【毕业学位论文】（Word原稿）密码子优化的猪瘟病毒E2基因DNA疫苗的构建及其免疫效力评价预防兽医学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 密码子优化的猪瘟病毒 构建及 其免疫效力评价 of NA 2 of NA 2 国农业科学院 硕 士学位论文 第二章 摘 要 猪瘟病毒（ 膜 糖 蛋白是猪瘟病毒的主要结构蛋白之一 ，是猪瘟病毒中和抗体的主要 靶标 ，是抗猪瘟 病毒感染 的主要保护性抗原 ， 因此，猪瘟病毒 白是开发猪瘟新型疫苗 、 诊断试剂 及研究猪瘟病毒致病机理的重要 靶 蛋白。 本研究在不改变编码氨基酸序列的前提下，将猪瘟病毒 石门 株 因进行密码子优化，将其 列优化成 G、 C 含量较高的哺乳动物细胞 偏 嗜性序列。将人工合成的密码子优化的 全长 因和去掉跨膜区的 因分别克隆到真核表达载体 )中 ，构建成 重组质粒 体外 瞬时 表达试验 证实 ， 目的基因 可以在 转染的 293T 细胞 中得到 表达 。 将纯化后 重组 质粒 生型 未经过密码子优化 ） 的真核表达 质粒 00g/只 的剂量免疫 家 兔 三 次，每次间隔 3w，三免后 均 抗体 阻断率 达到 用 猪瘟兔化弱毒攻毒 后 平均 抗体 阻断率 升高到 体温有一过性升高 ；而 经三次免疫后均无明显 抗体升高 （抗体阻断率低于 30%） ，仅在攻毒后抗体水平有所升高 。 研究结果表明，密码子优化 且 不含跨膜区的猪瘟 病毒 因 苗 疫效果明显 ， 而同样经过密码子优化 全长 因 的 苗 未经密码子优化 的 苗 家兔体内 未 能 诱 导可检测 的 免疫应答。本研究 探讨 了通过对猪瘟病毒 因序列进行密码子优化来开发新型猪瘟核酸疫苗的可行性，以及跨膜区对 因 苗免疫效果的影响。 关键词 ：猪瘟；猪瘟病毒； 因；密码子优化；核酸疫苗 he 2 is of It is in of In we 2 by 2 2 2 ), In 2 be 93T as by To of NA as we at a 32 NA in n = 5), to in n = 5). We it is to a on 2 MR in of NA E2 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 瘟 病毒性腹泻 羊边界病 瘟病毒 病毒性腹泻病毒 羊边界病病毒 膜 区 道尔顿 联免疫吸附试验 氧核糖核酸 糖核酸 苄青霉素 补脱氧核糖核酸 PK 猪肾细胞 B 液体培养基 乙二醇 酸盐缓冲溶液 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 目 录 第一章 绪 论 . 1 瘟与猪瘟病毒概述 . 1 瘟的流行情况 . 1 瘟病毒 . 2 瘟病毒的 基因组结构 . 2 瘟病毒的主要保护性抗原 . 3 瘟疫苗的研究进展 . 4 规疫苗 . 4 单位疫苗 . 5 载体重组疫苗 . 6 记疫苗 . 7 苗 . 7 苗的研究现状 . 7 研究的背景与目的 . 13 第二章 2 基因 密码子优化和真核表达 质粒 的构建 . 15 料与方法 . 15 株、菌株与质粒 . 15 具酶及试剂 . 15 要实验仪器 . 15 码子优化与序列合成 . 16 达载体的构建与鉴定 . 16 粒的大量提取与纯化 . 19 核表达载体的细胞表达试验 . 20 果 . 20 码子优化的 因合成片段正确插入表达载体中 . 20 核表达载体可以在细胞内表达可被特异性抗体识别的目的蛋白 . 212 论 . 22 第三章 密码子优化 的 因 苗动物免疫试验 . 23 料与方法 . 23 实验动物及 重组质粒 . 23 接种物 配制 . 23 动物免疫 . 24 家 兔免疫后和攻毒后的指标评价 . 24 果 . 24 疫及攻毒后各组实验 兔 抗体变化情况 . 24 毒后各组实验 兔 体温变化情况 . 26 论 . 27 第四章 结 论 . 28 参考文献 . 33 致 谢 . 35 作者简历 . 36 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪 论 瘟 与猪瘟病毒 概述 猪瘟（ 由猪瘟病毒（ 起的猪的高度接触性传染病， 以出血和发热为主要特征，呈急性 、亚急性 或慢性经过（ et 1991） 。 目前广泛 用 替 ，以 与 型肝炎病毒） 和 非洲猪瘟 病毒 ）相区别。 有记录的 猪瘟最早于 1830年在美国俄亥俄州发生，随后瑞典、丹麦、意大利、匈牙利、南美和南非等国先后报道了猪瘟。我国何时确诊猪瘟尚无明确记载，大约 1925年东南大学农科系开始研制免疫血清以防制猪瘟。世界动物卫生组织（ 将猪瘟 列 入 为 须申报 的 （ 物传染病 。在我国的家畜家禽防疫条例实施细则中猪瘟也被列为一类传染病。 我国猪只的年饲养量接近 10亿头，猪瘟每年给我国造成的经济损失近 100亿，对我国养猪业的危害极其严重。 猪瘟的流行情况 根据目前各大洲和地区猪的饲养量、猪与猪肉制品的国际贸易量以及该病的流行程度，可将猪瘟分为三大流行区： （ 1） 东南亚属老疫区，由于控制措施不力，疫情仍然较重； （ 2） 中南美洲属疫情稳定区，疫病流行逐年减少； （ 3） 欧洲特别是西欧属流行活跃区，即使采取了严密的控制措施，仍经常爆发疫情，是近年 来猪瘟流行的中心。由于该地区养猪业发达，是世界猪与猪肉制品的主要输出地，因此该地区猪瘟爆发对全球该病流行有重要影响。 猪瘟是我国四大动物疫病之一，至今已流行 70多年。 1954年我国兽药监察所方世杰等选育了一株适应家兔后对猪基本无毒力，但却保持良好免疫原性的弱毒疫苗株 我国兔化弱毒疫苗株，国外称为 具有免疫力强，保护率高且持久，遗传稳定、无残余毒力等优点，是国际上公认的效果最好的猪瘟弱毒疫苗，不仅为我国，还为欧洲国家猪瘟控制作出了重大贡献。以此疫苗免疫为基础，我国于 1956年提出了消灭猪瘟的规划，但是 至今猪瘟仍在我国不间断地流行。当前我国猪瘟的流行病学与临床特点是： （ 1） 流行范围广：从每个省市自治区收集的病料中均检测出了猪瘟病毒，说明全国范围内均有猪瘟流行。 （ 2） 散发流行：近年猪瘟在我国没有大规模爆发流行，而呈散发流行趋势。但这种散发流行见于全国各地，加上我国巨大的饲养量，所以猪瘟造成的直接经济损失仍然十分严重。 （ 3） 发病年龄小，成年猪带毒现象严重：目前猪瘟多发生于新生仔 猪 ， 且 发病日龄日趋偏小，发病多见于 3月龄以下，特别是断奶前后和出生 10日龄以内的仔猪。 （ 4） 非典型症状和繁殖障碍型猪瘟增多：非典型猪瘟 增多 ， 临床症状与中国农业科学院硕士学 位论文 第一章 绪论 2 病理变化不典型，必须依赖实验室诊断才能确诊，发病率与死亡率显著降低，病程明显延长；临床上猪瘟病毒持续性感染 （ 亚临床感染 ） 和隐性感染增多，妊娠母猪带毒综合症 （ 繁殖障碍型猪瘟 ） 病例突出，初生仔猪的先天感染比较普遍，这种类型的感染种猪往往外表健康，所以是引起猪瘟流行最危险的传染源，应当及时坚决淘汰。 （ 5） 免疫失败现象严重：养猪场十分重视猪瘟的免疫注射， 80%以上猪群均注射过兔化弱毒疫苗，但免疫注射猪群的免疫力低下却普遍存在。 瘟病毒 猪瘟病毒为单股正链 有囊膜。完整病毒颗粒 呈球形，直径约 4050衣壳二十 面体对称，直径为 29膜表面伸展出许多长 68随 梯度介质和培养机制不同，病毒的浮密度从 降系数为 140有单股 et 2000）。猪瘟病毒按传统分类方法属于披膜病毒科（ 病毒属（ 近几年来，随着对该病毒分子生物学研究的不断深入，证明了 制类型以及表达方式和黄病毒极为相似，因此猪瘟病 毒便于 1991年被列入黄病毒科（ 病毒属 （ （ et 1992）。这个属的成员还有在抗原性和结构上与 型 （ ，、 牛病毒性腹泻病毒 2型 （ ， 、 绵羊边界 病 病毒（ 和长颈鹿瘟病毒（ of 。 猪瘟病毒基因组结构与功能 约 et 1996； et 1996；et 1996）， 5端无帽子结构， 3端也没有多聚腺苷酸 （ ） 尾。含有一个大的开放性读码框 （ ，由其编码一条约 3898个氨基酸的多聚蛋白，在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下，多聚蛋白在翻译和翻译后加工过程中形成 12种成熟的病毒蛋白，在聚蛋白上从 端的顺序依次为 ： C、 中 C、 et 1989；et 1990） 。 编码 端三分之一部分，包括 和 3种囊膜 糖 蛋白 （ 8）、 和 。 种非结构蛋白（ ， 除 码其他非结构蛋白的序列定位于 端三分之二部分 （ et 1996； 1996） 。大多数非结构蛋白的功能目前还不是很清楚。猪瘟病毒基因组非编码区在病毒基因组复制和多聚蛋白翻译过程中起着重要的作用，是病毒基因组 5et 1990； et 1995； et 1994），中国农业科学院硕士学 位论文 第一章 绪论 3 而 3重要调控区，可能含有起始基因组 强子等顺式作用元件。 通过测定 种结构糖蛋白的 定 端分别位于氨基酸残基 构蛋白的加工是由宿主细胞的信号酶介导的，蛋白酶首先在核衣壳蛋白 后在 端切开，最后 2。在 1，最后这三种囊膜糖蛋白通过分子内或分子间二硫键形成复合物 （ et 1998） 。 ，存在一段 17个核 苷 酸的互补序列，在 5 30 5边界位于核苷酸 2866些核苷酸形成一个茎环结构 （ 发卡 B） ，该结构可能对于 et 997） 。 主要保护性抗原 码 1个大的多聚蛋白，此多聚蛋白经病毒和宿主细胞酶的作 用，形成 4个成熟的结构蛋白，即衣壳蛋白 外还包括 8个非结构蛋白。其中 结构蛋白2是 能诱导产生猪瘟中和抗体使免疫猪抵抗致死剂量 前公认 2是 最主要的保护性抗原，产生 有 下面将分别详细介绍 2这两个 在病毒粒子中， 子量约 100相应单体由 227个氨基酸组成，分子量为 4448一种尚不清楚的机制与囊膜相连，感染 et 1993） 。 获得对 由于编码 2 的序列保守程度高 ， 因而 有 于细胞外 体外免疫抑制试验中， 诱导的猪、牛、羊和人的淋巴细胞增殖，而且还能强烈抑制不同种属动 物淋巴细胞的蛋白质合成，并不破坏其细胞膜，表明 于 此 et 1997） 。 1999） 通过定点突变技术替换或缺失了 或 得到的 中所有 那些仅 持续出现几天临床症状后 ，即迅速恢复 （ et 1999） 。 5060为最适温度，其最适 其它 其强的抑制剂。 称为 在猪瘟病毒多聚蛋白上的位置始于氨基酸残基 690，终止于氨基酸残基 1060，长约 370个氨基酸。在靠近 端上游有一段信号肽中国农业科学院硕士学 位论文 第一章 绪论 4 序列，在其 基酸残基 10321048之间有一亲水 序列。利用单抗竞争结合和抗原捕捉实验对 个抗原区，即 AD，所有这 4个区均位于 端氨基酸残基 690866之间，而 661007之间的部分都不是其抗原表位必须的，不参与这些表位构像的形成，因此氨基酸残基 690866的部分似乎是 et 1989） 。在 基酸残基 995998位的 一表位在瘟病毒属的三个不同成员中是高度保守的 。 2000） 通过缺失分析确定了 在 29837之间，并且这一序列在 在 为设计含有该表位的肽并将其应用在 时还确定了能与 2抗原区域，该抗原区域位于端 23个氨基酸残基内 （ 氨基酸残基 690812） ，这一区域能消除或减少同其它瘟病毒的交叉反应，这样就能够用在 et 2000）。 和抗体直接和 近的研究表明 ， 2糖蛋白是猪瘟病毒对猪的毒力相关基因 （ et 2005）， 研究人员为了研究 2基因在猪瘟病毒致病性中的作用 ， 将 弱毒 ） 的 强毒 ） 的 结果发现嵌合的 表现为扁桃体病毒毒价大大减少 、 一过性病毒血症等 ； 嵌合的 瘟疫苗的研究进展 由于猪瘟 对养猪业危害巨大，人类始终在努力与之抗争。我国于 20世纪中期开始研制出了猪瘟灭活苗，随后很快又研制成功免疫效果更好的猪瘟弱毒疫苗。这两种常规疫苗始终在的猪瘟控制与预防过程中做出巨大贡献。随着猪瘟病毒分子生物学和分子免疫学研究的不断深入，人们对猪瘟新型疫苗的研究也日益兴起，新型疫苗层出不穷。但是由于猪瘟感染猪群和免疫猪群在血清学检测上难以区别，因而对猪瘟新型疫苗研制也提出了更高的要求。近年来继重组体疫苗、亚单位疫苗之后又研制出了重组体标记疫苗、亚单位标记疫苗等，使这一问题得到了一定的解决。与此同时，为了开发既 有很高的免疫原性又没有病毒残留的新型疫苗，很多学者在猪瘟核酸疫苗的研究与开发方面进行了大量研究并取得一定进展。 常规疫苗 20世纪 40灭活结晶紫疫苗为代表。该疫苗在早期猪瘟预防控制中曾起到了积极作用，但该类疫苗存在免疫期短、保护力低等不足，以及 今该类疫苗多用于紧急情况的预防接种工作。 弱毒疫苗较灭活疫苗具有产生免疫快，持久等特点。猪瘟弱毒疫苗的研制成功很快改变了中国农业科学院硕士学 位论文 第一章 绪论 5 猪瘟的免疫状况，是当前猪瘟预防控制中主要应用的疫苗。目前全世界公认的安全、稳定和免疫原性强的弱毒疫苗株有三大品系：中国“ 54又称“ 兔化弱毒疫苗、日本 变异毒株。其中猪瘟兔化弱毒疫苗是 1954年 由我国周 泰 冲等将石门系猪瘟病毒适应家兔后，选育的一株对猪基本无毒力但仍保持 世界公认的免疫原性和安全性最好的疫苗株，为我国和世界许多国家猪瘟防制作出了巨大贡献。但是在该毒株适应各种不同的原代和传代细胞过程中，逐渐出现疫苗毒毒力 增强，这可能是导致温和性和非典型猪瘟病例一个原因。此外，常规弱毒疫苗和野毒感染在现地猪场中难于鉴别。因此，新型猪瘟疫苗的研制迫在眉睫，现在世界一些发达国家已禁止使用弱毒疫苗的国家进口猪及猪肉制品。 亚单位疫苗 猪瘟 亚单位疫苗 就是 采用真核细胞高效表达系统表达 2，并以其表达产物为抗原制造疫苗。目前已有猪瘟亚单位疫苗成功的报道，如 2基因插入核型多角体病毒后在 成 生的 结果表明 ，按 32g/头水包油型 3 保护率可达 100%。 痘苗病毒和杆状病毒也在研究中被采用，尤以杆状病毒一昆虫表达系统以其表达外源蛋白水平高，蛋白接近天然蛋白等优点而受到研究者青睐。目前，以 试动物安全等方面表现了常规弱毒疫苗不可比拟的优点。猪瘟亚单位疫苗的研制为猪瘟的免疫预防提供新手段和思路。 活载体重组疫苗 活载体重组疫苗 是 以无致病力或低毒力 的痘苗病毒 （ 和伪狂犬病病毒 （ 为载体，将 2基因与之重组而成的猪瘟活载体疫苗，对猪瘟的再次感染具有良好的预防作用。以痘苗病毒为载体， 得了能抵御猪瘟病毒强毒，攻击重组疫苗。该试验同时证实若疫苗含有完整 蛋白基因的存在与否同动物产生抗体滴度高低无关。 株感染性全长 强毒株 2基因，构建了猪瘟杂交病毒，试验证明该重组病毒具有良好免疫原性和安全性。在 引起动物产生的中和效力最强，所以 时余兴龙等研究证实 不含 跨膜区 有 信号肽 的 于猪瘟强毒攻击保护率最高。在活载体疫苗研究中，好的载体系统对外源基因表达具有重要作用。 毒疫苗为载体，插入 1991）则以痘苗病毒为载体，插入 人分别由此构建了重组病毒疫苗，动物接种试验表明，二者均能完全保护猪对同源毒株的攻击。 国内 也有 一些研究者尝试用伪狂犬病毒作为载体来研制猪瘟病毒活载体疫苗。 中国农业科学院硕士学 位论文 第一章 绪论 6 长感染性 记疫苗 长感染性 记疫苗被认为是猪瘟疫苗可能发展的一个主要方向。该类疫苗的研究是将带有选择性标记的基因克隆到 毒株的全长 ，因此可以区分疫苗和野毒感染，另外还可以为建立相应的诊断方法。目前，已经构建了猪瘟病毒不同毒株的感染性隆，预期获得一个生物性状稳定、免疫原性好的毒株，用于免疫预防。 选择了与 清学几乎无交叉反应的 的 5250 株与 C 株 行嵌合构建了两株嵌合病毒 C 株 2 基因 5端的一半被 5250 株相同区域取代 ；在 因被 5250 相应区域取代。由于 乏 因中产生中和抗体的主要亚结构域 ， 因此不会诱导抗 2 特异抗体。同样 ， 没有 因 ， 也不会诱导抗 异抗体。由此可分别用 2 法进行检测来区别免疫猪群和感染猪群。这两株重组体标记疫苗经过猪体试验后的结果表明 ， w 后均可提供临床保护。 一步通过免疫分组试验证实了这一点。 不论怎样设计重组体疫苗 ， 它都不可避免地存在着与疫苗株或野毒株之间发生异源重组 ，或者在有 在感染的情况下与 间发生同源重组 ， 或者与细胞基因组发生整合等种种危险。这些问题的存在都会使重组体疫苗的应用受到一定的限制。 位疫苗 早在 18世纪 80年代，表位疫苗（ 略已经被用于开发抗病毒、细菌或寄生虫病的候选疫苗。通过化学连接到载体蛋白上，携带靶表位的合成表位就能激发表位特异性的中和抗体和有效的保护。 所以在免疫动物体内不存在病原分子，另外，免疫后不久 而， et 1993； et 1994； et 2000； et 2002； et 2005）。这样目前用于诊断的单克隆抗体就能从表位免疫的猪中鉴别出感染猪。 为 核、真核 细胞 或病毒），在标准的制作条件下很容易 获得。 表位疫苗长期以来没有用于开发 标记疫苗，主要是因为研究者还没有鉴别出 et 2007） 。为了定位中和表位， 设计了 5个重叠覆盖 原区 表位，构建了多表位疫苗（ 疫两次后， 疫猪获得了完全保护（ et 2002）。但由于 用的 弗 氏佐剂成本太高不适于现地使用，又开发了铝佐剂的 得到了同样的实验结果（ et 2005）。这些结果说明多表位疫苗是一个有效的标记疫苗策略而且在 N 末端存在连续的中和表位。 和 A 区的单表位疫苗（ n=1n=1动物实验表明， 其它四个表位疫苗显示了较好的免疫力，而 提供了最好的保护力（ et 2006a， 2006b）。中国农业科学院硕士学 位论文 第一章 绪论 7 （ 2006）发现重组融合 白 M 表位： 免疫猪提供了对致死性攻毒的不完全保护，这个结果和 2006b）的 发现相符：表位疫苗 导了抗 免疫 应答 但却不能 提供 完全保护 ， 而融合 白的 表位疫苗单表位疫苗 M 表位： 兔和猪都提供了更有效的保护（ et 006）。这也