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兰州大学硕士研究生学位论文 糖尿病胃血管变化、胃平滑肌收缩功能与胃动力变化的关系 1 前 言 糖尿病( 一种 以糖、蛋白质、脂质代谢紊乱为特征的慢性代谢 型 疾病,能够对机体多个脏器造成损害。 近年来 ,随着人们生活水平的提高,生活方式的改变,糖尿病的发病率增长迅速 。 据亚洲糖尿病学会调查资料显示,截至 2012 年中国糖尿病患者已达 9240 万人,发病率高达 并且年轻化趋势明显,在 30的人群中,糖尿病发病率增长最快。 糖尿病主要引起心、脑、肾、眼以及周围神经损伤, 而这些( 心、脑、肾、眼以及周围神经病变 ) 组织器官的损伤 正是糖尿病致死的主要原 因 。糖尿病胃肠功能障碍,虽不是糖尿病致死的主要原因,但发病率较高, 75%的糖尿病患者会出现早饱,恶心,腹胀,腹痛,腹泻或便秘等问题 1,严重影响了患者的生活质量,造成了巨大的社会 负担 和经济 损失 1,2。 1958年是糖尿病胃动力障碍最典型的表现,国外研究显示, 30%长期糖尿病患者存在胃排空延迟 3,糖尿病胃轻瘫占全部胃轻瘫的 29%4。 糖尿病胃轻瘫是 一种慢性 非梗阻性胃排空延迟,长期糖尿病患者,存在上消化道症状,经内镜、上消化道钡餐造影、 排空检查显示胃排空延迟,可诊断为糖尿病胃轻瘫。胃轻瘫时胃排空减慢,胃动力减弱, 食物到达小肠的时间延长,引起腹胀、早饱等症状,更严重者可出现恶心、呕吐等不适,同时由于胃排空的异常使小肠对葡萄糖的吸收发生改变,血糖不易控制。血糖控制不良又会进一步加重糖尿病胃肠道损害 。 糖尿病胃动力障碍的发生与多种因素 有 关,但其发病机制目前仍不清楚,这对糖尿病胃动力障碍的治疗是一个巨大的挑战。目前大多数学者认为自主神经病变、高血糖、胃肠激素分泌紊乱和微血管病变可能是造成胃动力障碍的主要原因 5探 讨糖尿病大鼠,胃平滑肌条收缩功能及胃血管变化与胃动力改变之间的关系,对糖尿病胃动力障碍发生机制的研究 具 有重要的意义。 兰州大学硕士研究生学位论文 糖尿病胃血管变化、胃平滑肌收缩功能与胃动力变化的关系 2 背 景 回 顾 糖尿病是一种常见的内分泌疾病,其发病与遗传和环境因素相关,全世界大约有 1%人患有此病。 据估计, 在亚洲大约有 2 000 000 名糖尿病患者。糖尿病对机体的多个器官造成损害,其中消化系统损害主要包括: 食道运动障碍 、食道下 括约肌 张力降低 8,9引起胃 食管反流;肝脏 脂肪 变性、转氨 酶 升高 8,有些患者甚至可以发展为肝硬化,但在糖尿病得到控制后肝脏损害能够缓解;胆囊 运 动障碍 、胆汁淤积 , 使 胆囊结石 ( 胆囊炎( 的发病率 明显 升高 10,11;胃动力障碍,胃排空延迟或加快,糖尿病胃轻瘫 ( 为其典型并发症;肠道运动功能障碍, 肠蠕动减慢,对内容物的转运功能下降 ,细菌过度生长,引起严重的便秘 12或腹泻 13。 胃动力障碍,是糖尿病常见的并发症,主要临床变现有恶心、呕吐、打嗝、早饱、腹胀、腹泻、便秘和腹部慢性疼痛等,症状不典型,常与消化道器质性疾病(胃炎、胃溃疡、胃肿瘤等)的 症状相重合 14。糖尿病胃动力障碍大多数表现为胃排空延迟 ( 28 ,但也可出现胃排空加快 15由于糖尿病时于胃排空速率不稳定,使得糖尿病患者血糖不易控制,服药后血药浓度发生改变,从而影响药物的效能。 近年来随着糖尿病的发病率的逐渐升高,糖尿病胃轻瘫的患病率也呈现逐年上升的趋势,因而受到人们的高度重视。长期研究认为,糖尿病胃轻瘫的发病率与糖尿病的病程呈正相关,但糖尿病胃轻瘫在糖尿病持续多长时间后发病,仍无法确定。徐洪军等运用饮水负荷试验和超声显像技术,检测不同阶段糖尿病患者的胃感觉阈值和胃 排空情况发现:病程在 5年以上的糖尿病患者,胃感觉阈值明显降低,胃排空时间延迟,可能存在糖尿病胃轻瘫 17。 动力学改变 胃是一个肌性器官,可分为胃底、胃体、胃窦和幽门四部分,在胃排空过程中起着不同的作用,共同调节胃的运动 18。胃底和胃体的近端 1/3 称为近端胃,主要功能是容纳、储存食物,通过收缩运动维持胃内的压力梯度,将食物向胃窦部推进。胃体的远端 2/3 和胃窦称为远端胃,以蠕动收缩活动为特点,兰州大学硕士研究生学位论文 糖尿病胃血管变化、胃平滑肌收缩功能与胃动力变化的关系 3 主要负责食物的粉碎、混合,研磨,将大分子颗粒转化成较小的食糜,促进固体物质的 排空。一般情况下,幽门部压力较高,在胃窦部收缩,食物粉碎研磨阶段,幽门仍处于关闭状态,直到固体大颗粒转化为 2食糜,幽门才开放,进而使食物通过幽门进入十二指肠 19。胃的排空主要决于胃腔与十二指肠腔之间的压力差,近端胃张力性收缩和远端胃收缩是胃排空的动力,幽门和十二指肠的收缩是胃排空的阻力。胃窦与幽门的协同运动以及小肠对营养物质的吸收对胃的排空有重要作用 20。糖尿病时胃底部的容受性舒张功能下降,顺应性降低;胃窦的收缩幅度下降,收缩频率减慢、推进性蠕动减少或消失,消化间期移行性复合运动期 ( )减少或消失,期收缩波幅降低;胃窦与幽门十二指肠协同运动减少,出现幽门痉挛或幽门关闭不全。这些都可影响糖尿病患者的胃排空功能。 经系统病变 胃的运动受交感神经系统、副交感神经神经系统以及肠神经系统 的 调节。正常情况下交感神经对胃肠道的影响较小,主要起抑制作用;副交感神经神经对胃肠道运动起主导作用,既有抑制 作用 又有兴奋作用。 主神经病变 有研究表明, 糖尿病自主神经病变( 可能是造成糖尿病胃动力障碍的主要原因。 G. 1,22等的研究发现 糖尿病患者迷走神经神经节出现不同程度的阶段性脱髓鞘和轴突变性,神经节超微结构发生改变,神经纤维减少,传导速度下降。对糖尿病胃轻瘫患者进行假饲实验,发现其胃酸的分泌较正常人减少了三分之二,血清胰多肽和生长素的反应性改变迟钝,可 认为 存在迷走神经功能障碍 23。 N. 的研究认为在糖尿病早期可能存在自主神经病变,但由于在此时患者症状较少或无症状,不易被发现,因此对其研究较少 24 。但张喜娟等的研究显示,注射链脲佐菌素( 24 周后的糖尿病大 鼠未见自主神经改变。另外,部分糖尿病患者存在胃动力障碍,但无自主神经病变 25,由此说明自主神经病变不能完全解释糖尿病胃动力障碍的发生原因。 神经系统 肠神经系统( 括大量的胃肠壁内神经节和神经纤维,在胃肠壁不同层之间形成神经丛,是一个相对独立的神经网络。一氧化氮合酶神经元位于肠神经系统,促使内源性一氧化氮的产生,雷亚宁等的研究显示在 导的糖尿病大鼠中,回肠肌间神经丛内胆碱能神经元的表达降低,而氮能神经元的表达阳性率升高,可能是糖尿病 大鼠胃肠运动减弱,平滑肌松弛,胃排空障碍的原因。 6等观察 14 名难治性胃轻瘫患兰州大学硕士研究生学位论文 糖尿病胃血管变化、胃平滑肌收缩功能与胃动力变化的关系 4 者的胃组织活检标本发现,有一半的患者存在肌间神经从 质细胞( of 目明显减少,组织形态发生改变,肠肌层炎性细胞浸润,而另一半的患者不存在神经系统的组织形态学改变,这部分患者胃动力障碍的发病机制可能与神经肌肉病变无关,而与中枢神经系统或者激素分泌相关。与以往的研究不同的是 的研究发现糖尿病胃轻 瘫患者胃组织中氮能神经元和非氮能神经元的分布均减少,非氮能神经元是一种兴奋性神经递质,能够促进胃肠的蠕动 27。 J28和 29的研究也证实了在糖尿斌胃轻瘫时,肠肌间从神经元数目减少,神经纤维分布异常,神经细胞形态学发生改变。 的研究证实,长期的糖尿病可能会引起 30。 质细胞是一种胃肠起搏细胞,控制胃肠运动的电节律,与慢波的形成有关,同时它还具有兴奋传导功能,接受肠神经系统神经元的信号传递,引起平滑肌的收缩活动。因 此在胃肠动力中起着重要的作用,糖尿病是 质数目的减少,形态功能的改变可能是引起糖尿病胃动力障碍的主要原因。 血糖 高血糖可使正常人和长期糖尿病患者的胃排空减慢 31,32,固体和液体胃排空均延迟。但是在糖尿病早期血糖越高,胃排空越快,这可能是对尿糖排出增多的一种反应,通过加速胃排空,促进葡萄糖的吸收来补充血糖的 流 失 33。血糖控制较好的糖尿病患者胃排空可能正常。高血糖能够抑制正常人消化间期移行性符合运功,有报道,当血糖升到 14时几乎可以完全抑制 的出现。高血糖 可使 胃窦收缩频率和振幅下降,降低近端胃的压力,损害幽门与胃窦十二指肠的协同运动,从而使胃排空减慢 34。高血糖可影响胃电起搏,使胃电节律发生紊乱,急性高血糖可使健康人的胃电节律紊乱,形成与糖尿病患者相似的慢波节律 35。 1%糖尿病高血糖患者会发生慢波节律紊乱,而在血糖正常的糖尿病患者,仅有 4%会发生慢波节律紊乱 35。 康人在血糖 230mg/血糖在 175mg/36。 血糖是通过损害神经系统而不是肌肉的收缩功能来影响胃排空的 37。长期的高血糖可导致血液黏度增加、微循环障碍,众多生化因子如糖化蛋白终末产物等不断形成,过度的氧化应激,使自主神经及肠神经系统,发生不可逆病变,从而影响胃排空的功能。 肠激素对胃动力的影响 胃肠激素( 由胃肠道内分泌细胞和胰岛细胞分泌的高效能的生物活性物质,对胃肠道的运动有重要的调节作用。糖尿病时血兰州大学硕士研究生学位论文 糖尿病胃血管变化、胃平滑肌收缩功能与胃动力变化的关系 5 中胃肠激素的浓度发生改变。胃动素,广泛分布于胃肠道,主要作用是促进胃肠运动, 增加胃的收缩活动,有利于胃排空。 孙维峰等发现糖尿病胃轻瘫患者血浆胃动素水平明显高于正常,但不伴有 的出现,其胃 电节律紊乱,以胃动过缓为主 38。 的研究发现糖尿病患者基础胃动素水平升高,但服用胃复安后,正常人胃动素水平升高,而糖尿病患者胃动素水平反而下降 39。通过上述研究我们认为糖尿病时由于胃动力减弱,致使胃动素水平代偿性升高,而在用胃复安,胃动素代偿机制缺失,胃动素水平反而下降。胃泌素主要作用是刺激胃酸的分泌,使胃窦和幽门括约肌收缩,抑制胃的移行性复合运动,使胃排空减慢 。吴波等的研究发现 糖 尿病胃轻瘫患者血清胃泌素水平明显增加,胃窦和幽门的收缩加强,胃排空阻力增加,胃排空时间延长 40。 用于胃肠道,使胃肠平滑肌收缩。在糖尿病时血浆 P 物质明显降低,与糖尿病病程呈负相关 41。 P 物质的改变可能与胃排空相关。林琳等的研究发现 导的糖尿病大鼠,血浆和胃窦组织中生长抑素( 平明显升高,胃窦平滑肌的收缩频率和振幅明显降低。生长抑素对胃肠道平滑肌的运动有广泛的抑制作用,与平滑肌的 体结合,抑制乙酰胆碱的释放,或者 通过肠神经系统,抑制平滑肌的收缩。 人体注射生理剂量的 可显著抑制胃排空。糖尿病时血浆和胃窦组织中生长抑素的增加也 可能是胃排空减慢的原因之一 42。 血管病变 微血管病变是糖尿病的一种基础病变,可发生在机体的各个组织器官。目前,对糖尿病微血管病变的研究主要局限 于 心血管,脑血管,肾脏、视网膜及皮肤微血管 43,44。张喜娟等的研究发现 导的型糖尿病大鼠,造模 24周后胃粘膜血管密度降低,浆膜下小血管纤维化增加,胃排空减慢 7。可能是胃微血管病变,造成组织缺血缺氧,加重自主神经及平滑肌的 损伤,从而影响胃排空功能。 平滑肌损伤 最近有研究表明,肌肉病变可能在糖尿病胃动力障碍中发挥作用。糖尿病时胰岛素 /胰岛素生长因子 1( 少,造成 后的干细胞因子消耗,最终至肌肉萎缩。窦娟等的研究发现 导的型糖尿病 大鼠胃窦平滑肌细胞胞核肿胀、肌浆网、内质网扩张,部分细胞胞质内细胞器溶解、消失 ,细胞空泡形成 45。张亚萍等的研究也发现在造模后 12周,电镜观察糖尿病大鼠胃肠道平滑肌,发现平滑肌细胞均有显著的空泡变性,胞质 溶解,线粒体肿胀并有不同程度的肌细胞排列紊乱 46。可见糖尿病造模兰州大学硕士研究生学位论文 糖尿病胃血管变化、胃平滑肌收缩功能与胃动力变化的关系 6 一段时间后,胃肠道平滑肌细胞会发生改变,影响平滑肌的收缩功能。陈霞等认为糖尿病大鼠胃平滑肌线粒体信号转到通路改变,导致平滑肌细胞凋亡可能是引起胃动力障碍的原因 47。 尿病时固体和液体的胃排空情况 液体的胃排空明显快于固体 的胃 排空,液体物质在胃内快速分布,迅速进入十二指肠,营养物质能够使胃液体的排空减慢。过去的研究 认为 液体物质无需在胃内研磨,不含营养物质的液体胃排空减慢在胃轻瘫晚期才出现,对疾病的临床诊断意义不 大 48,49。但一项糖尿病早期研究显示,在糖尿病早期, 24%的患者出现液体胃排空延迟但固体胃排空正常 50。还有研究表明液体胃排空的延迟还与一些消化道症状相关 49,51。另外对于液体胃排空在糖尿病时发生的改变目前仍未达成共识,糖尿病时液体胃排空可减慢,加速或无明显变化。 糖尿病早期,含能量的液体胃排空是加速的 52。糖尿病固体胃排空是诊断胃肠动力障碍的主要依据,主要表现为胃排空减慢。 排空的检查方法 线法 本方法是服用一种或一种以上不透 X 线标志 物,拍摄腹部立为平片估算胃排空的速率。此方法简单,无创,可以反映胃消化间期的功能,但受幽门功能及胃形态的影响,准确性不高,且不适于液体排空。 素显象法 核素显像法胃排空的测定,是将放射性核素标记的药物与标准试餐混合,该放射性核素不被胃黏膜吸收,口服后经照相机连续记录胃区的动态图像,通过胃内放射性核素的残余量,计算胃排空时间。 该方法 是胃排空测量的金标准,也是最常用的方法。常用 9999记固体食物,111记液体食物。该方法无创、适用于所有食物的胃 排空测定,不影响正常的生理功能,可对胃窦动态显象,能够定量的分析固体和液体的胃排空,可重复性好,准确度高,是测定胃排空的金标准 53。但耗时较长,对设备的要求较高,价格昂贵,有一定的放射性,部分患者不能耐受,使用受到一定的限制。 声技术 1985 年 4首次将超声技术用于胃排空的测定 ,其基本方法是进兰州大学硕士研究生学位论文 糖尿病胃血管变化、胃平滑肌收缩功能与胃动力变化的关系 7 餐后用超声仪检测胃的形态及体积变化,根据一定的方法来确定胃排空速率。该技术的优点是无创、无放射、应用广泛,能够观察胃窦蠕动收缩,幽门的功能,是其它技术无法比拟的。另外,新技术还 在不断地开发应用, 三维超声用于胃体积的测定,三维超声成像 无需对所扫描的结构进行假设,而是将某感兴趣的区域单独提取、分析,显示其三维形态,并计算出体积,这样所测得的数据不受受试者体位及胃窦部形状的影响,接近其生理真实值。但其耗时较长,肥胖患者不易进行且对操作者的 技术 要求较高 55。 物阻抗技术 生物电阻抗技术是一种利用生物组织器官的电生理特性及其变化规律提取与人体生理、病理状况相关的 生物学信息的检测技术。由于胃在不断地收缩运动,进食后,其形态、体积,食物的分布情况不断地发生改变,产生不同的电信 号,较易提取阻抗信息。阻抗式胃动力检测技术是应用生物阻抗技术、现代电子学和计算机技术,通过体表电极连续检测胃的运动信号,提取与胃动力学状况相对应的电信号及其变化信息,反映胃的收缩、蠕动及排空的过程,从而达到检测与评价胃动力 的目的。 该技术具有无创、敏感性较高,能够准确地提取与胃动力变化相关信息、操作简单、费用低廉等优点,具有良好的发展前景 56。 电活动的测定 胃电图( 通过体表电极将胃的电活动信号记录出来的技术,通过分析胃电的频率和规律来反映胃的运动 状况。该方法是在生理状况下进行的无创技术,在某种程度上能够反应胃窦的收缩功能 57。但抗干扰能力差,周围环境的变化即(如噪声,气流变化等)可对记录结果造成影响,准确度不高,不能完全反应胃电活动的变化。 3C 呼气试验 13食含有1313该化合物在胃内不被吸收,而在小肠内吸收,在肝内氧化生成 血液运行到肺,经呼吸排出,在这个过程中胃排空是其限速步骤,所以测定呼出气体中被标记的 接的反应胃排空情况。该方法具有简单、方便、安全性高,与核素显像具有较高的一致性等优点,广泛应用于临床。但该方法为一种间接地研究方法,仍缺乏统一的计算标准,而且不适用于患有肝脏、胰腺疾病的患者。 胃的运动与胃肌电活动直接相关。胃机电活动通常用胃电图来测定,胃电兰州大学硕士研究生学位论文 糖尿病胃血管变化、胃平滑肌收缩功能与胃动力变化的关系 8 图是一种应用体表电极记录胃机电活动的方法。大部分胃动力障碍的患者存在胃电图改变、胃电节律异常。胃电图在某种程度上可反应胃窦的收缩功能,但胃电图参数与消化道症状之间的关系仍不明确。另一种反应胃窦收缩功能的方法是胃窦核素显像法, 该方法能够测定在整个胃排空过程中,单纯胃窦收缩的频率和振幅。胃肠道压力测定也能检测胃窦的收缩功能。胃肠压力测定是通过压力传感器将消化腔内的压力变化转化为电信号,经生理记录仪记录下来的一种技术。能够准确的反应胃窦、幽门及十二指肠的收缩运动。 目前用于研究的糖尿病模型主要有:实验性动物模型、自发遗传性动物模型、转基因动物模型。 实验性糖尿病动物模型 实验性糖尿病动物模型是指 通过物理、生物、化学等致病因素,人工诱发出的具有糖尿病特征的动物模型。具有耗时短 , 方法简便 , 易于掌握 , 重复性好的特点 ,价格较低, 短期内可诱导出大量模型等特点,广泛应用于实验研究。1890 年, 狗行全胰腺切除术,制造了第一个糖尿病动物模型 58。但由于该方法损伤较大,已较少使用 。 此后相继出现了链脲佐菌素( 四氧嘧啶、病毒感染等方法诱导的糖尿病模型。本实验采用大剂量链脲佐菌素左下腹腔注射诱导的 1 型糖尿病( 型。链脲佐菌素( 一种抗菌抗肿瘤药物,能够选择性的破坏某些种属动物的胰岛細胞,从而诱发糖尿病, 一般采用大鼠和小鼠制造动物模型 59。国外有学者报道雄性大鼠制造模型的成模率明显高于雌性大鼠 60。大剂量注射 40 直接 造成大量的 胰岛 细胞 的破坏 ,而 反复多次 注射 小剂 量15mg/腔注射,可诱发免疫反应 , 致使 胰岛 细胞 不断破坏 , 最终导致糖尿病的发生 61。 2 型糖尿病 ( 的动物模型 是在高脂饮食诱发胰岛素抵抗的基础上加用 腔注射 。 内脏毒性相对较小,造模成活率较高,是目前国内外使用较多的一种制备糖尿病动物模型的方法 。 发性糖尿病模型 自发性糖尿病动物模型是动物在自然条件下产生的,通过遗传育种培养而保留下来的疾病动物,与人类糖尿病更为相似,应用于糖尿病发病机制及其并发症方面的研究。但此模型存在价格昂贵,不易饲养,易发生基因突变等缺点。 兰州大学硕士研究生学位论文 糖尿病胃血管变化、胃平滑肌收缩功能与胃动力变化的关系 9 基因糖尿病模型 用高科技实验手段控制和干预动物特定的基因组份及其表达,使其表现某种特定的遗传性状的动物称为转基因动物。糖尿病的发生与基因因素相关,转基因糖尿病模型是通过基因的转入,敲除、打靶技术等方法使动物的基因发生改变,诱导糖尿病的发生。此种模型更符合糖尿病的发病机制 ,科学性较高,但技术复杂,国内应用较少。 微血管一般指微小动脉和微小静脉之间的管腔直径在 100 微米以下的毛细血管网,是血液和组织细胞之间进行物质交换的场所,主要作用是维持机体的新陈代谢。近年来研究证明糖尿病患者存在不同程度的微血管病变。糖尿病微血管病变( 糖尿病的一种基础病变,是造成器官损害的基础,可发生在全身各个组织的微血管,引起各种糖尿病慢性并发症,严重影响患者的生活质量。目前研究比较多的糖尿病微血管病变主要包括 ;糖尿病性 视网膜病变、糖尿病性肾病、糖尿病性神经系统病变和糖尿病足,关于糖尿病胃部微血管病变的研究不多,本实验通过胃窦组织免疫组化的方法观察糖尿病时胃组织微血管形态和数目的改变,讨论其与胃排空之间的关系。 糖尿病微血管病变的病理基础是微血管功能和结构改变,糖尿病时微血管内皮损伤,血管基底膜增厚,血管形态改变形成微血管瘤;血液黏稠度增高,红细胞聚集,血小板粘附、聚集,致微血栓形成;血管壁粗糙,管腔狭窄,甚至完全闭塞。这些病理性改变均可引起微循环障碍,导致组织的缺血、缺氧,再加上一些血管活性物质的作用,导致微血管的广泛损 害,最终导致并发症的发生 62。 糖尿病微血管病变的发生机制 目前 仍然不清楚,可能与以下机制相关:( 1)糖尿病葡萄糖代谢障碍,多元醇通路激活激活 ,使细胞内山梨醇、果糖过度堆积,细胞渗透性水肿,导致内皮细胞受损,血管通透性增加,造成微血管损害;( 2)过度的氧化应激进一步加重血管损害;( 3)糖基化终末产物在细胞内的聚集,使血管弹性下降,血管壁增厚,管腔狭窄,同时它还可以抑制一氧化氮( 生物活性,进一步加重氧化应激对血管的损害;( 4)蛋白激酶 C 信号通路的激活,促进血小板聚集,提高血液黏稠度,促使微血管病变的 发生;( 5)血流动力学的异常 63。 另外 4和 5的研究表明长期的糖尿病可以引起骨髓产生的血管内皮祖细胞数目减少,功能下降,直接影响血管的修复和新生血管的形成,一氧化氮( 性的降低,过度的氧化兰州大学硕士研究生学位论文 糖尿病胃血管变化、胃平滑肌收缩功能与胃动力变化的关系 10 应激,促炎性因子产生的增加进一步加重了血管损害,这可能是引起糖尿病微血管病变的原因。 兰州大学硕士研究生学位论文 糖尿病胃血管变化、胃平滑肌收缩功能与胃动力变化的关系 11 实验目的 糖尿病是一种常见的内分泌疾病,通过影响糖、蛋白质及脂 肪的代谢引起一系列病理生理改变,对多个器官造成损伤,致使多脏 器 并发症 的发生 ,是糖尿病死亡的主要原因。近年来,随着人们生活水平的提高,对生活质量有了更高层的要求,糖尿病胃动力障碍虽然不是糖尿病死亡的主要原因,但发病率 较高,严重影响了患者的生活质量,造成巨大的社会经济负担, 其发病机制仍不清楚, 糖尿病胃动力障碍发病机制的研究已成为重中之重的问题 。目前认为自主神经病变、高血糖、胃肠激素分泌紊乱和微血管病变可能是造成胃动力障碍的主要原因 7,66,67。本实验旨在通过建立糖尿病大鼠模型,研究在糖尿病的不同阶段,大鼠胃排空与胃窦平滑肌收缩功能和胃血管病变之间的关系。 兰州大学硕士研究生学位论文 糖尿病胃血管变化、胃平滑肌收缩功能与胃动力变化的关系 12 材料和方法 实验动物 雄性 鼠 50 只,体重 180 200g,甘肃省中医学院实验动物中心提供。饲养于甘肃中医学院 实验室,实验室温度 20 25,相对湿度 40%昼夜交替时间 10/14h。自由进食饮水。 实验试剂 链脲佐菌素 ( 国 司 ); 免疫组化试剂盒 ( 武汉博士德公司 ); 色剂 ( 北京中山公司 ); 液 ( 福建麦新公司 ); 虹吸式血糖仪及试纸(北京饴糖) ; 同位素锝 99海欣科公司); 的配置,尽量使溶液的各离子浓度、渗透压、 实验标本外坏境相接近。 冲液的成分( ) :在稀释后加入,以免发生沉淀,不溶解,影响溶液的离子浓度。 应现配现用,溶液配好后给予 95%的 5%的 持溶液的 0。 实验仪器 20 生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司); 体组织器官恒温灌流系统(成都泰盟科技有限公司); 针孔型单光子发射计算机断层照相仪( 色列 微镜 (日本 台式恒温隔水培养箱(上海跃进); 媒体图像分析仪(美国 司); 尿病大鼠模型的制备 0 只,适应性喂养 1周后, 随机分为正常对照组( n=20)兰州大学硕士研究生学位论文 糖尿病胃血管变化、胃平滑肌收缩功能与胃动力变化的关系 13 和实验组( n=30)。实验组给予用柠檬酸缓冲液稀释的 1%的 下腹腔注射,剂量为 55g;正常对照组给予相同剂量的柠檬酸溶液。给药后 72h 及 1随机血糖 且伴有多饮、多食、多尿、体重减轻为建模标准。造模成功 28 只,后因高血糖死亡 2 只。造模成功后不给于任何降糖药控制血糖,自由饮食和饮水,每周测血糖和体重。造模后 4 周时,对实验动物进行再次分组,分组如下: A 组为造模后 4 周糖尿病模型组( n=13),B 组为 4 周正常对照组( n=10), C 组为造模后 24 周糖 尿病模型组( n=13), 4 周正常对照组( n=10)。 胃排空的测定 核素显像法是在生理状态下进行的,核素在胃内的运行与食物的运动过程一致,干扰因素较少能够定量的分析固体、液体在胃底、胃窦及全胃的排空 情况 ,还能观察胃内的食物分布,对疾病的临床诊断有重要的意义,是胃排空测定的金标准。 分别于造模 后 第 4 4 w,用单光 子发射断层显像技术 ( 定大鼠胃排空情况。检测前大鼠禁食 24小时, 不禁水。应用含 同位素锝 99记的半固体食物 1 1 0.5 胃,将大鼠仰卧位固定于固定板上,以大鼠腹部为目标区(窗宽 20%,阵距 128*128,放大倍数 进行放射活性采集,前半小时每 5半个小时每 10采集 9次,持续 60过计算机软件计算出胃半排空时间及排空速率的校正值,绘制胃排空曲线。 胃窦平滑肌收缩功能的测定 实验前大鼠禁食 24小时,不禁水,颈椎脱臼法处死大鼠,迅速取出大鼠的 胃,沿胃大弯侧剪开,在 胃粘膜面朝上将胃固定在含有 持续供给含 95%的 %的 剪刀轻轻刮去胃黏膜层,在胃窦部沿胃环行肌纤维走向切取胃窦平滑肌肌条( 8 2 68。肌条两端分别放置固定针,将肌条固定在恒温灌流槽中(灌流槽中含有 持续给予 95%流槽外通予 37的恒温水),与电生理传感装置相连。肌条给予 1 20 肌条自发性收缩平稳后 再持续记录 1 h。 取样及病理 将制作平滑肌肌条后剩余的胃窦组织固定在泡沫板上,浸泡在 10%的中性甲兰州大学硕士研究生学位论文 糖尿病胃血管变化、胃平滑肌收缩功能与胃动力变化的关系 14 醛溶液中,于 10.4 2 石蜡包埋,组织标本连续 3 60恒温烤箱内烘烤 1小时,取出切片,备用。 疫组化 切片脱蜡、柠檬酸高温修复、滴加一抗、二抗, 木素复染,脱水,透明,封片。每组均用 倍镜下观察胃黏膜组织 用 免疫组化染色具体步骤如下: ( 1)用二甲苯、酒精梯度脱蜡至水;( 2) 分钟;( 3)高温柠檬酸修复 5( 4) 3%的过氧化氢 5 5) 次;( 6)山羊血清工作液室温下孵育 20 7)加 :150)过夜,第二日取出后在 37恒温箱内孵育 1h;( 8) 次;( 9)生物素化二抗工作液 37恒温箱内孵育 30次;( 10)加入辣根酶标记链霉卵白素工作液 37恒温箱内孵育 30次;( 11) 木素复染,盐酸酒精分化,自来水冲洗反蓝;( 12)脱水,透明,封片。 本实验用 体步骤如下:( 1)常规切片脱蜡至水;( 2)滴加 来水冲洗;( 3)滴加磷钼酸作用5干;( 4)滴加苯胺蓝 5来水冲洗;( 5)分化液分化,共 2次,每次 30 6)脱水,透明,封片。 计学数据分析 采用 组数据用 x 组间均数比较采用单因素方差分析, P 兰州大学硕士研究生学位论文 糖尿病胃血管变化、胃平滑肌收缩功能与胃动力变化的关系 15 实验结果 造模前各组大鼠精神状况良好,活动自如,皮毛光滑而富有光泽,活泼好动,体重持续增加,饮食及尿量正常。造模后,对照组大鼠无明显改变,饮食及尿量正常,体重持续增加;造模组大鼠,造模后即出现精神萎靡不振,自主活动减少,1天后精神有所好转,出现多饮、多食、多尿等症状,此后随着时间的延长,与正常组相比,造模组大鼠精神萎靡,少数出现烦躁不安,多食而体重不增或者 体重下降,体质明显减弱,活动迟缓、不太不稳等症状日益加重,毛发疏松而发黄、干枯,无光泽,甚至出现大鼠死亡。 各组大鼠胃排空曲线图 尿病 4周模型组) 兰州大学硕士研究生学位论文 糖尿病胃血管变化、胃平滑肌收缩功能与胃动力变化的关系 16 4周对照组) 兰州大学硕士研究生学位论文 糖尿病胃血管变化、胃平滑肌收缩功能与胃动力变化的关系 17 尿病 24周模型组) 兰州大学硕士研究生学位论文 糖尿病胃血管变化、胃平滑肌收缩功能与胃动力变化的关系 18 24周对照组) 组之间, 组之间, 组之间在胃半排空时间、排空速率均存在显著差异( P 组之间无显著差异( P=由上述结果可知 24周糖尿病组胃排空明显减慢, 4周糖尿病组胃排空明 显加快。在糖尿病进程中,胃排空呈现先加快后减慢的变化趋势。(表 1) 表 1 大鼠胃排空情况( x s) 组 别 n 胃半排空时间 胃排空速率 胃残留率 ( ( % ( 55 A 组 13 B 组 10 组 13 D 组 10 期组间比较: *表示 P 糖尿病组间比较:表示 P 兰州大学硕士研究生学位论文 糖尿病胃血管变化、胃平滑肌收缩功能与胃动力变化的关系 19 各组大鼠胃排空曲线 由上图可知,在各个时间 点早期糖尿病大鼠胃排空均加快,而 晚期 糖尿病大鼠在进食 15始 减慢。 随着糖尿病时间的延长,平滑肌条的收缩振幅和频率逐渐下降。 组相比收缩频率、振幅均降低,但 P=有统计意义; 组比收缩频率和振幅均下降,差异有统计学意义( P 组比收缩频率和振幅均降低, 有统计学意义 ( P ; 组之间无显著差异。由实验结果可知 24周 糖 尿病组 大鼠 胃窦环形肌的收缩频率和振幅均明显下降, 胃窦的收缩功能减弱 。(表 2) 表 2 大鼠胃平滑肌自发性收缩情况 组 别 n 收缩频率(次 /分) 收缩振幅( A 组 13 B 组 10 组 13 D 组 10 期组间比较: *表示 P 糖尿病组间比较:表示 P州大学硕士研究生学位论文 糖尿病胃血管变化、胃平滑肌收缩功能与胃动力变化的关系 20 镜下 色 对照组切片组织结构清楚,粘膜下小血管走形清楚,管腔规则,管壁光滑,血管 分布均匀, 未见管腔扩张或狭窄,内膜光滑 ,未见细胞空泡或肿胀。 24 粘膜下血管迂曲,分布不均匀,管径大小不一,管腔变窄或扩张, 部分血管 闭塞,内膜不完整,内皮细胞肿胀脱落,出现空泡样变 性 ,基底膜增厚,密度不均匀,结构模糊,间质中有炎性细胞浸润。 4周模型组未见明显变化。 色显示 4周模型组可见粘膜下及肌层血管管壁基底膜增厚,轻度纤维化,内膜完整,管径管腔比值无明显变化; 24周模型组粘胃膜下及肌层血管,可见内皮细胞脱落,内膜损伤,管壁增厚,管壁间胶原纤维增生,胶原蛋白交联增多,管腔变窄,管径管腔比值明显增加。说明在糖尿病早期胃黏膜下小 血管无明显变化,糖尿病晚期发生管壁增厚,管腔狭窄,影响胃组织的供血。 疫组化染色微血管密度计数 一种高度糖基化的跨膜蛋白, 在血管内皮细胞表达,具有高度的特异性和稳定性,目前监测微血管的可靠标记 69。在显微镜下, 血管内皮细胞呈现棕黄色染色, 凡是染成棕黄色的单个内皮细胞,或细胞簇作为一个血管计数,管腔超过 8个红细胞大小、带有较厚的肌层的血管或血管区域均不计数在内。高倍镜下观察 测胃组织微血管密度。 像分析 选测 染色良好的片子,应用 定 腔比值。 组相比,微血管数目明显增加,有统计学意义( P 组相比,微血管数目明显减少,有统计学意义( P 组比较无显著差异。(表 3,图 1)在 4周模型组微血管数明显增加, 24周模型组微血管数明显降低。说明在糖尿病早期微血管代偿性增加,随着病程的延长,微血管数逐渐减少。 兰州大学硕士研究生学位论文 糖尿病胃血管变化、胃平滑肌收缩功能与胃动力变化的关系 21 表 3 大鼠胃血管变化情况 组 别 n %) 管径管腔 A 组 13 B 组 10 组 13 D 组 10 期组间比较: *表示 P 糖尿病组间比较: 表示 P 1 大鼠胃组织 200) ( 4周糖尿病模型组) ( 4周正常对照组) ( 24周糖尿病模型组) ( 24周正常对照组) 注:图中棕黄色区域为 表血管内皮细胞。 兰州大学硕士研究生学位论文 糖尿病胃血管变化、胃平滑肌收缩功能与胃动力变化的关系 22 讨 论 糖尿病胃轻瘫是一种典型的糖尿病胃动力障碍,以无明显原因的胃排空延迟为特征。主要表现为恶心、呕吐、腹胀、进食后早饱感以及腹部不 适等临床症状,由于其症状与胃排空之间的相关性较低,临床上不易诊断,因此其准确的发病率仍然不清楚 70但有研究显示,糖尿病是胃轻瘫的危险因素, 1 型糖尿病患者胃轻瘫的发病率是正常人的 30 倍, 2 型糖尿病患者胃轻瘫的发病率是正常人的 8 倍, 引起这种现象的原因仍然不清楚。 本实验应用大剂量链脲佐菌素( 腔注射制造 1 型糖尿病模型与以往同期 2 型糖尿病大鼠模型相比,胃半排空时间及速率未见明显差异。而在早期和晚期糖尿病模型之间差异明显,我们认为糖尿病胃轻瘫的发生与糖尿病的持续时间相关。徐洪军等的研究也证实了该观 点 17。 目前认为造成糖尿病胃动力障碍的主要原因是自主神经病变、 血糖、胃肠激素分泌紊乱、平滑肌病变和微血管病变等 7,66,67。其中对糖尿病单纯胃平滑肌收缩功能的研究不多,大多是通过 电活动等间接的研究方法来反应胃平滑肌的收缩功能。而对糖尿病血管病变的研究主要局限在心血管,脑血管,肾脏、视网膜及皮肤微血管病变 42,43 ,对胃血管病变研究较少。本实验通过离体胃平滑肌条和免疫组化的方法测定胃平滑肌的收缩功能和胃血管变化情况,探讨其与胃排空之间的关系。 胃慢波来源于近端胃体的纵行肌和环形肌之间的肌间神经丛,向胃窦部传播。 质细胞是一种胃肠起搏细胞,能够调控胃肠自主节律,参与胃肠道慢波的产生和传播 73。 质细胞广泛分布于胃体、胃窦和幽门的纵行肌和环形肌之间的肌间神经丛中 74,具有介导神经信号传递的作用。肠神经系统中的神经元通过突触小体与 质细胞连接,把神经信号传导至 胞,再作用于胃肠道平滑肌细胞 75。周吕 76等的研究通过观察大鼠胃体上 1/3 起搏区以及胃窦环形肌的收缩活动,研究 胞在平滑肌收缩中的作用, 显示在择性损伤后,胃体的起搏和平滑肌的收缩活动几乎完全消失,证明 涛 77等的研究发现,糖尿病大鼠离体胃平滑肌肌条的收缩振幅和频率较正常对照组降低,胃窦部 布稀疏,数量明显减少,形态学发生改变,出现细胞空泡。认为,糖尿病时 8等的研究证实长期的糖尿病引起胃肠道 质细胞退行性改变,数量减少,分布异常。 9,80等的研究发现随着 胞的退行性变,出现平滑肌萎缩,进一步证实了 平滑肌细胞的作用,提示肌肉病

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