【毕业学位论文】（Word原稿）脊髓损伤的治疗携带神经干细胞的肌基膜管在大鼠脊髓损伤修复中的应用研究

兰州大学硕士研究生学位论文 引 言 脊髓损伤是严重威胁人类健康的疾病之一，其发病率呈逐年上升趋势，占全身创伤的 在脊柱骨折中有 16%发脊髓损伤，常遗留严重伤 残1 。 然而，由于人类神经系统缺乏再生能力，导致了脊髓损伤后神经功能恢 复受限，严重影响患者生存质量，临床治疗效果差。 新近的病理学通过对啮齿类动物脊髓损伤模型的研究 就 认为脊髓损伤后功能恢复的困难主要 为 2： 细胞的存活。 轴突的再生。 再生轴突生长方向的准确定位。 重建精确而有功能的突触联系 。 随着干细胞技术的进展，为 解决这些问题 带来了希望 。 神经干细胞（ 是目前研究较多的修复脊髓损伤的种子细胞之一。由于其 拥有分化为神经元 3、少突胶质细胞及轴突 4填充脊髓空洞融入宿主脊髓组织的能力 6被认为是解决脊髓损伤修复的方法之一。但动物实验 8明，由于机体内环境影响了 存活、分化 ， 新生轴突难以穿过瘢痕 建立新的上下行传导通路 ，单纯采用 复 效果有限。因此，若想提高 疗效果，需要解决 两个关键性问题： A、 提供轴突生长的通道 。 B、一个有丰富营养物质及神经生长因子的稳定微环境。 肌基膜管（ 作为一种新的生物支架材料， 是一种通过去 除肌细胞、脂膜、膜相关抗原以及可溶性蛋白后形成的一种类似神经膜管通道的天然生物材料， 具有 良好的神经组织相容性和接触性导向作用 12， 具有穿越瘢痕屏障、桥接空洞及轴突导向功能 13，被认为是解决瘢痕阻隔的有效方法。 恰好满足了条件 A。但是有研究发现，单纯 植易发生自溶现 象，而注射有神经生长因子的 14。 嗅鞘细胞（ 一种存在于鼻腔嗅上皮、嗅觉神经特殊类型的神经胶质细胞，既可在外周神经中亦可在中枢神经系统中生长，兼有施旺氏细胞及星状胶质细胞的功能 15，能够分泌脑源性神经因子（ 角质源性神经营养因子（ 多种神经营养因子，可以促进突触的再生 16其分泌的细胞粘附分子，粘连蛋白等，对轴突的生长以及轴突外形成鞘膜有积极作用，可抑制胶质细胞的增生和瘢痕形成，减少脊髓损伤处的组织缺失 19。因此，作为移植的理想细兰州大学硕士研究生学位论文 胞， 能够满足条件 B，也能防止单纯 植发生自溶。 综合以上观点不难发现，单纯使用上述的各种方法治疗脊髓损伤效果都是有限的。但是，如果将 发挥 存及抑制胶质增生、瘢痕形成、成鞘等作用， 以及 越瘢痕屏障 、 接触性导向作用 ， 则有可能为脊髓损伤的治疗提供一种 新 的治疗手段。 兰州大学硕士研究生学位论文 第一部分 携带神经干细胞的肌基膜管在大鼠脊髓损伤修复中的应用研究 神经干细胞（ 植是脊髓损伤（ 复研究的重点之一。 但是，单纯 植由于难以穿越瘢痕屏障及脊髓空洞造成其修复效果有限 20而肌基膜管 (为一种新型生物支架材料，具有穿越瘢痕屏障、桥接空洞及轴突导向功能 13，可以弥补单纯 植的不足。基于此，本实验将携带有 入到大鼠的脊髓损伤处，通过形态学及神经功能检测方法，观察此复合体能否对脊髓损伤的修复起到一定作用。 料与方法 物与试剂 鼠，体重 200甘肃省中医学院动物实验中心提供）；大鼠 用培养液（内含 12(1:1)、 2%20ng/ 0ng/ 100ug/青霉素、 100ug/链霉素， 司）；兔抗鼠 体 、 5抗（兔抗鼠 , 均采用 司）。 离培养及鉴定 选取胎龄 14 周的 鼠胚胎，显微镜下剥离胎膜后，取出脑组织后分离脑膜和血管，保留间脑，在 中将组织剪碎后吹打成细胞悬液， 400 目细胞筛分离过滤成单细胞悬液后加入神经干细胞专用培养液并计数，调整细胞浓度为 种植于细胞培养瓶并放入 5%7常规培养。细胞换液：将培养 3 天的神经干细胞悬液转入一次性离心管内， 1000r/心 5 分钟，弃去上清液，加入神经干 细胞专用培养液至 5入细胞培养瓶。传代培养：细胞培养 7 天左右，神经球直径达 100右即可传代。将细胞悬液收集到离心管内离心，方法同前，弃去上清后，加入少量神经干细胞专用培养液（ 神经干细胞专用分离液 37条件下静置 5加细胞培养液并计数，经干细胞专用分离液无需终止消化）后，转入细胞培养瓶继续兰州大学硕士研究生学位论文 培养。选部分传 3 代生长良好的 壁于多聚赖氨酸包被的载玻片上行 免疫荧 光鉴定，一抗为兔抗鼠 1:200），二抗为 羊抗兔荧光抗体（ 1:100），具体操作按试剂说明进行。 制备与鉴定 选择 200年 鼠，雌雄不限， 巴比妥钠腹腔注射麻醉后，提取大鼠两侧椎旁肌，修剪为 2小的肌条放入超纯水中，在恒温摇床上以 37、 50 48h 后转入纯 液中 37、50 48h，再转入 1%十二烷基磺酸钠中 37、 50 48h，再转入超纯水中 37、 50 24h 后改用 摇 24h。将肌条取出并修剪为 20冰箱保存备用，并抽取部分肌条做检测静定。将备检肌条 4%多聚甲醛固定 12h，行病理切片 色，镜下观察肌基膜管形态学改变。 记与检测 选择传 3 代生长良好的 培养液中加入15 的 育过夜。将部分标记的细胞转入六孔板中促其贴壁于多聚赖氨酸包被的载玻片上，行免疫荧光检测细胞标记效果。 携带 合体的体外培养及鉴定 选择传 3 代生长良好的心后弃 上清，制成单细胞悬液后，吸入细针注射器（ 1格）注入已消毒的 75%酒精浸泡过夜后无菌 清洗），完毕后放入六孔板中（培养液需完全浸没 规培养。抽取培养 3、 5、 7 天的复合体行 疫组化和免疫荧光检测鉴定。免疫组化染色：兔抗鼠 1:200）为一抗，山羊抗兔生物素标记为二抗，具体操作按试剂说明进行。免疫荧光染色：兔抗鼠 1:200）为一抗 ,羊抗兔荧光抗体（ 1:100）为二抗，具体操作按试剂说明进行。 鼠分组及 切模型的制作与复合体移植术 选 择同一窝别 鼠36 只，按随机数字表法分为空白对照组 (A 组 )、单纯 入组 （ B 组） 、 D 组） ，共 3 组，每组 12 只， 巴比妥钠腹腔注射麻醉后，选背侧正中切口，逐层切开，咬开 段棘突及椎板显露硬脊膜，纵行切开，虹膜刀切断右侧脊髓，剪去断端处 1髓。 A 组 生理盐水冲洗创面、逐层缝合切口。B 组 关闭硬脊膜后，细针穿刺将标记好的 液（ 射于脊髓断端处，缝合切口。 D 组 将修剪为 1复合体放于断端缺损处，缝合硬脊膜并逐层关闭手术切口。术后 1 周内，每天注射青霉素 1 次，膀胱按摩排尿早晚各 1 次。 兰州大学硕士研究生学位论文 为学与形态学检测 为学评分：于移植前 1d、移植后 2、 4、 8 周采用改良法双人独立观察 5价大鼠后肢运动功能恢复情况，取其平均值作为评分结果。病理切片形态学检测：于术后 4 周、 8 周每组各取 2 只大鼠行多聚甲醛心脏灌注固定取出脊髓， 30%蔗糖溶液浸泡过夜后分别做免疫组化及免疫荧光染色（方法同前），镜下观察。 计学分析采用 件， 分数据以 X S 表示，组间比较采用 单因素方差分析 ， 详见 表 3、 4。 表 4 各组间 分统计学结果 组别 术后 2 周 术后 4 周 术后 8 周 F 值 P 值 F 值 P 值 F 值 P 值 A 组与 C 组 A 组与 E 组 C 组与 E 组 后形态学检测结果 术后第 4周 裹神经纤维断端，伴有脊髓组织坏死及空洞形成，缺损区可见空腔， 见图 10。 C 组大体标本见损伤区表面不光滑，表面有突起 的瘢痕形成，镜下见阳性染色神经纤维少，排列紊乱，损伤区见炎性细胞浸润明 显， 见图 12。 E 组大体标本见损伤区域表面较光滑，无突起瘢痕形成。免疫荧光检测显示 腔内有 活 并穿越移植区。 免疫组化法显示 移植区炎症细胞较少，浸润不明显 ， 移植复合体与周围组织相容， 见图 15。 论 研究表明， 由于有 施万细胞等胶质细胞构成的神经 鞘膜对 外周神经轴突的 包裹，其诱导 轴突定向生长 的作用对神经受损后的功能恢复有帮助 25。 相反 ，中枢神经系统 由于缺乏施万细胞的保护，影响了轴突再生，新生的轴突也易发生神经脱髓鞘病变，这直接影响了上下行神经传导通路信号的传递。 但是， 即使将 施万细胞植入脊髓后 ，由于中枢神经系统微环境的影响，也造成其 难以存活，因此就需要寻找一种替代细胞。 前已述及，嗅鞘细胞（ 于 兼具 在中枢及外周均能存活的特性，而且拥有与施万细胞类似的分泌神经营养因子、成鞘、促进轴突表 3 3 组大鼠术后各时间点 分比较（ X S，分 ） 术前 1 天 术后 2 周 术后 4 周 术后 8 周 A 组 21 组 21 组 21 州大学硕士研究生学位论文 生长的特点 ，在近年的相关研究中被认为 是 替代施万细胞 的 选择之一 。然而， 进一步的研究发现，单纯的 植 对脊髓 空洞 、 炎性 浸润、 瘢痕抑制作用不理想 26。 而新型 生物支架 材料 出现就是用来弥补这些不足的，如果将 ， 有可能 改善 生存 内环境 ，有利于 阻隔炎症细胞对 浸润、有利于 用肌基膜管的桥接作用穿越基膜管腔与脊髓上下断端建立新的细胞连接继而促进新生轴突穿过瘢痕屏障 。 此外， 由于 分泌 神经生长因子 ， 对 抑制肌基膜管的自溶 也有帮助 。 此部分的 试验结果 显示， E 组 移植细胞的存活率、宿主细胞穿越瘢痕向基膜管腔的移行 优于 C 组，而 为学评分结果 也 高于 A、 C 两 组 （ P存在显著性差异， 与 形态学结果 呈正相关 。表明 存活与迁移可能存在积极的协同作用 。 泌的多种神经营养因子 由于受到 屏障限制 ， 有可能在局部形成较周围相对高的浓度 ， 这种浓度梯度对吸引周围神经细胞及轴突向此处迁移是有帮助的， 这 可能是促进脊髓功能恢复的重要因素 。 综上所述 ，采用 合移植 方式 ， 对大鼠脊髓损伤的修复是有一定帮助的 ， 其效果 优于单纯的 植。 但是， 与第一部分中的 合 其修复效果 不及后者 。这 可能是由于 采用此种方式，生物支架中仅有嗅鞘细胞这样的胶质细胞 ， 而作为形成神经轴突的主要细胞，神经元细胞 ， 仍是缺乏的，仅靠宿主自身的神经细胞 或新生的轴突 向生物支架内移行可能是不够的， 这直接 造成 基膜管内起到信号中继作用的 神经细胞数量少，影响了 基膜管内新生突触连接的数量 ，不 利于脊髓断端远近端神经信号的传导 ，因此就有必要对含神经干细胞与嗅鞘细胞的肌基膜管修复脊髓损伤的效果做进一步的探讨 。 第三部分 携带神经干细胞与嗅鞘细胞的肌基膜管对脊髓损伤修复的作用 兰州大学硕士研究生学位论文 前两部分的实验已经分别就 合 植、 合 植两种方式对脊髓损伤的修复效果及病理表现进行了探讨，结果表明这些方法对脊髓损伤的修复均有一定帮助，但修复效果均是有限的，大鼠后肢的运动功能恢复不理想。此第三部分的实验将接续前两部分， 通过 将携带有 入到大鼠的脊髓损伤处， 通过形态学及神经功能检测方法与之前的实验结果作比较，了解此方法是否有利于 者 发挥 各自的特点 ，提高脊髓损伤修复的效果 ，并从病理学的角度 探讨其修复脊髓损伤的机理 。 料与方法 物与试剂 同前两部分，新增： 神经特 异性烯醇化酶（ (司 )。免疫组化 双 染色试剂：免疫组织化学染色应用试剂盒（ 司，剂盒， 离培养 与 鉴定 及 制备与鉴定 同第一 、二 部分相关内容。 行 标记 同第一、二部分相关内容。 携带 将 记的 别离 心弃上清，制成单细胞悬液后混匀，吸入细针注射器（ 1格）注入已消毒的 75%酒精浸泡过夜后无菌 清洗），完毕后放入六孔板中（培养液需完全浸没 规培养。抽取培养 3、 5、 7 天的复合体行免疫荧光检测鉴定 ， 对 记细胞的 免疫荧光染色：兔抗鼠 1:200）为一抗 ,羊抗兔荧光抗体（ 1:100）为二抗，具体操作按试剂说明进行。 对 记细胞无需染色 。 鼠分组及 切模型的制作与复合体移植术 与前相同 新增 随机选择鼠 12 只， 雌雄不限， 作为 入组（ F 组）， 手术方法及术后处理同前 。 为学与形态学检测 为学评分： 同第一部分相关内同 。病理切片形态学检测： 脊髓 固定 与脱水方法同第一部分相关内容。 F 组 免疫荧光检测方法同前 。 免疫组检测采用 双重染色 法 ，采用 剂盒， 体操作按试剂说明进行。染色结果判定： ， 色部位为细胞核，兰州大学硕士研究生学位论文 呈蓝黑色， 色部位为细胞浆或包膜，呈红色。 ， 色部位为细胞浆或包膜呈红色， 色部位 为细胞核呈蓝黑色。电子显微镜检测：于术后 4 周取 F 组大鼠 1 只行戊二醛心脏灌注固定取出脊髓，戊二醛浸泡过夜后送电子显微镜室行透射电镜和扫描电镜检测。 计学分析采用 件， 分数据以 X S 表示，组间比较采用 单因素方差分析 ， P有显著性差异。 果 带 合体检测鉴定结果 复合体培养 5d 后，行免疫荧光显微镜检测，紫外线激发下可见在肌基膜管内密布的发绿色荧光的 发蓝色荧光的 图 9。 后形态学检测结果 及与之前各组（ A、 B、 C、 D、 E）的比较 ： A 组见纤维结缔组织增生并伴有脊髓组织坏死及空洞形成，见图 10。 B 组术后 4 周免疫组化显示脊髓断端处空洞较大， 少，周围炎症反应重，炎症细胞浸润明显，纤维瘢痕较多，见图 11。 C 组镜下见阳性染色神经纤维少，排列紊乱，损伤区见炎性细胞浸润明显，见图 12。 D 组术后 4 周免疫荧光显示 由 向断端头尾侧迁移、分布，见图 13。免疫组化显示充填于脊髓断端处的 的移植细胞向头尾处迁移， 可见宿主细胞长入，断端处脊 髓灰白质界限清晰，神经纤维排列整齐，未见坏死区，囊性空洞缩小明显，移植细胞与周围正常脊髓组织相融合，见图 14。 E 组术后 4 周免疫荧光与免疫组化检测显示 神经纤维轴突周围有髓鞘形成，并穿越移植区，炎症细胞较少，浸润不明显 ,见图 15。F 组术后 4 周病理切片显示，在脊髓断端植入 可见纤维瘢痕及散在的炎性细胞、多角形细胞和小圆细胞，经免疫荧光和免疫组化双重染色显示为 性的 性的 图 16、 17。另外，通过对神经元特异性烯醇化酶（ 免疫组化双染色显示，有部 分双阳性细胞可能是经 见图 18。 后电子显微镜检测结果： F 组术后 4 周的脊髓断端处的扫描电镜显示断端处肌基膜管未发生自溶，其表面密布呈蜂窝状排列的基膜管腔，见图 19b。在兰州大学硕士研究生学位论文 肌基膜管与脊髓组织相接部分可见到镶嵌其中的神经元及其发出的轴突，并可见到有神经纤维束穿过，见图 19a。对同一组标本的透射电镜显示，在肌基膜管内存在含尼氏体的神经元细胞，并可见到突触及轴突，但轴突外层呈神经脱髓鞘表现，见图 20。 表 5 6 组大鼠术后各时间点 分比较（ X S，分 ） 术前 1 天 术后 2 周 术后 4 周 术后 8 周 A 组 21 组 21 组 21 组 21 组 21 组 21 6 各组间 分统计学结果 组别 术后 2 周 术后 4 周 术后 8 周 F 值 P 值 F 值 P 值 F 值 P 值 A 组与 B 组 组与 C 组 组与 D 组 组与 E 组 组与 F 组 组与 D 组 组与 E 组 组与 E 组 组与 F 组 组与 F 组 植手术后行为学检测及统计学分析结果：术前各组大鼠 分均为 21 分。术后 3 天，空白对照组因尿路感染死亡大鼠 1 只，将死亡大鼠排除后，余鼠评分结果进行统计学分析 ,详见表 5、 6,图 I。 兰州大学硕士研究生学位论文 6组大鼠术后各时间点后4周 术后8周）白对照组纯N 植组纯O 植组带N 肌基膜管移植组带O 肌基膜管移植组带N *注： *术后 4 周 D 组大鼠 分与 A、组均有统计学差异； *术后 4 周 E 组大鼠 分与 A、C 组均有统计学差异； *术后 4 周 F 组大鼠 分与 A、 B、 C、 E 各组均有统计学差异，但与 D 组间并无 统计学差异。 图 I 各组间术后不同时间点 分 论 由于 单纯采用 复 效果有限， 因此，若想提高 疗 效果，需要解决 两个关键性问题： A、 提供轴突生长的通道 。 B、一个有丰富营养物质及神经生长因子的稳定微环境。 于 内部具有的 类似神经膜管通道的 三维立体 通道， 可 满足条件 A。 同时， 由于 够分泌多种神经营养因子 及 细胞粘附分子 ， 既能够满足条件 B， 对 防止单纯 植发生自溶 现象 也有帮助 。因此，如果将 合移植有可能提高 脊髓损伤修复效果。 为此，本实验组对携带 入脊髓断端治疗 F 组）进行了实验，并与 之前的 单纯 植（ B 组）、单纯 植（ C 组）、 植（ D 组）、 合 植（ E 组）的脊髓损伤治疗效果作比较。 结果发现：单纯 植或 植的病理学切片显示移植区存活的移植细胞数量很少，炎症反应重，并未见到有新生的轴突穿越瘢痕屏障，修复脊髓损伤能力有限。而采用了生物支架 各组（ D、 E、 F）移植细胞存活数明显兰州大学硕士研究生学位论文 多于 B、 C 两组。此外，病理切片还显示出 有部分的 炎症细胞阻隔作用，减少了炎症反应对移植细胞的破坏，为移植细胞与周围细胞建立连接提供了时机，这可能是促进脊髓损伤大鼠功能恢复的一个重要原因。这一结果与各组的为学评分的统计结果也是相符的。其次，由于 抗原成分已去除，因而并未引起周围严重的炎症排斥反应，证实其有较好的组织相容性。 D、 E 两组的病理切片显示， 的 向断端头尾处迁移并与周围脊髓组织融合生长，较单纯 植组其存活细胞数量更多，周围炎症反应更轻，瘢痕对基膜管道的阻隔作用不明显 。 证明 仅能够促进 其管腔定向生长，还能够促进宿主自身细胞沿管腔内的基质成分爬行，这种桥接作用有利于断端两侧的神经细胞相互融合并形成突触连接。 这可能是由于 13等人提出的 保留的细胞外基质成分纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等，在细胞的黏附和移行过程中发挥重要作用。其中层粘连蛋白能够引导和促进轴突长入支架 ，纤维粘连蛋白也能促进轴突再生并能够抑制成纤维细胞过度浸润。与此相似， 润的炎症细胞数量少，也可见部分宿主神 经细胞穿越瘢痕爬行入基膜管内。这可能是由于受到 成的微小内环境的保护，泌的脑源性神经因子（ 角质源性神经营养因子等多种神经营养因子在相对密闭的微环境中，可形成较高浓度，由此更好的发挥促神经生长的作用。术后 4 周的 为学评分统计结果也显示， D、 E 两组较 A、 B、 C 三组却能改善大鼠后肢功能。但 D、 E 两组间比较， D 组的修复效果好于 E 组，差异有显著性，这可能是由 E 组的肌基膜管内起桥接作用的神经细胞绝对数量少，不利于上下行传导通路的恢复决定的。 F 组的形态学检测结果显示 的 有存活，且有部分的神经干细胞可能已转化为神经元，电镜检查发现肌基膜管内神经元已发出轴突沿基膜管腔生长，并可见新生的突触连接，但是这些新生轴突表面呈现脱髓鞘表现，表明嗅鞘细胞的成鞘作用可能有限，新生轴突并不健康，这可能成为影响神经信号传导的重要因素。与之相一致的是， F 组的术后 4 周 为学评分统计结果表明，虽然相较 A、 B、 C、 E 四组其改善大鼠后肢功能的作用是明显的，但与 然其评分高于 D 组，但并无统计学差异。其机制可能是由于肌基膜管内的部分 化为神经元，相较于 E 组（携带 基膜管腔内的兰州大学硕士研究生学位论文 神经细胞绝对数量更多，有利于产生更多的轴突及突触连接，有利于建立更多新生的上下行传导通路。因此其修复效果优于 E 组。但是由于这些新生的轴突呈现一种神经脱髓鞘的 病理 表现，可能极大的限制了神经信号的传导，此外新生的突触连接是否是具有信号传导功能的有效突触连接尚不得而知。这些均有可能限制新建立的上下行传导通路的有效性。虽然 F 组的基膜管内有具备成鞘作用和神经营养功能的特殊胶质细胞 参与，可能对神经干细胞的诱导、轴突生长与突触连接的形成有一定的帮助，但是其作用是有限的。这三个因素可能共同构成了与仅是携带了 入组（ D 组）相比， F 组的 分略高于 D 组但无统计学差异的结果。 兰州大学硕士研究生学位论文 结 论 通过上述三部分的研究，本研究得出以下结论 1. 采用 携带 合移植方式优于单纯细胞移植，证明仅能够促进 其管腔定向生长，还能够促进宿主自身细胞沿管腔内的基质成分爬行，这种桥接作用有利于断端两侧的神经细胞相互融合并形成突触连接。 但修复效果仍有限。 2. 采用 携带 合移植 或 携带 式优于 携带 合移植方式 ， 这可能是由 于后者 肌基膜管内起桥接作用的神经细胞绝对数量少，不利于上下行传导通路的恢复决定的。 3. 采用携带 疗 新生的轴突呈现一种神经脱髓鞘的 病理 表现，可能极大的限制了神经信号的传导，此外新生的突触连接是否是具有信号传导功能的有效突触连接尚不得而知。这些均有可能限制新建立的上下行传导通路的有效性。 4. 采用携带 疗脊髓损伤与仅将携带 合移植 治疗方法均能改善大鼠神经功能的恢复，但 效果仍不理想，大鼠后肢的负重能力，前后肢的协调运动能力仍不佳。这两种方法的修复效果并无实质性的区别。这可能是 因为前者的 诱导、 促进轴突形成、抑制神经脱髓鞘等 作用是有限的。 如何寻求一种有效的二者间的信号转导通路、防止神经脱髓鞘及建立有效的突触连接，可能是解决这一问题的关键。 兰州大学硕士研究生学位论文 综述 脊髓损伤（ 发病率呈逐年上升趋势，在脊柱骨折中有 16%发脊髓损伤，常遗留严重伤残 1。然而，由于人类神经系统缺乏再生能力，导致了 脊髓损伤（ 神经功能恢复受限，严重影响患者生存质量，临床治疗效果差。随着干细胞移植技术的发展，为脊髓损伤的修复带来了希望。现有的研究主要集中在三方面： 1、神经干细胞移植。 2、胶质细胞移植，其中对嗅鞘细胞的研究正在成为热点。 3、组织工程支架的应用。 1. 神经干细胞移植。 神经干细胞具有向神经元及胶质细胞分化增殖的能力，能够替代损毁的脊髓组织和相关细胞，填补脊髓空洞，故而被认为能够解决脊髓损伤区域神经纤维及轴突重建的问题。如： 3采用病毒示踪技术证实了神经干细胞移植能够重建中枢神经元。 4、 5在其实验中 也发现了神经干细胞能够转化为少突胶质细胞并可分化为轴突。 M 等 6， Y 等 7的 研究也证实了神经干细胞具有填充脊髓空洞，融入宿主脊髓组织的能力。但遗憾的是，更多的研究发现 (如 H， 20单纯 神经干细胞植入体内后由于机体内环境的影响造成其不能形成正常神经细胞，而分化为胶质细胞或者坏死。事实上，决定神经干细胞移植治疗成败的关键性因素在于为神经干细胞在体内生长提供一个有丰富营养物质及神经生长因子的稳定微环境，以克服 组织损毁和缺乏血供造成的营养匮乏和低氧条件造成的缺氧 23。因此，出现了大量的实验研究 8图通过在神经干细胞移植中加入利于神经元存活、迁移并形成轴突以及抑制炎症发生的生长因子及化学药物来促进脊髓损伤功能的恢复，如 格列酮、 以及神经营养因子 然这些研究均取得了一些成果，但仍未能在脊髓损伤区域形成真正有效的轴突，并建立新的上下行传导通路。因此，近年来 有更多的学者开始转向研究具有形成髓鞘、分泌神经营养因子，改善损伤区微环境的胶质细胞。 2. 嗅鞘细胞移植。 嗅鞘细胞是一种特殊类型的神经胶质细胞，既存在于鼻腔的嗅上皮、嗅神经，也存在于中枢神经系统的嗅球，兼有施万细胞和星状胶质细胞的特性 17,27兰州大学硕士研究生学位论文 J18、 M19等学者就认为嗅鞘细胞能够分泌神经营养因子、产生细胞粘附分子、抑制胶质增生、瘢痕形成、成鞘作用等，为神经干细胞生长提供了适宜的微环境，使其成为促进中枢神经再生的理想候选细胞之一。在 29的实验中发现虽然嗅鞘细胞不能阻止空洞形成，但能减少大鼠脊髓损伤处的组织缺失， 损伤区内含髓鞘的神经纤维及神经元明显增加。 30利用 嗅鞘细胞和血管内皮生长因子治疗脊髓损伤，结果发现此方法促进了脊髓损伤后功能恢复，提高了神经元与神经纤维的 部分功能恢复，促进了受损神经元分泌神经营养因子能力的提高。 另有研究 31采用脑源性神经营养因子 （ 与嗅鞘细胞联合移植的方法治疗脊髓损伤，结果证明 嗅鞘细胞 促进脊髓功能恢复中扮演了一个重要的角色，能够促进嗅鞘细胞部分恢复脊髓受损区功能。 32在实验中发现， 嗅鞘细胞能够促进神经纤维的生长，由于嗅鞘细胞能够表达神经营养因子，故而促进了神经干细胞在体内试验或体外实验中的生长。并且能够通过细胞间相互作用促进轴突的再生，通过将嗅鞘细胞与其他候选干细胞联合移植，能够促进其他细胞的存活率与迁移能力。 3. 组织工程支架材料的发展。 李亚梅等 33指出，利用具有良好的神经组织相容性组织工程支架能够有效的人工桥接损伤后空洞，穿越胶质瘢痕形成的物理屏障，可弥补神经干细胞与嗅鞘细胞移植穿越瘢痕与空洞能力有 限的缺陷。例如 34采用的层层自组装聚乙烯材料 R 等 35采用的 携带神经干细胞的含双氢睾酮胶原支架、 36采用的 含 神经营养因子 3（ 硫酸软骨素的高分子聚合物支架 、 以及 D 等 37设计的具有生物允许功能的纳米材料自组装肽 均 取得了一定的促进脊髓功能恢复，形成新的轴突连接的作用。而肌基膜管作为一种新型生物支架材 料，研究发现 12，其具有良好的神经组织相容性，若将其携带上神经干细胞和嗅鞘细胞后沿脊髓纵轴植入损伤处，有利于神经干细胞在一个相对稳定的内环境内生长，减少肌基膜管外各种炎症细胞对其的损害，并在嗅鞘细胞分泌的神经生长因子的刺激下向神经元转化，使其沿着肌基膜管形成的隧道向特定方向生出轴突穿越瘢痕屏障。贾彬等 38的研究结果显示，将嗅鞘细胞与肌基膜管联合移植能明显促进大鼠损伤脊髓的轴突再生和功能恢复，与 单纯嗅鞘细胞移植相比差异显著。 兰州大学硕士研究生学位论文 4. 神经干细胞、嗅鞘细胞、肌基膜管复合体在脊髓损伤治疗中的前景。 综上所述，现有的研究尚无将神经干细胞、嗅鞘细胞、肌基膜管三者结合，发挥各自优势、取长补短，治疗脊髓损伤的实验。未来若能设计一些将嗅鞘细胞与 神经干细胞体外共培养后将其定植于 肌基膜管的体内外实验，以 了解嗅鞘细胞产生的神经生长因子是否能够促进神经细胞与轴突再生并保持其活性，以及新生轴突是否能够粘附在肌基膜管内表面并沿其长轴定向生长并穿越瘢痕后与上下行传导通路形成新的突触连接，应是未来神经干细胞