【毕业学位论文】（Word原稿）皮肤创伤再生和瘢痕愈合中Tenascin-C,HA和PKC-α,-β的差异表达

兰州大学硕士学位论文 皮肤创伤再生和瘢痕愈合中 A 和 前 言 皮肤损伤的再生修复与瘢痕演变是一个复杂的过程，近年来由于细胞生物学与分子生物学在再生修复 方面机制的认识有了很大的进展。皮肤再生修复 共同完成。填充于胶原间的蛋白聚糖调控胶原等 细胞的功能，在皮肤创伤再生修复及瘢痕愈合中发挥着重要作用，尽管科研工作者们试图阐明确切机制，但其中具体机理目前还不完全清楚。 人体皮肤（ 表皮和真皮所构成，真皮（ 于表皮下方，由致密结缔组织构成，对表皮起连接、支持、营养、保护等作用，并参与创伤愈合。真皮分乳头层（ 网织层（ 层，二者之间无明显界限，厚度约为 1头层纤维致密，细胞数目多，富含大量的毛细血管和感觉神经末梢，且与表皮紧密连接。网织层是构成真皮的主体部分，因富含成纤维细胞、胶原纤维以及细胞外基质等，构成框架结构，故保持了皮肤的弹性与韧性，此外，还有血管、神经、淋巴管以及毛囊、皮脂腺等结构 1。 皮肤损伤深度 （ 组织层次 ） 的不同， 可 再生与瘢痕愈合 。皮肤附 属器存在是再生 （ 完全愈合 ） 的前提 。 当皮肤 浅层（真皮乳头层） 损伤后， 因真皮网状层存在毛囊 伤后由 这些附属器细胞及其内的干细胞、伤口 邻近 的 正常 皮肤 基底细胞 和真皮层纤维细胞 增殖来实现再生 2。但损伤网状层后会导致成纤维细胞（ 活化、增殖、合成胶原以及分化异常，最终形成瘢痕增生 。 多项研究观察表明， 真皮组织缺损的 深 度和瘢痕增生程度 成正比 ，真皮组织回植于组织缺损 伤口 可减轻瘢痕的增生 3。将真皮组织切取后，完整覆盖于瘢痕疙瘩与慢性溃疡 伤口 ，能促进表皮生长 ，皮 肤弹性的增加，并且抑制了移植皮肤收缩及瘢痕的增生 4， 体外构建组织工程皮肤形成 和 自体皮内植入复合异种脱细胞真皮基质 可 提高伤口愈合 5 蛋白聚糖（ 一类重要而独特的蛋白糖复合物，研究始于 19世纪末， 20世纪 50年代才逐渐认识到 带负电荷的糖胺聚糖链通过共价键与蛋白质连接而成。 存在于细胞内分泌颗粒之中。按其结构和特性分为 6种：腱糖蛋白 （ 、透明质酸兰州大学硕士学位论文 皮肤创伤再生和瘢痕愈合中 A 和 （ 、硫酸 角质素 （ 、核心蛋白聚糖 （ 、硫酸乙酰肝素 （ 、多功能蛋白聚糖 （ 。鼠皮肤创伤修复组织中呈较高水平表达 8， 而且 ，乳头层 与角质形成细胞结合；随着真皮再生的完成， 志等 9研究表明，在培养基中补充 少 示 用。但目前该方面的研究报道较少。 主要分布于真皮乳头 层 的 分靠近基底膜血管和皮肤附件，表达呈线形，在真皮中分布极微 。 而 两侧环绕基底膜；棘细胞层的最上部有中等浓度的 透明质酸 ，可能与刺激 透明质酸 释放的物质位于基底层附近有关 ， 且更有利于皮肤再生。 蛋白激酶 C（ , 由多种具有不同生物学特性的同工酶组成 的丝氨酸 /苏氨酸激酶家族成员 10,11，分子量为 77据 将其分为 3类 12： 1）经典型 ，由 、 1、2、 四种亚型组成。 2） 新型 ，包括 、 、 和 五种亚型。 3）非典型 ，包括 和 三种亚型。大量研究表明， 不同的组织表达和 特定的细胞内定位 13， 对激活信号的敏感性和特异性 以及 生物学 作用并不完全相同 14,15。 实验表明，将 制 殖 16；肾上腺素与 受体结合后 激活 制 17，但具体激活了何种亚型还有待进一步研究。 导致 18。张选奋等 19发现，在兔耳、人体皮肤肉芽组织、周边组织及瘢痕组织内 明在 伤口 愈合和瘢痕增生过程中有活化 20,21。 然而 ， 分布 以及 再生 和 瘢痕修复过程中的表达 变化 未见 研究 报道 。 近年来， 学 者们制作了 多种 动物皮肤创伤再生 或 瘢痕愈合的实验模型 。 皮肤创伤 模型分为切开和 切除 模型两种，用于研究愈合过程和瘢痕演变 2,22。有关皮肤创伤 再生 修复的动物实验模型鲜见报道 ， 关于皮肤创伤再生 国内外尚未见相关报道 。 本实验拟建立兔耳腹侧皮肤再生与瘢痕愈合的一体化模型。应用免疫组织化学技术和核酸分子原位杂交技术检测 伤口 再生与瘢痕愈合过程中 、 兰州大学硕士学位论文 皮肤创伤再生和瘢痕愈合中 A 和 变化及表达差异。 兰州大学硕士学位论文 皮肤创伤再生和瘢痕愈合中 A 和 材料与方法 1 材料 物 本实验所用新西兰大耳白兔 18 只 （ 兰州大学动物实验中心提供 ，普通动物，合格证号：）， 雌雄不限，体重 只单笼适应性饲养 1 周后进行试验。 实验过程获得兰州大学动物伦理 委员会批准 ， 所有实验动物均受到人文关怀 。 料 脱载玻片 南通天盛实验器材有限公司 2. 2存管 美国 液器头 美国 要试剂 1. 鼠抗兔 克隆抗体 国 2. 鼠抗兔 克隆抗体 国 3. 小鼠 剂盒 武汉博士德生物工程有限公司 4. 位杂交检测试剂 武汉博士德生物工程有限公司 5. 位杂交检测试剂盒 汉博士德生物工程有限公司 6. 色试剂盒 武汉博士德生物工程有限公司 7. 天津市光复化工科技公司 8. 柠檬酸 ( 天津市滨海化学试剂有限公司 9. 武汉博士德生物工程有限公司 10. 过氧化氢 (3%) 天津市光复化工科技公司 11. 原位杂交用 武汉博士德生物工程有限公司 12. 戊巴比妥钠 国，国内分装 13. 武汉博士德生物工程有限公司 14. 硫化钠 (25%) 天津化学试剂公司 15. 胰蛋白酶 (3%) 武汉博士德生物工程有限公司 16. 一抗稀释液 武汉博士德生物工程有限公司 17. ) 国，国内分装 试剂为 分析纯。 兰州大学硕士学位论文 皮肤创伤再生和瘢痕愈合中 A 和 验仪器 国） 康， 湖北亚光， 海跃进医疗器械厂， 海跃进医疗器械厂 海梅香仪器厂） 500国） 600L，日本） 特， 像分析软件 (国） 计分析软件（ 国） 石蜡切片机 组织摊烤片机 石蜡包埋机 核酸分子原位杂交仪 光学显微镜 微量振荡器 耳再生 新西兰大白兔 18 只，雌雄不限，体重 单 只分笼观察饲养 1W（ 图1使用 5%硫化钠膏进行兔耳腹侧脱毛，饲养 3 天后再进行实验 。 模型是 借鉴 使用激光、机械磨削皮肤后损伤至真皮乳头层的伤口可以再生而缺损深度 到达兰州大学硕士学位论文 皮肤创伤再生和瘢痕愈合中 A 和 网织层甚至更深的组织时瘢痕修复的原理 制作。 兔耳缘静脉注射 3%戊巴比妥钠注射液（ 1ml/醉，将兔耳腹侧组织充分展平，放置于自制的固定台（体积为 .0 将 自制的 取皮 刀片固定 妥当，放置于耳尖处，刀刃面与兔耳皮肤呈约 25夹角，力量均匀向兔耳根部切割伤口，切割过程中，仔细观察 伤口 深度，切取深度到达耳软骨表面， 在 兔耳腹侧切割出面积 约 为10 0浅 到 深 的 切口 。 分别于每只 制作 两个 伤口 ， 间距约 计72 个 。 每次均 为同一方向切割兔耳组织 （由耳尖至耳根均为由浅至深）。 在伤后 0h、 3d、 6d、 9d、 12d、 27d，任意切取 3 只兔耳部 伤口 （切取面积为超出 伤口 边缘 2全层皮肤组织），共 12 例标本，固定于多聚甲醛溶液中，分别行 色、免疫组织化学染色以及核酸分子原位杂交检测。 图 1 兔耳皮肤再生 of of in 剂配置 8g 用 30g 1000州大学硕士学位论文 皮肤创伤再生和瘢痕愈合中 A 和 0.4 g 3. 1% 1.0 d 1000.0 . 1 . 4% % 滴定 500.0 度 60 5. 1% % 500 500 . 10 g 柠檬酸钠 44.1 g 1% . 20 檬酸钠 % . 50 檬酸钠 % 州大学硕士学位论文 皮肤创伤再生和瘢痕愈合中 A 和 9. 20%甘油 甘油 0. 3%柠檬酸 6 1. 蛋白酶 胰蛋白酶 实验 步骤 理 切片 1） 脱水透明 ： 将标本取 出后用水 冲洗 、沿由浅至深方向从正中切开， 切 开面 朝下方放入组织包埋盒内，盖好盖片，标记后放入全自动 乙醇脱水 机内进行组织脱水， 此过程 具体 步骤 为 ： 80%、 90%、 95%、 100%各种浓度乙醇 盒内 2 小时。 2） 浸蜡、包埋 ：将脱水后的组织放置于已加热至 56的 石蜡 液中，分三次（第 1 次 30 2 次 90 3 次 90浸 蜡 ，取代组织中含有的透明剂。浸蜡后的组织 放于组织包埋盒中矢状面朝下，移至石蜡组织包埋机出蜡口下方，用眼科镊加以固定，注入液态石蜡，组织完全被石蜡浸没后，将包埋盒移至冷台， 石蜡 迅速 凝固，组织即被包在其中， 形成 蜡块。 3） 切片和贴片 ：在每张载玻片上标记 （ 3d、 6d、 9d、 12d、 27d） ，每组切 11张蜡片（ 1张 普通载玻片捞取 ，免疫组化 和 原位杂交 各 5张用为 防脱载玻片捞取 ）。 将蜡块放入盛有水的容器中，置于冰柜中冷冻， 15块组织 均从 伤口 浅层至深层的方向 固定于切片机持蜡器上，刀片安装于刀台后固定稳妥，调整切片厚度为 调整 恒温水箱温度至 40，修整蜡块距组织边缘约 从皮面下刀 开始切片，用镊子将切好的蜡带轻轻移至水面上充分展平，载玻片中段部捞起蜡片，倾斜移去余水，置于 60恒温箱内，普通片烤片 1小时，防脱片烤片 2小时，以脱去熔化 的 组织间隙的石蜡。 兰州大学硕士学位论文 皮肤创伤再生和瘢痕愈合中 A 和 E 染色 （ ） 切片 置于 二甲苯 I 中脱蜡 10甲苯 号 5水酒精内洗 12次 ， 95%酒精 190%酒精 1度 85%酒精 1来水再洗 2在苏木精素染色 5次置于自来水中清洗 11%盐酸酒精分化 20s，自来水洗 1水（ 1%）中进行返蓝作业 30s，其次置于自来水中洗涤 1红染色 20s，自来水洗 30 秒之后， 85%乙醇中进行脱水 20 秒， 90%酒精 30 秒钟，依次为： 95%号酒精 195%号酒精 1水酒精号 2水乙醇号 2甲苯号浸 2二甲苯 号浸 2二甲苯 号 2性树胶 封片 。 n C 与 色 （ ） 首先进行预实验，按照抗体说明书推荐最佳稀释浓度值，将 一抗原液按照 1:100、 1:300、 1:500 三种比例稀释， 抗原液按照 1:300、 1:800、 1:2000三种比例稀释，并同时使用三种抗体浓度进行实验， 依照最后显色结果确定最佳反应浓度 ： 为 1:500， 1:800。 1. 切片 常规 脱蜡 至 水：二甲苯 号 10甲苯 号内 5水 乙醇号 5水酒精 号 5水酒精 号中 595%酒精 585%酒精 5馏水 10 洗 5 次。 2. 30% +蒸馏水 10 份混合，室温 10活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗 33 次。 3. 热 抗原修复： 将切片放入盛有 檬酸盐缓冲液的高压锅内（ 右） ， 电磁炉加热至沸腾后计时 3电，冷却后取出，用 冲液（ 涤 5 次。 4. 加 5%闭液，室温 20甩去多余液体，不洗 。 5. 别在切片上滴加三种浓度的一抗稀释液， 4过夜，次日取出后放于 37恒温箱复温 20 23 次。 6. 加 浓度为 物素化兔抗山羊 37 20 23 次 。 7. 加 剂， 37 20 54 次 . 兰州大学硕士学位论文 皮肤创伤再生和瘢痕愈合中 A 和 8. 色使用 色试剂盒（ 取 1馏水，在试管中加入 A、 B、 C 试剂各 1 滴，充分混匀后加至切片上，室温下显色，镜 下严格控制显色剂反应时间， 8 分钟后自来水终止显色，蒸馏水洗 22 次。 9. 苏木素液复染，脱水、透明并封片，显微镜下观察。 1酸分子原位杂交 在实验开始前， 实验 所有试剂 及 器械均 用 理， 并且将手术器械用 120 、 30压处理， 实验过程 依照无菌原则操作 ，以防实验中 1. 切片脱蜡 至 水 ： 二甲苯 10甲苯 5水 乙醇 5水酒精 5水酒精 595%酒精 585%酒精 5馏水 10 洗 5 次。 2. 3%别加至每张切片上，充分浸没组织，放置于室内 10消除 内源性酶， 然后放置于 蒸馏水 中 洗 5 分钟 3 次。 3. 暴露 信使核糖核酸的核酸 片段： 将浓度为 3%柠檬酸新鲜稀释 好的 胃蛋白酶 液 （ 3%柠檬酸 1浓缩型胃蛋白酶 液 2 滴） 加于 切片上 ，放置于温箱内调温至 37 消化 20 分钟 ，用 洗 53 次 ，置于 蒸馏水 洗缸洗 5 4. 后固定： 胃蛋白酶消化后用 理过的 1% 温 下固定 10分钟 ， 置于 蒸馏水 洗缸内洗 53 次。 5. 预杂交： 将为 20%的 甘 油 20入干杂交盒底部，以 保持 杂交过程中切片的 湿度， 避免造成干片，在 每张切片 上滴入原位杂交 预杂交液 20l， 置于恒温箱 内设置温度在 38 后，进行预杂交 2 小时 ， 取出后 吸 去切片上的 余液。 6. 杂交： 将 杂交液 约 20l 分别滴加在每个 切片 内（以杂交液完全浸没组织为标准），并将 原位杂交专用盖玻片 保护膜揭去后 盖在切片上， 中性树脂胶封住盖玻片四周，放置于核酸分子原位杂交仪内设定温度为 37 ， 杂交过夜。 7. 杂交后洗涤： 用 眼科尖镊子轻轻 揭 除封片胶及 盖玻片， 37 的 252 次， 37 含 152 次， 37 含 洗 15 次。 8. 滴加封闭液 ： 37 20去 玻片上 多余液体，不洗。 9. 滴加生物素化鼠抗地高辛 ： 37 60位杂交用 5 次 ，兰州大学硕士学位论文 皮肤创伤再生和瘢痕愈合中 A 和 期间保持切片湿度，防止干片 。 10. 滴加 ： 37 20 5 次。 11. 滴加生物素化过氧化物酶 ： 37 20 ，用 5 次。 12. 色：将 配置好的 色剂 滴于组织上， 显微镜 下严格控制显色时间， 10 自来水终止显色，蒸馏水中 52 次 。 13. 复染： 切片放置于 苏木素 溶液内 染色 2充分水洗。 14. 分化 液内浸泡 20s，水洗 2 次 ，返兰 液 10洗 1 次 。 15. 酒精梯度脱水，二甲苯透明， 风机吹干 ，中性树胶封片。 16. 杂交时加入 作为空白对照 组 。 结果判读：由病理实验室两名医师对 、 疫组化切片以及 1 位杂交 片 镜下 进行 结果判断 。 、 性表达于真皮乳头层的成纤维细胞，切片阳性染色细胞呈棕黄色 ； 1要在表皮细胞、纤维细胞胞浆、毛囊、皮脂腺中阳性表达 ，呈棕黄色。 3 半定量图像分析 将 、 及 1 浅、深层 伤口 内 的 表达 像分析软件 进行分析 ，显微镜 下 400 倍 观察 ， 将 伤口 从浅侧到深侧分为 10 段 ，每段 伤口 面积为 1.0 取 切片 每段 组织 内 100 个视野进行分析， 并 进行系统光密度校正， 0 为 白， 255 为 黑，数值 愈大表达水平 愈 高。 距离浅侧边 3伤口 自定义为 浅层伤口， 而 距离浅侧边 8伤口 自定义为 深层伤口 。 伤口收缩因深浅而不同，因此， 4伤口为过渡伤口。 4 统计学 分析 将 件 分析所得 出 的数据用均数 标准差（ x s ）表示 ，并 采用 件包统计处理，方差齐性时 ， 多组间均数比较采用方差分析（两两比较时使用最小显著差异法） ，方差不齐时采用秩和检验 法， P差异有统计学意义。 兰州大学硕士学位论文 皮肤创伤再生和瘢痕愈合中 A 和 结 果 1 一般状况 所有 动物 均 单只 分 笼饲养 ， 进食 活动 均 良好， 实验中 动物 无意外死亡 。 2 兔耳 伤口 愈合过程形态学 伤后 0h，伤口边缘整齐 ， 可清晰看到 伤口 由浅至深的层次 。 伤后 3d， 可见 伤口 组织收缩、 血痂 形成，伤口周边轻度 红肿。 伤后 6d， 浅层 伤口 痂皮 与 创缘 皮肤剥离 ，揭开痂皮， 可见新鲜肉芽组织 生长，表面湿润 ；深层血痂连续，与组织贴附 较 紧密，高 出皮 面。 伤后 9d，浅层 创缘皮肤向中央紧缩并已 愈合；深层 伤口 血痂 亦 完 整 脱落，大部分伤口已上皮化 。 伤后 12d，已 无法 辨 清 浅层 伤口 与正常皮肤的界限 ； 而 深层 伤口 则呈现出圆形、 凸起于皮面的 瘢痕 ，粉 红 色，表面光滑 ， 质地 较 韧。 伤后 27d， 浅层 无法辨 认 ； 深层伤口 为圆形 瘢痕 ， 凸起 于 皮面 ，色 泽与 周围正常皮肤 较接近 ， 质韧 （照片 1） 。 浅层 伤口 再生 修复 ，无法辨别与周围皮肤的差异；深层 伤口 瘢痕愈合。 0h 3d 6d 9d 12d 27d 兰州大学硕士学位论文 皮肤创伤再生和瘢痕愈合中 A 和 照片 1 兔耳皮肤 伤口 愈合过程形态学。 浅层 伤口 最终呈现再生；深层 伤口 瘢痕愈合。 创伤后 9d， 浅层 伤口 已愈合 ； 深层 伤口 部分未上皮化 ， 多数已形成 新鲜的瘢痕组织 。伤后 27d，浅层 伤口 无法辨认；深层伤口 形成增生性 瘢痕 。 of in d 27d d of a t 7d 3 伤后兔耳 伤口 愈合过程组织学 （照片 2） 伤后 0h， 伤口 深度从 表皮 缺如 逐渐延及 真皮浅层 、皮下组织，直到 耳软骨表面。浅层 伤口 及其周边组织无明显出 血 ， 深层 伤口 可见 大量红细胞。 伤后 3d，浅层 伤口 结痂，棘层 增生、变 厚， 并可见 增生的 及 少量胶原纤维 ， 伤口 及 周边组织水肿， 无 明显炎 性 细胞浸润 ； 深层 伤口 深达软骨表面 ， 伤口 周边 组织 轻度 水肿， 泛 增生 ，可见少量 出血，伴炎症细胞 的 浸润。 伤后 6d， 浅层 伤口 表皮 基本恢复 完整， 但 比 周围正常组织厚 ， 生；深层 伤口 棘细胞 明显 增厚， 纤维 细胞明显 增生， 创周 轻度水肿 且有 少量纤维素性渗出 和 红细胞 分布 。 伤后 9d，浅层 伤口 表皮连续 ，厚度也 接近 于 周围正常组织厚度；深层 伤口棘层明显增 厚 ，创 缘周围 组织仍轻度水肿， 纤维细胞明显增生。 伤后 12d，深层 伤口 纤维细胞 大量 增生，纤维成分增 多 ， 伤口 由致密纤维组织 所 填充，胶原纤维增加明显，散在 少量 红细胞。 伤后 27d，浅层 伤口 在 镜下 与正常组织无法区分 ；深层 伤口 纤维细胞 、 胶原明显增 多 。 0h 3d 6d 兰州大学硕士学位论文 皮肤创伤再生和瘢痕愈合中 A 和 9d 12d 27d 照片 2 兔耳皮肤 伤口 （ 色 ， 40） 。 创伤后 9d，浅层 伤口 表皮连续，厚度接近周围正常组织；深层 伤口 棘层明显增厚，创缘周围组织仍轻度水肿。伤后 27d，浅层 伤口 在镜下与正常组织无法区分；深层 伤口 纤维细胞明显增多。 of 40). d to of in in 7d be in 4 、 1 表达 层 伤口 的表达在各时间点均高 于 浅层 伤口 阳性表达于成纤维细胞， 呈棕黄色 。 在伤后 3d 的 浅层 和深层 伤口内即有表达，伤后 9d 时达到高峰， 12d 后逐渐下降， 但 深层伤口 伤后 27d（瘢痕改建期）再次升高（ p。随 伤口 加深， 伤口 的表达均增加 ： 伤后 127d 深层伤口 的 表达 明显 高 于 浅层 伤口 （ p片 3，表 1） 。 层 伤口 表达 在各时间点 均较 浅层 伤口 低 达于真皮层，呈棕黄色 。 浅层 伤口 于伤后 3d 即有表达 ，此后表达水平持续上升，于伤后 27d 时最高。深层 伤口 表达量伤后 持续上升 ， 第 9后逐渐下降。 伤后 12d 和 27d 浅层伤口 的 达量在各时间点均较深层伤口高（ p片 4，表 2） 。 层 伤口 表达在各时间点高 于浅层 伤口 要在表皮细胞、纤维细胞胞浆、毛囊、皮脂腺表达，阳性细胞呈棕黄色 。 浅层 伤口 于伤后 3d 即有表达，伤后 9d 时达到高峰， 12d 后逐渐下降。 深层 伤口 表达水平 在各时间点 较浅层 伤口 高 （ p照片 5，表 3） 。 兰州大学硕士学位论文 皮肤创伤再生和瘢痕愈合中 A 和 层 伤口 表达 均 高于浅层 伤口 要在表皮细胞、纤维细胞胞浆、毛囊、皮脂腺中阳性表达 ， 阳性细胞染色呈棕黄色， 浅层 伤口 于 伤后 3d 即有表达 ， 伤后 9d 时达到高峰， 12d 后逐渐下降 。 深层伤口 表达量逐渐增加， 9d 时达到 高峰。 深层 伤口 各时间点 均 高于浅层 伤口 （ p照片 6，表 4） 。 层 伤口 再生愈合而深层 伤口 瘢痕愈合 浅层 伤口 于伤后 9d 再生 修复 ，肉眼无法辨别与周围皮肤的差异 ；深层 伤口于 伤后 27d 呈 现 瘢痕愈合。 3d 6d 9d 12d 27d 照片 3 兔耳皮肤创伤后 表达（免疫组化 ， 40）。 真皮成纤维细胞 阳性表达。 in 40). n C in 3d 6d 9d 12d 27d 照片 4 兔耳皮肤创伤后 达（免疫组化 ， 40）。 阳性表达位于真皮乳头层 。 A in 40) A in 3d 6d 9d 12d 27d 照片 5 兔耳皮肤创伤后 达（原位杂交） 。