缺血的基础上恢复血流后组织损伤反而加重，甚至发生不可逆性损伤。目前大量研究表明，缺血再灌注损伤的重要环节与自由基损伤作用、细胞内钙超载、白细胞激活、微血管功能障碍、细胞凋亡等有关 10, 16相关研究发现急性心肌梗死再灌注治疗后的一个重要方面是心肌细胞凋亡，心肌细胞凋亡又参与了心梗后心室重构和心衰的发生。在心肌再灌注治疗过程中，氧化应激过程中产生的活性氧是触发缺血 血 移诱发心 肌凋亡，同时激活肿瘤坏死因子（ 在缺血 16。 20世纪 70年代心肌再灌注损伤的防治主要围绕调节心肌的供氧与需氧平衡进行，包括增加冠状动脉血流和促进侧支循环的建立，降低心 肌负荷； 80年代以来，心外科医生在临床实践中初步开始探索减轻缺血再灌注损伤的有效方法，后来逐步发现冠脉在血压降低、体温下降、浓度较低的 、血流减低、 再灌注条件的改变仍然难以从根本上减轻再灌注损伤带来的靶器官损害。这要求对缺血再灌注损伤发病机制进行更深入的研究，应用钙拮抗剂、外源性自由基清除剂等药物进行有效地防治再灌注损伤。但是，细胞保护剂和部分药物的作用依赖于有效的再灌注，因此，对上述情况下进行外源性干预措施具有一定的局限性。 20世纪 80年代 研究者提出了细胞保护（ 一概念，人们开始认识到激发与扶持机体内源性抗损伤能力，增强心肌细胞对缺血缺氧等损伤的抵抗力，阻止细胞损伤向不可逆方向发展，提高细胞存活率是缺血心肌保护最有效的措施之一，这一概念的提出引发了学术界对于心肌缺血损伤与保护等问题新的思考：既往研究者认为，心肌细胞短暂缺血引起的可逆性损伤能够使心肌对再次缺血造成的损伤耐受性下降，因此心肌多次短暂缺血会发生累积而引起心肌坏死。但人们在后来的研究中发现了一些与以往观点相反的现象：心肌在一定时间内的反复短暂缺血不一定对 心肌造成累加性不利影响，心肌细胞内电解质浓度、组织含水量、高能磷酸化合物消兰州大学硕士研究生学位论文 蛋白酶激活受体 2 对大鼠缺血预处理心肌 达的影响 3 耗、超微结构及心肌收缩功能相对稳定。 1986年 9等在动物实验中发现，心肌从 4次短暂的缺血中得到保护，表现为尽管局部血流量无明显变化，但心肌梗死面积较单纯缺血组明显下降，从而首次提出了缺血预处理（ 概念，即预先反复短暂缺血可以使心肌在后续的持续性缺血中得到保护，从而减少心肌梗死面积。 历经多年的研究证实，缺血预处理是一种强有力的内源性心脏保护现象。 多次短暂的心肌缺血发作并迅速再灌注并不产生累积性的心肌损伤，而是激活了内在的心肌保护机制，即预适应。缺血预处理对心脏的保护作用主要包括限制心肌梗死范围 19、减少缺血再灌注后恶性心律失常的发生 20、促进心肌功能恢复 21及抑制心肌细胞凋亡 22等 。 相关研究证实，蛋白酶激活受体 2( 与多种细胞与组织的细胞炎症、分化、凋亡过程 23。视网膜神经节细胞发生低氧时，蛋白酶激活受体 2激动剂能够通过上调凋亡相关蛋白 3（ 活性而发挥抑制凋亡的作用，该研究第一次证实了蛋白酶激活受体 2对低氧诱导的视网膜神经节细胞的凋亡具有保护效应 24。研究证实，蛋白酶激活受体 2激动剂可能对防止幽门螺杆菌感染的胃上皮细胞死亡具有保护作用 25。在大鼠缺血 白酶激活受体 2激动剂低 且具有剂量依赖性 26， 从而进一步缩小缺血预处理大鼠心肌组织后的梗死面积，抑制心肌凋亡，改善心脏功能 5 8。 但在心肌缺血 白酶激活受体 2激动剂是否通过调节前还不清楚，本实验通过建立缺血 血预处理心肌动物模型，探讨其在缺血 临床急性冠脉综合征血运重建过程中心肌保护提供理论支持。 兰州大学硕士研究生学位论文 蛋白酶激活受体 2 对大鼠缺血预处理心肌 达的影响 4 第二章 材料和方法 1 材料 实验动物 60只健康 雄性大鼠，体重在 260 40g， 鼠龄 3自兰州大学基础实验室动物中心，动物许可证号： )2011饲养温度 18 24，湿度 60% 75%，规律照明，正常通风，自由饮水，普通饲料 (由兰州大学动物实验中心提供 )喂养，分笼饲养，不限制活动。实验动物实验环境相同。 主要试剂与药品 特异性 蛋白酶激活受体 2激动剂 海生工生物工程技术服务有限公司合成，购自西安沃尔森有限公司） 国 )。 鼠抗人 国 自武汉博士德生物公司） 戊巴比妥 (江苏贝达医药科技有限公司 生产 ) 20%乌拉坦 (兰州大学基础医学院机能实验室提供 ) 4%多聚甲醛溶液 (兰州大学基础医学院机能实验室提供 ) 兰州大学基础医学院机能实验室提供 ) 蒸馏水 (甘肃省中医学院病理实验室提供 ) 多聚赖氨酸 (郑州鸿祥化工有限公司生产 ) 灭菌去离子水 (甘肃省中医学院生理实验室提供 ) 无水酒精 (广东中能酒精有限公司生产 ) 二甲苯 (甘肃省中医学院病理实验室提供 ) 苏木紫 色试剂 (甘 肃省中医学院病理实验室提供 ) 3%甘肃省中医学院病理实验室提供 ) 1%碳酸锂 (甘肃省中医学院病理实验室提供 ) 器材和设备 要器材 兰州大学硕士研究生学位论文 蛋白酶激活受体 2 对大鼠缺血预处理心肌 达的影响 5 大鼠固定板 (兰州大学基础医学院机能实验室提供 ) 碘伏 (重庆天圣制药有限公司 ) 注射器 (天津迈康医疗器械商贸有限公司 ) 无菌巾 (甘肃省人民医院消毒供应中心提供 ) 无菌手术刀片 (上海联辉医疗用品有限公司生产 ) 缝合针 (上海联辉医疗用品有限公司生产 ) 缝合线 (强生医疗器材有限公司 ) 医用灭菌橡胶手套 (上海邦科医疗乳胶器材有限公司生产 ) 生理 盐水 (中国大冢制药有限公司 ) 手术刀，止血钳，组织剪，眼科剪，线剪，齿镊，持针器等 (甘肃省人民医院消毒供应中心提供 ) 设备： 培养箱 (司 ， 美国 ) 酶标仪 ( 美国 ) 脱色摇床（上海一恒科技公司） 蛋白电泳仪（美国伯乐） 鼠笼 (兰州大学基础医学院机能实验室提供 ) 电子称 (湖南仪器仪表总厂生产 ) 低温冰箱 (青岛海尔集团生产 ) 烘箱 (生产厂家不详 ) 石蜡切片机 ( 包埋机 (德国徕卡公司生产 ) 101型电热恒温干燥箱 (北京科伟实验仪器设备厂生产 ) 日本 光学显微镜 (日本 台式离心机 (上海江东仪器 厂生产 ) 脏灌流系统（广州科之蓝仪器公司生产） 自动生化分析仪（广州科之蓝仪器公司） 恒流泵 ( 美国 ) 2. 方法 实验 动物模型的制作与方法 兰州大学硕士研究生学位论文 蛋白酶激活受体 2 对大鼠缺血预处理心肌 达的影响 6 动物模型的制作参照 相关 文献 27 ，清洁级雄性 鼠 60 只， 4龄，体重 260 40g，购自兰州大学基础医学院动物实验中心。 20%乌拉坦 5 ml/腔注射麻醉，同时 腹腔注射肝素钠 500U/胸迅速摘取心脏 , 以 4 生理盐水冲掉余血并立即悬挂于 流架上 , 灌流液 用 95%和的 ,其组成为（ ） ： 18， 71.0，透压 300，经主动脉逆行非再循环式灌注心脏 , 流速由恒流泵控制 6 ml/流过程中用恒温水浴器 保持恒温 37 , 所有心脏平衡灌注15 分钟 ， 稳定后随机分为以下 5 组 , 每组 12 只。 （ 1） A 组正常 对照组 : 持续灌注 95 分钟 ； （ 2） B 组 缺血再灌注组（ : 持续灌注 35 分钟后，心脏保温保湿 , 停止灌注 45 分钟后再灌注 15 分钟 ； （ 3） C 组 缺血预处理组（ : 心脏灌流 5 分钟进行 缺血 预处理操作，停灌 5 分钟后再灌 5分钟，反复 3 次 , 然后停灌 45 分钟再灌 15 分钟 ； （ 4） D 组 剂量预处理组 （ 剂量组） : (不含 脏灌流 5分钟进行缺血预处理操作，停灌 5 分钟后，以含有蛋白酶激活受体激动剂依据大鼠体重按 0.5 mg/算， 参照既往文献28进行 ）的 灌流 5 分钟， 反复 3 次 , 然后停灌 45 分钟再灌 15 分钟。 （ 5）E 组 剂量预处理组 （ 剂量组） ： 方法同 D 组 ，但 中 量按照 3mg/算后灌流 。 标本采集： 收集实验结束前 10 分钟的冠状动脉流出液 , 混匀取样 , 用自动生化分析仪 (美国 ) 测定肌酸激酶 (、乳酸脱氢酶 (性 , 分光光度计法测定肌红蛋白含量 ( 波长 410 实验结束后 , 用 4生理盐水冲洗冠状动脉血管床 , 取心尖部组织进行苏木素 色， 用 检测心肌 达 。 标检测 死亡心肌 面积 测定 实验结束后迅速获取心肌组织，冷冻后切片，置 于1%7孵育 20分钟，用 亡 心肌面积，以 死亡面积占总面值的百分比表示。 大鼠冠状动脉流出液（心肌酶谱） 测定 实验结束后迅速采集冠状动脉流出液，检测肌酸激酶（ ，乳酸脱氢酶 (肌红蛋白（ 量。 心 肌 组织 苏木素 色 （ 1） 载玻片准备：载玻片清水清洗后浸酸过夜后流水 冲洗三遍，蒸馏水冲洗两遍，置于 180 烘箱中两小时灭菌、灭酶处理。将处理好的载玻片置入预先兰州大学硕士研究生学位论文 蛋白酶激活受体 2 对大鼠缺血预处理心肌 达的影响 7 配置好的多聚赖氨酸灭菌去离子水 (10充分浸润，捞出后晾干备用。 （ 2） 石蜡包埋：标本固定于 10%甲醛固定 24小时，流水冲洗 30 70%， 80%， 90%， 95%， 100%酒精梯度脱水。时间： 90%以下浓度 3095%和 100%浓度 60甲苯透明各两次。 60恒温下浸蜡 4小时，期间换蜡两次，待石蜡凝固后取出。 （ 3） 切片制作：用转轮式石蜡切片机切片，片厚 5m， 恒温 37烤片 12小时。石蜡切片制作完成。 （ 4） 脱蜡脱水：二甲苯脱蜡两次，各 10分钟。无水乙醇洗去二甲苯 3次，每次 3分钟。 95%， 80%， 70%乙醇冲洗，每次 3分钟。清水冲洗半分钟。蒸馏水冲洗 1分钟。 （ 5） 苏木紫 色：将脱蜡处理完成的标本置于苏木紫染色液中 5分钟，取出后流水冲洗 1分钟，蒸馏水洗涤 1分钟，置于伊红染色染色液中 30秒，后流水冲洗 1分钟，蒸馏水洗涤 1分钟。 （ 6） 脱水、透明、封片：将标本用 95%乙醇脱水 30秒，无水乙醇脱水 3分钟，二甲苯透明两次，每次三分钟，中性树胶封固，晾 干后显微镜观察并拍照。 肌组织 （ 1） 样本总蛋白的提取及定量 切取 存的病理组织约 10g 置 理盐水冲洗 2遍 ,研磨充分后，离心后取上清，加入裂解液 混匀，经过低温超声匀浆处理后； 12 000心 5上清备用。 取上清 5l ，加去离子水 95l ， ，蒸馏水调零，测各管 根据样品 （ 2） 蛋白电泳及转膜 泳 蛋白样品等量上样 缓冲液煮沸 5却；离心后取上清 50l ，上样； 12浓缩胶用 90V，约 30，待溴酚兰形成一条线且跑至分离胶顶部交界处后，换 120V 电压 120酚兰跑出后结束。 转印：剪取一块与凝胶大小一样的 ，浸入转印缓冲液内，浸泡2进行蛋白转膜。 转印条件： 70V 120 封闭：转印结束后，取出 ，放入 5%的脱脂奶粉中，室温摇床封闭 2h， 洗 3 次。 （ 3） 抗体孵育及染色 一抗孵育 ： 加入 5%脱脂奶粉，按 1:500 稀释的兔抗人 克隆抗体 ， 4摇床反应过夜； 兰州大学硕士研究生学位论文 蛋白酶激活受体 2 对大鼠缺血预处理心肌 达的影响 8 二抗孵育 ： 涤 3 次后，加入 5%脱脂奶粉，按 1:1500 稀释的辣根酶标记羊抗兔 温摇床反应 1h； 去未结合的二抗。 扫描并分析结果，设置曝光 2 动获取图像，同时以 l： 1000稀释的小鼠抗大鼠 克隆抗体作为内参照， 白相对表达量以白 /度值表示。 统计学分析 采用 件，计量资料用（ x s ） 表示， 计数资料用 2检验 ，多组间差异 比较用单因素方差分析，两两比较采用 q 检验 。 P 差异具有显著统计学意义。 兰州大学硕士研究生学位论文 蛋白酶激活受体 2 对大鼠缺血预处理心肌 达的影响 9 第三章 结果 各组死亡 心肌组织面积比较 与正常对照组比较，各组心肌发生不同程度坏死 与凋亡 （ P 与缺血再灌注组比较，缺血预处理组 死亡 心 肌 面积减小（ P 与缺血预处理组比较， 积进一步减小（ P 与积显著减小（ P 表 1）。 表 1 5组梗死心 肌面积的比较（ x s） 组别 只数 梗死面积（ %） 正常对照组 12 血再灌注组 12 * 缺血预处理组 12 12 12 * 注： *与 P &与缺血预处理组相比 ， P 状动脉流出液中肌酸激酶、乳酸脱氢酶、肌红蛋白变化 与 正常对照组比较，各组肌酸激酶、乳酸脱氢酶、肌红蛋白均升高（ P 与缺血再灌注组比较，缺血预处理组肌酸激酶、乳酸脱氢酶、肌红蛋白均降低（ P 与缺血预处理组比较， 酸脱氢酶、肌红蛋白进一步降低（ P 与 酸脱氢酶、肌红蛋白显著降低（ P 表 2）。 兰州大学硕士研究生学位论文 蛋白酶激活受体 2 对大鼠缺血预处理心肌 达的影响 10 表 2 冠状动脉流出液观察指标的变化（ x s ） 组别 只数 肌酸激酶（ U/L） 乳酸脱氢酶（ U/L） 肌红蛋白（ ） 正常对照组 12 缺血再灌注组 12 血预处理组 12 12 12 注 ： *与缺血再灌注组比较 ， P * 与 P 各组心肌 图 1) 低倍镜下 肌可见各种心肌纤维束，润盘清晰可见，其间有少量结蹄组织和丰富的毛细血管，心外膜疏松结蹄组织及间皮排列整齐（图 1A） 。 肌坏死、溶解，心肌膜心肌纤维化，部分心肌凝固性坏死、核碎裂、消失，胞质均质红染或不规则粗颗粒状，间质水肿，少量中性粒细胞浸润（图 1B） 。 1C） 、 0.5 mg/（图 1D） 、 0.5 mg/（图 1E） 心内膜内皮细胞排列紊乱逐渐减少，心肌膜心肌纤维化减轻，部分心肌发生溶解、凝固性坏死、核碎裂、消失等，胞质无均质红染或不规则粗颗粒，无中性粒细胞浸润，且病变损伤程度逐渐减轻， 采用 行统计学分析，结果显示 各组之间具有显著差异（ P 各组 心肌 65蛋白的表达结果 (图 2) 与正常对照组比较 ， I/损害程度增加 , I/正常对照组 P 与 I/著降低 ( I/ P 与 显降低 ( P 有显著差异 ( P 运用凝胶数字成像系统对其进行峰面积分析兰州大学硕士研究生学位论文 蛋白酶激活受体 2 对大鼠缺血预处理心肌 达的影响 11 密度值采用相对 果显示肌细胞中总 呈剂量 系。 第四章 讨 论 本实验通过建立大鼠缺血 正常对照组外，各组动物心肌组织标本病理切片均见不同程度的早期缺血 缺血 度最重，缺血 明显减轻，运用外源性 蛋白酶激活受体 2干预缺血预处理后，心肌保护明显改善， 随着 肌保护进一步改善。 1 缺血预处理对组织和（或）器官的保护作用 缺血预处理概念 (,也称为缺血预适应 ，是由 9等在动物实验中首次发现的，即 对 心肌进行一次或多次反复的短暂缺血再灌注处理后 , 心肌 对随后而来的一次较长时间的严重缺血损伤的抵抗能力提高。 在大鼠实验过程中发现，缺血预处理能够减少相应组织血栓形成 29，减轻组织炎症反应 30。缺血预处理减轻缺血 31。心肌经过预处理后梗死面 积缩小，收缩力改善；心肌细胞的超微结构和冠状动脉内皮得到保护，由再灌注导致的心律失常的发生率明显降低，微循环功能得到恢复，心肌从再灌注诱导的心肌顿抑中及时地恢复 。 32 和 33观察到 , 缺血预处理 可减少缺氧或 缺血 致的心肌细胞凋亡 ，但缺血预处理确切机制目前仍不明确 。 缺血预处理对心脏的保护作用主要包括限制心肌梗死范围、减少缺血再灌注后恶性心律失常的发生及促进心肌功能恢复。具体包括：（ 1） 限制心肌梗死范围。自从 1986年 9等首次报道缺血预处理可以明显缩小犬缺血后心肌梗死面积以来，该方面的研究一直是缺血预处理心脏保护作用的热点，而且目前已证实，缺血预处理可以明显缩小再灌注后家兔、大鼠、猪和犬的心肌梗死面积。另外，白介素 预处理还可以减少后续长期再灌注后大鼠心肌肌酸激酶（ 漏出及大鼠心肌乳酸脱氢酶（ 的漏出。（ 2）减少缺血及再灌注后恶性心律失常的发生。0等首次年报道了缺血预处理降低大鼠缺血后恶性心律失常的发生率，随兰州大学硕士研究生学位论文 蛋白酶激活受体 2 对大鼠缺血预处理心肌 达的影响 12 后的研究进一步表明，缺血预处理除明显降低犬、大鼠及猪的缺血后心律失常发生率及其严重程度外，还可以减轻大鼠和犬的再灌注心律失常的严重程度。另外，用快速起搏预处理亦 能明显减轻缺血后心律失常的发生率。（ 3）促进心肌功能恢复。预处理对再灌注后心功能影响的研究主要是在大鼠离体灌注心脏模型上进行的，大量实验证实已证实，缺血预处理可以明显改善再灌注后心肌收缩及舒张功能。缺血预处理可以明显改善大鼠做功心脏再灌注过程中左室发展压（ ,提高左室压力最大上升和下降速率（dp/并明显降低左室舒张末压（ 。在猪的实验中亦发现，缺血预处理具有明显的抗心肌顿抑作用。 34还证实，缺血预处理可以改善家兔缺血预处理后的心肌收缩功能。另外，临床上有报道，急性心肌梗死前 4者定义为缺血预处理）的患者，在急性心肌梗塞发病 6左室射血分数及梗死区域室壁运动（ 明显高于病前未发生心绞痛者，提示缺血预处理具有改善人类心脏再灌注后心功能的作用。（ 4）缺血预处理的心脏保护作用不仅存在于多种属健康动物心脏，目前病变心脏的缺血预处理现象已经得到证实。在大鼠异丙肾上腺素致心肌损伤和左旋硝基精氨酸致心肌肥大心脏的 离体再灌注模型上证实，缺血预处理减轻再灌注所致的细胞质乳酸脱氢酶和溶酶体组织蛋白酶 超载、脂质过氧化损伤和组织水肿，并减少组织 发现上述病变心脏的心肌细胞核的钙转运系统功能明显降低，碱性成纤维细胞生长因子和肾上腺髓质素预处理明显改善心肌细胞核钙转运系统功能障碍；金属硫蛋白可以模拟缺血预处理对于病变心脏的保护作用。（ 5）老年心脏的缺血预处理现象。老年是缺血性心、脑血管病的高发人群，体内蛋白质与某些重要代谢酶类合成减少，机体对于缺血 (氧 )等应激的反应性下降，此时是否仍然存在缺血预处理现象引 起人们关注。研究发现，小肠和肢体这两个远隔器官的缺血预处理均可以明显减轻长期缺氧 年和老年大鼠心肌细胞膜稳定性下降、钙超载、脂质氧化损伤、 提高细胞存活率。碱性成纤维细胞生长因子和单磷酸酰脂 氧 ） 的内源性保护，但是其保护程度有所下降。 2 核因子 早 是 B 细胞核提取物中能与免疫球蛋白 轻链基因的增强 B 序列特异结合的蛋白 因子 ， 是一种多显性核转录因子 , 能调控多种有关免疫和炎症反应基因转录表达 , 与肿瘤细胞兰州大学硕士研究生学位论文 蛋白酶激活受体 2 对大鼠缺血预处理心肌 达的影响 13 的生长、增殖、浸润和转移关系密切 。 目前一般认为，哺乳动物有 5 种转录因子 、 ( 和 们均以二聚体形式存在，活性最强的 白质的异源二聚体，与多种炎症、肿瘤以及细胞凋亡的发生 、 发展和浸润转移有关，促进炎症、肿瘤及凋亡相关蛋白的合成 35, 36。作为一种具有调控多种基因转录的关键因子 ,37。心衰时 动 导心肌和内皮细胞凋亡的发生 3, 38，而且心肌重塑的很多细胞因子的信号传导途径下游都要经 9，故 肌重塑的关键因素之一。动物实验表明，5核表达明显增加与凋亡指数呈显著正相关，对心衰进行有效干预后，心肌 5核内表达减少，凋亡相关蛋白 高 著降低心肌凋亡率，较大程度地改善心脏功能 40。心肌损害过程中，抑制 而抑制由 而减轻心肌组织损伤和炎症反应，改善心衰的血流动力学指标，改善心功能 41。 3. 蛋白酶激活受体 2激动剂对 心肌 蛋白酶激活受体 2是由配体激活的细胞膜表面受体 ,属于 由细胞外区、跨膜区及细胞内区组成 。人工合成 42, 43。 相关研究证实，蛋白酶激活受体 2参与多种细胞与组织的细胞炎症、分化、凋亡过程 42。在视网膜神经节细胞发生低氧时，蛋白酶激活受体 2激动剂能够通过上调 研究研究第一次证实了蛋白酶激活受体 2对低氧诱导的视网膜神经节细胞的凋亡具有保护效应 24。作为一种胰蛋白酶受体，不仅能够改善血流动力学，还能促进细胞增殖、抑制细胞凋亡 44。相关研究发现， 主动脉的内皮依赖性扩张 45。 在动物实验中 发现 , 蛋白酶激活受体 2激动剂能 缩小心肌梗死面积 ， 改善心脏功能 。 在有关兔的缺血性损伤实验过程中发现， 46。在大鼠缺血 低 且具有剂量依赖性 26, 47。但在心肌缺血 白酶激活受体 2是否通过调节 往未见相关实验。本实验通过建立缺血 血预处理心肌动物模型，发现 蛋白酶激活受体 2 对大鼠缺血预处理心肌 达的影响 14 减轻， 往研究发现 时抑制 心肌 5核内表达后，凋亡相关蛋白 高 著降低心肌凋亡 率，这一机制可能是蛋白酶激活受体 2发挥心肌保护作用的重要方面。 改善缺血 血管疾病与脑血管疾病的一个方向 48, 49。本次实验结果发现， 常对照 组心肌细胞表达阳性率低 , 提示程 ； 但是鼠心肌 缺血再灌注后梗死灶周围 坏死与 凋亡的心肌细胞中表达均显著增多 ,表明心肌缺血再灌注损伤过程中诱导 时 ， 本次实验应用蛋白激酶受体 2激动剂对大鼠心肌缺血再灌注模型进行治疗干预 后， 检测大鼠心肌细胞 变化 ,结果发现 ,与缺血再灌注组比较 ， 蛋白酶激活受体 2激动剂干预后心肌细胞 示 蛋白酶激活受体2激动剂减轻缺血再灌注、抑制心肌细胞的死亡 过程可能是可能通过抑制 总之 ， 心肌缺血再灌注损伤的一个重要机制是细胞死亡（包括心肌 坏死和心肌凋亡） ， 应用 蛋白酶激活受体 2激动剂对心肌进行预处理，有助于减轻缺血再灌注过程中的心肌细胞损害作用 ，这一保护作用 可能是通过抑制 心肌坏死和 凋亡相关基因的表达、减少心肌细胞 坏死和 凋亡数量而实现的。 兰州大学硕士研究生学位论文 蛋白酶激活受体 2 对大鼠缺血预处理心肌 达的影响 15 第五章 结论 1 主要结论 蛋白酶激活受体 2激动剂 对缺血预处理心肌具有 进一步 保护作用； 过调控心肌 上调 抑制心肌细胞 死亡 可能是蛋白酶激活受体 2发挥心肌保护的重要机制之一。 2 局限性与展望 局限性 1. 本次实验过程未动态检测蛋白酶激活受体 2激动剂对缺血预处理心肌酶谱及 2. 未进一步检测蛋白酶受体 2激动剂对 展望 缺血性心脏病严重危害人类健康，尽早恢复血流是减轻缺血性心肌损害的关键，溶栓、经皮穿刺冠状动脉介入术和冠状动脉旁路移植术是目前临床主要的再灌注治疗方法。然而，再灌注治疗过程中受缺血组织血管再通时间的限制，常出现再灌注损伤。随后针对再灌注损伤机制，提出了缺血预处理概念。历经 20多年的大量研究证实，缺血预处理是一种强有力的内源性心肌保护现象。通过缺血预处理后可以明显 减轻缺血 律失常、心肌收缩和舒张功能障碍、心肌凋亡等损伤。 一种多显性核转录因子 , 能调控多种有关免疫和炎症反应基因转录表达 ，参与调控心肌细胞炎症、凋亡是其重要的生物学效应。本次实验证实 蛋白激酶受体 2对 心肌 缺血性损伤有明显保护作用，通过调控 减少心肌凋亡是其发