【毕业学位论文】（Word原稿）祁连山地区修长高原鳅谱系地理学研究

兰州大学硕士研究生学位论文 祁连山地区修长高原鳅谱系地理学研究 1 第一章 前言 物地理学与隔离分化 生物地理学是研究生物的分布及其规律的科学 ,研究领域涉及物种的起源、扩散、分化和 分布 ,与生态学、 地理学、古生物学、 进化 学 、分类 学 和分子系统学密切相关 ， 是一门交叉学科 （陈领 2005）。 现今分布在地球表面的大大小小的生物，其分布格局和种群大小等并不是随机的，那么，它们是如何起源的？为何会分布在现有的区域中 ？其种群大小和格局与其分布环境和历史环境变化有什么样的关系？伴随着这些问题，生物地理学应运而生 （ 010)。 1761年， 从历史发展过程来看，生物地理学分为 3个主要的时期，即古典时期、华莱士期和现代期。第一个阶段也被成为前达尔文时期，主要是指林奈（ 范 洪堡 (生物物种和分布区系的早期基本描述， 形成了一些感性的初步认识， 提出了一些基本的动植物知识和概念。 第二个阶段也被称为达尔文时期，达尔文的扩散学说和隔离分化思想占据了主导地位，在古典时期思想的引导下，这一时期的科学家对生物物种分化等问题进行了更加 深入的探索，正式形成了生物地理学的概念。第三阶段就是 1960年以来的现代生物学时期，由于板块漂移学说 的复兴，人们对生物演化、隔离分化又有了新的认识，一些旧的观点遭到怀疑，新的理论得到认可，使得生物地理学能够很快的发展。从另一角度来说，生物地理学又可被分为生态生物地理学和历史生物地理学。前者是指生物分布环境中的生态因素对生物分布模式的影响，如温度的变化，水分的多少，海拔的高低等等；后者 主要是指过去和现在大规模的历史事件和环境格局变化与生物种群分布模式的关系，如地质变化山脉的隆升和大尺度的气候变化等 （ 2007） 。 另外， 根据研究对象和范围的不同， 生 物地理学还可以划分为 植物生物地理学、动物生物地理学 、 海洋生物地理学、岛屿生物地理学等分支。 在我国来说，生物地理学依然是个比较新兴和年轻的学科，从研究对象来说，植物生物地理学远远多于动物生物地理学，总体研究力度比较小，因此，在此方面相对空白领域的研究尤为有意义和价值 （ 周志炎 1997） 。 伴随着板块漂移学说的兴起，激烈的探讨和探索开始展开，生物地理学中隔离分化的理论和思想站稳了脚跟，传统的物种起源中心学说和扩散理论 受到质疑。隔离分化是指，基于生物本身 的基因进化，在地质历史事件的影响下，地球兰州大学硕士研究生学位论文 祁连山地区修长高原鳅谱系地理学研究 2 上的生物分布形成了一定的模式格局 （ 010)。隔离分化并不否定扩散学说和起源中心学说，他们承认生物种群的扩散的存在现实性 （ 陈领 2005） 。相比较扩散学说只是适用于解释单一特定生物种群的分布格局来说，隔离分化 学说试图通过分析多个类群的分布规律来找到此生物分布模式下共同的关系和特征。随着研究的不断深入，它已经形成了一套相对成熟完整的工作方法，首先，通过构建系统发生树，对生物种群进行系统发育的分析，根据其不同区系不同分布环境的特点和亲缘关系的远近， 确定进化位置 （ W. 1981） 。然后，将系统发生结果的不同分支 用相对应的生存环境资料替换，产生出一个地区分支图。最后。通过叠加多个生物类群的地区分支图进行整合分析，得到它们共同的进化规律和分布特征，即产生一个隔离分化事件。 在生物地理学的研究领域中，隔离分化思想得以脱颖而出最主要的优势就是摆脱了之前扩散学说的不确定性和不可重复性，它的可检验性使其更加严密，更加具有说服力 （ 2008） 。在近年来，由于相关新颖技术的进步和改进，这方面的工作已经得到了很大的进展，但是由于隔离分化需要多 个生物类群进行系统发育的构建，相关研究人员对此类工作的探讨还相当有限，空白领域依然很多，因此，依然需要不停地探索和改进。 系地理学和第四纪冰期综述 谱系地理学 （ 生物地理学的一门分支学科。 1987 年， 一次提出“ 个概念，我们把它翻译成亲缘地理学或者系统 发生地理学等，它 作为一个新的学科将系统分类学和种群遗传学紧密的联系了起来。 主要研究世系分支上的物种，尤其是亲缘关系很近的物种的地理分布格局和演化过程 ，是对生物亲缘世系在空间尺度 和时间尺度的变化的探讨 （ 1988） 。 通过重建系统发生的谱系结构，分析相关历史地质事件与种群遗传结构的关系，从而探讨现有种群分布结构的起源演化历史和进化过程。 在谱系地理学中，隔离分化和扩散学说作为两派相对立的假说来解释产生地理隔离的种群的起源。 结合相关化石资料记录证据，利用种群内不同单倍型的系统发育分析，可推算出世系分支时间，种群在历史上发过的扩张和迁移等重要的事件。 归纳之前的研究成果，将 当前生物种群的分布格局分为了五大类型： 1、系统大分支异域化，高度遗传分化。就是说，在构建 的系统分化树中，主要的分支结构都是分布在不同区域的种群，并且不同地理分布的单倍型发生了很大的遗传分化，这是较长时间的地理隔离导致的结果。 2、系统大分支同域化，高度遗传分化。即分布在同一大范围区域的生物种群具有很大的遗传分化 ，主要是由于在此地理分兰州大学硕士研究生学位论文 祁连山地区修长高原鳅谱系地理学研究 3 布地区有着很大的祖先种群个体数，由于某些原因，一些近缘谱系的种群遭到灭绝，从而使其他的分支存活了下来，产生了很大的分化结果。 3、系统大分支异域化，低度遗传分化。谱系结构中所有分支的单倍型都具有很近的亲缘关系，这是由于种群之间基因流很低，促进了遗传分化的产生。 4、系统大 分支同域化，低度遗传分化 （ 1997)。此类地理模式就是说，小分支同区域内的 分化程度小于大分支地理区之间的分化程度。一般发生在一些生活史规律的物种谱系结构中，由于洄游等一些特定的生理特征导致遗传分化很低。 5、系统大分支多样化，低度遗传分化。即树状结构中大分支分布在不同的地理区域中，且每个大分支中，细微的分支结构都有其特定的支系结构 。这种模式一般是由于此类种群分布区域相对复杂，在历史上有过高频率的基因流 （ C. 2008） 。 谱系地理学得以出现并日渐受到研究人员的 青睐 主要是 基于 一定的基础之上，首先，溯祖理论分析群体遗传学是谱系地理学中最为成功的基础概念并将受到越来越多的重视 （ 2005） 。其次，各类分子遗传标记的大量使用在系统发育的研究中，得到的系统分支结果 具有显著的地理分布格局。最后，分子生物技术的普及，主要是 扩增序列测定技术也为谱系地理学的析提供了便捷和严谨的科技手段。相比较欧美国家，我国的谱系地理学发展起步较晚，但是，近几年来，国内的动植物谱系地理学相关研究得到了迅猛发展，如柏科植物的 在世界范围的谱系地理学分析，取得了很显著的成绩并得到了国际的重 视，还有青藏高原区域的动植物尤其是植物的谱系地理学研究也得到了深入。 关于第四纪冰期的研究近年来成为一个新的热点，尤其是青藏高原地区在冰期作用影响下气候的剧变，水量的 增减，对此区域的生物谱系地理结构有着深层次的影响。 第四纪冰期 发生在最近的 3百万年内， 在此过程中，冰川的扩张（冰期 致一部分生物种群灭绝，一部分种群退缩到适宜生存的区域即避难所 （张荣祖 2004） 。当气候变暖气温回升时，冰川消融，一部分生物种群就会回迁或扩张到其他新的适宜的生存环境中 。在冰期与间冰期的反复更替和变化影响 下，生物类群经过了迁移，扩张，再迁移，再扩张的过程，结果一些种群形成了一些特有的 分布模式和遗传格局。当然这些并不是凭空的猜测，在欧洲和北美的相关孢粉化石中得到了证据 。在本研究中，样品采集地点集中于祁连山脉地区，祁连山第四纪冰期中，山体隆升和气候变化，祁连山地区发生了两次大规模的冰期，当时冰川覆盖范围比较大，冰融时期，大量融水汇集到山底平原，如此反反复复 使得 祁连山区域 生物形成特定的分布格局。 兰州大学硕士研究生学位论文 祁连山地区修长高原鳅谱系地理学研究 4 连山地质历史 及冰期影响 祁连山山脉位于青藏高原东北边缘， 在河西走廊地区又被称作南山，无论是它孕育的冰 山积雪、草原 牧场还是沙漠戈壁，都是大自然的资源宝库。对祁连山的地质历史研究和冰期气候影响的考察 着手 相对比较晚 ， 1946 年第一次开始讨论祁连山地区关于古冰川的问题。现代的祁连山沟壑起伏，分布范围很广，祁连山山 系分布着大大小小数条西北至东南走向的平行山峰和宽窄不同的谷地 。山峰 海拔 高度大多在 40005000 米 左右 ， 最高点团结峰海拔 5808 米，四千米以上的高山终年积雪，由于整个祁连山脉是处于青藏高原这样一个大环境中，因此，即使是山峰间的谷地，海拔也在 3000 米以上 （ 1981） 。祁连山脉水系分 布呈网状中心发散的模式， 包含河西走廊三大内陆河水系，黄河支流和达木盆地内流水系，这些河流大多发源于祁连山冰川，主要水量靠冰川雪水融化供给。因此水量变化年变化较小，受气候温度季节变化很大。 关于祁连山脉 确定的地质年龄，科学们展开了深入的研究，主要是从岩石地貌，冰川沉积等方面提供了大量的证据。根据考察结果发现，祁连山山脉 在地质历史上依 然是一个相对 比较年轻的山脉，追溯它确切的构造历史， 直到现在总共发生了两次大规模的地质构造活动 （李吉均 1063） 。第一次发生在 上新世时期，此地区开始了显著大规模的抬升， 也是至此开始 进入了一个新的地质时期，此前的平原过程结束，展开了现在依然在进行没有停止的高山隆升过程。第二次发生在第四纪初期的一次强烈的隆升，此次的地壳抬升是波及整个祁连山脉的，造就了整个此地区的成片的 高山分布。由此可以得出，现在祁连山地区的水系分布格局是由第二次的抬升运动造就的结果。不能否认的是，除了以上两次大规模的地壳运动以外，中间掺杂着很多次小范围小规模的抬升等运动。地壳的抬升、山脉的多次隆升在河流的河床，山谷间出口上留下了很明显的历史痕迹和证据（ S. 2000） 。但是，显而易见，小的河流和小 的抬升运动 留下的痕迹相对不明显，而大的河流甚至于洪水在大的运动中留下了很明显的痕迹，这种现象在阶地中表现的很明显。 对于祁连山脉地区古冰川问题的研究和探讨，前辈学者们将此地区冰期划分为四次， 更有学者认为， 整个山脉的北坡曾经发生过两次冰期，第一次相对规模很大，在不到 3000 米的山峰都有冰川痕迹影响，而第二次的冰期相对很小，只分布在海拔较高的高山地带 （李吉均 1063） 。对于高原山地地区来说，多雨期即导致水量的增加， 冰川的扩大，即冰期的到来，随后干燥温暖的气候使得雨量减少，山间冰川融化，即间冰期的到来，但同时这 种温暖的气流又会导致新的一轮的多雨期的到来，这样反反复复的冰期与间冰期的变化，对当地的河流变化，生兰州大学硕士研究生学位论文 祁连山地区修长高原鳅谱系地理学研究 5 物种群变化等造成了很大的不可忽略的影响。因此，我们选择此区域作为实验的样品采集范围，同时选择修长高原鳅这样一种分布范围相对广泛并且与河流相依存的生物体作为研究对象，得到了与预期基本一致的结果。 藏高原动物谱系地理学研究进展 新生代印度和亚洲板块的撞击事件可以说是目前地球上最大和最积极的造山运动，在亚洲由此引发了一系列重要的地质地壳运动和气候变化，重新塑造着新生代的亚洲大陆板块，如青藏高原的抬升、东南亚地 区（主要为马来半岛）的侧向逃逸、以及亚洲季风气候的盛行等，对于这样一个全球一级板块区域，和地质学家一样，生物学家也有着浓厚的研究兴趣 。 喜马拉雅地区、中国西部山脉、缅甸 化的天然实验室 （李吉均 1063） 。 在渐新世后期， 随着中国西部地形的抬升，包括现在的喜马拉雅山，青藏高原和它们的周围区域，成为中国西部典型的地貌特征。相关的地质学事件的发生引发了气候的改变，并且随后导致了亚洲生物的重组。 青藏高原作为“ 世界屋脊 ” 和“第三极”，是最大最年轻的高 原，生物多样性非常丰富，是研究生物资源的“宝库”， 选择此区域生物做谱系地理学研究，可以 让我们 对青藏高原地区生物模式更加了解，对这一地区生物种群在第四纪冰期的环境变化中受到的影响有更深的认识。 青藏高原 物种多样性很高，造成现有生物种群类型异常丰富的原因首先是 在第四纪冰期气候剧烈变化的情况下，山脉隆升，河流冻结，使得生境片断化，大量生物种群退缩到或灭绝，当环境恢复适应，生物重新扩散演化。其次就是此地区复杂的地理环境为 物种的退缩提供了避难所，当间冰期来临时，又成为新的扩散辐射中心。 目前来说，青藏高原地区谱系地理学 相对来说还比较少，动物方面的研究更是少于植物，但是已经有了一定的进展 。植物方面如青海云杉、 祁连圆柏、 马先蒿、麻黄 、 露蕊乌头 等谱系地理学方面的研究 表明第四纪冰期剧烈的气候变化对这些植物种群结构产生了很重要的影响 ，更新世以来，横断山区和青藏高原的隆升对这些植物的遗传结构和种群分化产生了不可磨灭的影响。相对于植物来说，动物方面此地区的研究显得有些少，目前只有棘蛙族、裸鲤等少量物种的系统发生结构得到了研究。前辈学者对横断山区的鱼类 谱系结构 以及云贵高原的鱼类 系统分化 等做出了 越来越多的深入探索 （ 011） 。 综上所述，青藏高原地区谱系地理学研究仍然需要更深一步的探索 ，一些分子进化方面的问题，如基因流和种群迁移率、世系分化的估算问题、全球遗传多样性的重要区域和重要意义等等一系列的问题，都需要我们不停地探索。 兰州大学硕士研究生学位论文 祁连山地区修长高原鳅谱系地理学研究 6 研究所采用的分子标记 分子标记的产生，解决了以前生态学研究中其他方法难以处理的问题。 分子标记是生物基因组的一小段片段，选取的标准是 容易被识别的等位基因及相关序列，并且 期望可以代表整段 其他延伸部分。 现在以来最为常见的分子标记有： 卫星、 位酶及 。 其主要优 点就是分子标记可以比其他原始的生态学测量更加精确和有说服力。 共显性的分子标记在物种种群研究中是最为有效的 ，因为其高度的多态性并且非常易于结果的统计计算，但也有一定的缺点。事实上，不经过重组的 应用范围上是非常有限的，但是最重要的一点，这些母系遗传或者父系遗传的分子标记可以很有效的表达出种群中性别的差异信息。以溯祖理论为基础的最大似然法可以得到更加丰富的信息，使得种群遗传的研究可以更近一步。 上个世纪学者们用分子的方法第一次来解决进化问题，当时物种之间复杂的化学分子分界被用来确定种群的分界 线 （ 004） 。迄今为止， 现代的生态学学科分子标记 包括了很多新的方向。虽然不断出现的新的分子标记和分子技术在一定的方面会取代旧的标记和技术，但是没有一个分子标记是完全是用于任何物种的。因此，分子标记的时代不会结束还会继续发挥很重要的作用。 在 谱系 地理学 研究 中， 各类分子标记被广泛的应用。动物的线粒体 仍然被应用于亲缘地理学中。 般是母系遗传的，在 生殖遗传中不经历明显的重组，且线粒体 散的存在于细胞内，在分离纯化的时候比较容易 （ 1997） 。即使其优势地位被近年来新出现的微卫星标记等一部分取代有一定的下降，但大部分的学者依然选择运用 行相关的研究。线粒体 为分子标记 在动物种群 谱系地理学研究中具有以下几大优点： 1、现在 需要的一些通用引物不需要将基因组总 行 列 （ 2001） 。 2、在大多数的物种个体组织中有很多的线粒体 贝，我们可以相对很容易的得到目的片段的大量扩增。 3、线粒体 对于核基因来说有较高的突变率，因此我们可以通过谱系地理的分析得到 较高的遗传分化。 4、种群核苷酸多态性是中性的。 5、因为线粒体 有效种群数大小是二倍体物种核基因的 1/4，因此， 单种群会在相对短的时间里发生遗传分化。 6、动物线粒体 分子水平上没有经过重组，因此，每一个单倍型只有一个祖先倍型。 综合上边所说，我们选择了修长高原鳅线粒体 个片段 为分子标记，对祁连山地区的此物种谱系地理学结构进行分析。 兰州大学硕士研究生学位论文 祁连山地区修长高原鳅谱系地理学研究 7 原鳅属简介及研究背景 高原鳅属 是目前适宜分布海拔最高的物种之一， 主要分布在青藏高原及其毗邻 地区，但往南不超过喜马拉雅山，在北京永定河也有发现 （ W. 1981） 。 目前在我国分布有 70多个种，并且不断有新的物种被发现。属于高原冷水鱼，主要分布在高海拔冷水环境中，是青藏高原鱼类区系一个很重要的类群。最初，将高原鳅类群分为高原鳅属和赫氏鳅属，后来朱松泉教授将这两个属又合并成一个属，成为高原鳅属，把之前两个属设置成相应的亚属。 高原鳅 属鱼类身体延长，前驱呈近圆筒形，后驱渐侧扁或者靠近尾鳍处侧扁，头部稍微扁平前后鼻孔邻近，前鼻孔位于鼻瓣膜之中，有三对须，一对内吻须，一对外吻须和一对颌须 （ 2000） 。上颔正常，下颔呈匙状或者 铲状，大多数物种身体表面裸露无鳞（除少数几种身体被有小鳞片），体色花纹变化丰富，一般呈灰色或黑色，规律排布的斑状条纹。鳔的前室由左右两个侧室组成，鳔的后室发达或者退化，鳔的形状和发育程度因种类的不同而不同。胃呈“ U”型，肠的长短和环绕方式也因种类不同而不同。 属内每个物种雄性吻部两侧和胸鳍背面有小刺突区域 （ 2004） 。目前对高原鳅属的研究大部分集中于形态学、生活习性的描述以及新种的发现，谱系地理学比较系统的研究几乎没有，因此，对高原鳅亲缘地理学 的研究对了解此区域分布模式和环境对物种分布的影响 有很重要的意义。 兰州大学硕士研究生学位论文 祁连山地区修长高原鳅谱系地理学研究 8 第二章 实验材料及研究方法 言 青藏高原及其边缘地区一直被誉为“天然实验室”，本实验选择的研究对象修长高原鳅具有此地区地理分布范围广泛，海拔分布跨度大等天然优点。祁连山脉位于青藏高原东北边缘地区， 在地质运动中，原为古生代的大地槽，后来经过加里东运动和华力西运动，形成了褶皱带，白垩纪以来，祁连山主要处于断块的升降运动中，直到最后形成一系列的平行地垒（或山岭）和地堑（或谷地和盆地）。关于祁连山脉地区古冰川的探讨， 一般认为 北坡有两次，第一次规模很大，第二次仅分布在高山地带 （ Y. 1991） 。祁连山脉水系呈辐射状分布，中心区域位于北大河 和布哈河源头，由此毛毛山一带沿大通山至青海南山成为内外流域的分界线，东南方向是黄河支流的庄浪河和大通河等外流水系 （ L. 1992） 。西北方向是河西走廊内流水系石羊河水系、黑河水系和疏勒河水系。南侧是柴达木内流水系的鱼卡河、塔塔棱河、托来河等。 修长高原鳅（ 于高原鳅亚属的一个种，分布广泛，局部有少量的捕捞。 于 长江、 黄河上游、西藏北部、柴达木盆地、青海湖以及河西走廊等地都有采集。 根据野外观察和相对有限的文献支持，高原鳅对于生活环境的要求比较高，水温、浑浊度、水质、流速等都是影响因素，所以，它的分布范围和种群的扩散速度也会因此变得缓慢。 体色浅黄或者黄色，背鳍前后各有47 条褐色横状条纹。 身体延长，前驱近似于圆筒形，后驱低而宽，尾柄高度向尾鳍方向基本不 减 。 尾柄长是尾柄高的 ， 头部稍微平扁，吻部尖，口下位。唇偏厚，上唇边缘多为 短的 乳头状突起 ，流苏形状，下唇表面多为褶皱或乳头状突起，下颔匙状，不外露，须中等 长度， 前后两鼻孔紧紧相邻，前鼻孔呈瓣状。 身体表面无鳞，侧线完全 （ 1992） 。 背鳍分枝鳍条为七根， 腹鳍基部起点相对于背鳍基部起点或者第一根或者第二根鳍条根部 ， 腹鳍尾端伸及肛门 。鳔后室基本退化，肠短，胃呈“ U”形。本种 一般栖息在流速湍急的河段，于河道等开始解冻即开始 产卵 繁殖，且主要以昆虫幼虫等为食。 根据野外观察和相对 有限的文献支持，高原鳅对于生活环境的要求比较高，水温、浑浊度、水质、流速等，所以，它的分布范围和种群的扩散速度也会因此变得缓慢。 兰州大学硕士研究生学位论文 祁连山地区修长高原鳅谱系地理学研究 9 料和方法 品采集 及形态学鉴 定 本研究选取 祁连山水系 及附近 范围内进行样品采集， 样点 分布范围包括祁连山北侧河西走廊区域、祁连山南侧柴达木盆地自流 水系、祁连山西侧肃北地区及祁连山东侧石羊河流域地区，总共 16 个样点， 216 个样品 。 本实验选择的研究对象修长高原鳅具有此地区地理分布范围广泛，海拔分布跨度大等天然优点。 涵盖石羊河水系、黑河水系、疏勒河水系、黄河大通河水系和柴达木盆地自流水系，统计采集到 16 个 自然 种群 ，样品采集原则保持基本的种群隔离，分布在有一定地理隔离的河流水体中 （图 2。 野外采集过程中，采样点用 位采集了经纬度、海拔高 度等信息，并且对修长高原鳅种群生境进行了记录，具体包括河宽、水深、流速、浊度、 等等。 样品经过初步的形态学鉴定后 立即 用无水乙醇 浸泡 在收集管中保存，随后放入 时间保存。 样品形态学的初步鉴定参照朱松泉老师编著的中国条鳅志，初步进行形态学的分类。在此基础之上，请教中科院武汉水生研究所何德奎老师进行进一步的确认。实验结果中对样品进行拍照（图 2 图 2修长高原鳅 的 形态特征示意图 he 州大学硕士研究生学位论文 祁连山地区修长高原鳅谱系地理学研究 10 图 2修长高原鳅 的分布范围和种群分布 （绿色圆点代表样点位置） of 因组 取 将所有样品进行总 提取， 选取海洋动物组织基因组 取试剂盒提取样品基因组总 提取的总 过检测 ,浓度比较高，足够进行目的片段的扩增。 具体实验操作步骤如下： （ 1）将实验所用的枪头、离心管、镊子、手术剪等进行灭菌处理。 （ 2） 称取最多不超过 30样品尾柄处肌肉组织材料，放入装有 200涡震荡 15 秒。 （ 3）加入 20白酶 K（ 20mg/液，漩涡混匀，简短离心以去除管盖内壁的水珠， 56C 水浴 12 小时，中间每隔半小时震荡一次，直至组织完全溶解，简短离心以去除管壁的水珠，再进行下一步骤。 （ 4）加入 200冲液 分颠倒混匀， 70C 水浴放置 10 分钟 ，溶液应变清亮，简短离心以去除管壁的水珠。（一般加入 液会产生白色沉淀，兰州大学硕士研究生学位论文 祁连山地区修长高原鳅谱系地理学研究 11 70C 放置后会消失） （ 5）加入 200水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能出现絮状沉淀，简短离心去除管盖的水珠。 （ 6）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱内， 12000心 30秒，倒掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。 （ 7）向吸附柱中加入 500用前先加入无水乙醇）， 12000心30 秒，倒掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。 （ 8）向吸附柱中加入 700用前先加入无水乙醇 ），室温放置 3 分钟，12000心 30 秒，倒掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。 （ 9）向吸附柱中加入 500用前先加入无水乙醇）， 12000心30 秒，倒掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。 （ 10）将吸附柱放回收集管中， 12000离心 2 分钟，倒掉废液，将吸附柱放置 数分钟，彻底晾干吸附材料的残余液体。 （ 11）将吸附柱转入一个干净的新的离心管中，向吸附柱中间部位悬空滴加50200脱缓冲液 温放置 5 分钟， 12000心 2 分钟将溶液收集到离心管中。 物的选择 通过文献的阅读， 研究选取了修长高原鳅线粒体 两个片段，分别为细胞色素 b（ 和环氧合酶 1（ ，通过查阅相关文献，尝试用 15915 和 对引物进行扩增，实验结果表明条带清晰，达到送测标准。 增及测序 引物对应碱基序列见表 2 表 2in 增片段 正引物（ 5 反引物（ 5 线粒体目的基因的扩增和测序 两组引物经过生物公司合成后稀释为 5P 过几次反应体系和反应条件的摸索，最终确定了最适宜的 体系浓度和反应程序 。片段 增反应的 25应总体积包括 灭菌 1 祁连山地区修长高原鳅谱系地理学研究 12 正引物 1引 物 2ul ， 1应程序如下：首先预变性 94C 5后 35 个循环包含 94058C 退火 4572C 延伸 1后后延伸 72C 7片段 系为：每 25应总体积包括 灭菌 CR 引物 引物 2， 1 应程序如下：首先预变性 94C 5后35 个循环包含 94C 变性 3055C 退火 4572C 延伸 1后后延伸72C 7两端基因片段经过扩增后电泳检测 后 条带清晰， 带大约 1000段大约 800右，扩增样品密封后 送去北京六合华大基因公司进行碱基序列测定。 据分析 将测序的得到的数据结果 用 行序列多重比对，在此同时，以原始测序 峰值结果为标准进行人工校正。比对结束后 段有效序列长度为 1000 个 段有效序列长度为 635 个 两个片段进行拼接。 利用 软件 生成单倍型，然后将所有的单倍型以及外类群采用最大简约分析法（ 极大似然法（ 贝叶斯法用.0 件构建系统发生树。将生成的单倍型用 建单倍型网状图。接下来，运用 件计算 种群分化水平 （ 、物种 总遗传多样性（ 和 种群内遗传多样性（ 。最后，的分子多样性变性分析 of 算模块对种群内及种群间遗传变异进行估算，设置 1000 次的随机参数进行置换检验 。 兰州大学硕士研究生学位论文 祁连山地区修长高原鳅谱系地理学研究 13 第三章 结论 验结果 群地理位置及单倍型分布 我们总共采集到 修长高原鳅 16 个样点 16 个自然种群 ， 共 216 条个体 ， 49种单倍型 。每个自然种群个体数量由 1 到 35 个不等。采集过程中用 外定位仪器记 录了样点的经纬度、 海拔信息 及种群个体和单倍型分布情况 。 表 3长高原鳅 采集种群的地理位置和 线粒体 单倍型分布 of of N） / E） m） N T T T T GL 731/10224 3731/10224 3731/10224 3731/10224 3731/10224 3731/10224 3731/10224 3731/10224 3718/10309 2810 2810 2810 2810 2810 2810 2810 2810 2613 5 2 1 3 1 1 1 1 1 2 4 6 8 L 718/10309 2613 1 L 718/10309 2613 2 L 718/10309 2613 1 J 717/10314 2475 1 D 840/9825 3390 4 D Q Z 840/9825 3850/9850 3824/9939 3804/10023 3845/10006 3390 3827 3202 2934 1774 1 6 4 10 4 16 16 州大学硕士研究生学位论文 祁连山地区修长高原鳅谱系地理学研究 14 续 表 3长高原鳅 采集种群的地理位置和 线粒体 单倍型分布 N） / E） m） N YN 850/9850 3827 1 Q 824/9939 3202 1 B 804/10023 2934 1 B B B BB 804/10023 3804/10023 3804/10023 3804/10023 3804/10023 3804/10023 2934 2934 2934 2934 2934 2934 1 1 1 1 1 1 21 23 25 GZ 845/10006 1774 1 Z 845/10006 1774 1 Z T T E E E M R L L E E E M 845/10006 3845/10006 3738/9529 3738/9529 3738/9529 3626/9423 3625/9452 3630/9611 3625/9452 3630/9611 3625/9452 3630/9611 3630/9611 3646/9904 3630/9450 3630/9450 3930/9600 4032/9631 3930/9600 4032/9631 3625/9452 3625/9452 3625/9452 3625/9452 3625/9452 3625/9452 3630/9611 1774 1774 3240 3240 3240 2779 2818 2691 2818 2691 2818 2691 2691 3163 2169 2169 2130 1316 2130 1316 2818 2818 2818 2818 2818 2818 2691 3 1 9 1 5 8 3 10 35 1 3 1 1 32 11 1 8 6 4 1 1 3 2 2 1 1 1 29 31 33 33 34 36 38 40 40 42 44 46 48 州大学硕士研究生学位论文 祁连山地区修长高原鳅谱系地理学研究 15 统发育分析及主要分支 结构 选取 鳅科须鳅属 托氏须鳅 鳅科南鳅属 背纹 南鳅 高原鳅属 似鲶高原鳅 为外类群 ，经过一系列数据处理和软件分析得到系统发育树结构， 使用 最大简约分析法（ 极大似然法（ 贝叶斯法用 .0 件 分别 得到的树形结构进行比较分析， 分支 结果基本一致，因此，选择 件得到的进化树进行分析（图3分支结果与预想结果基本一致，具有明显的谱系地理结构。 使用 3，与系统发育树结果进行比较，网络聚合结果和树状分支结果一致，有明显的星状结构，联系对应种群地理位置进行分析，结果具有一定的分析意义。用 叶斯方法对修长高原鳅 物种的分化时间进行估算，得到的结果显示。 图 3长高原鳅线粒体单倍型网状分析图 of 州大学硕士研究生学位论文 祁连山地区修长高原鳅谱系地理学研究 16 图 3长高原鳅 单倍型系统 发育 树 of 遗传多样性及种群隔离分化 修长高原鳅共 216 个试验样品，生成 49 个单倍型，测序结果 635 个 使用 件将所有单倍型的碱基变异位点统计，共 337 个碱基变异位点（表 3然后将 16 个自然种群， 49 个单倍型的所有单倍型数据生成 式文件，使用 件进行 析 （表3将所有种群单倍型分布情况和单倍型变异碱基位点运用 件进行分析，得到相应的 然种群总的遗传多样性）、 理单元遗传分化系数）和 传分化系数）。 修长高原鳅 自然种群总的遗传多样性 于种群间遗传多样性（ 因此地理单元间的遗传分化系数 （ 和遗传分化系数兰州大学硕士研究生学位论文 祁连山地区修长高原鳅谱系地理学研究 17 （ 也较高。这表示了 修长高原鳅 种群间的遗传分化较高，并且种群间基因流较少 ， 在物种水平单倍型间有着明显的谱系地理结构 。 表 3长高原鳅 种群之间单倍型 of of of of of 5 a 200 215 b to of 州大学硕士研究生学位论文 祁连山地区修长高原鳅谱系地理学研究 18 表 3长高原鳅 49种 单倍型比对后的变异位点从 5 到 3 分布情况 of of NA in 2 2831 46 52 58 59 70 76 79 100 106 127 139 160 163 178 187 217 223 244 256 274 280 283 286 289 298 304 307 310 313 319 325 328 331 339 94268 418 103148 133172 181454 247 208253 241 637 301 607 322 727 493 352 214439601787808 4244