【毕业学位论文】（Word原稿）CIK细胞对顺铂预处理的非霍奇金淋巴瘤细胞株的杀伤效应

兰州大学硕士学位论文 胞对顺铂预处理的非霍奇金淋巴瘤细胞株 的 杀伤效应 1 前 言 淋巴瘤（ 源于淋巴结和淋巴组织，其发生大多与免疫应答过程中淋巴细胞增殖分化产生的某种免疫细胞恶变有关，是免疫系统的恶性肿瘤。按组织病理学改变，淋巴瘤可分为霍奇金淋巴瘤（ 非霍奇金淋巴瘤 (大类。淋巴瘤是最早发现的血液系统恶性肿瘤之一 。 1832年 告了一种淋巴结肿大合并脾大的疾病， 33年后 （ 名此种疾病。 1898年发现 胞，明确了霍奇金淋巴瘤（ 病理组织学特点。现在将此种疾病称之为非霍奇金淋巴瘤 (在西方国家，淋巴瘤发病率占整个癌性肿瘤的第8位，在我国 占恶性肿瘤的第 9位 （ 男性 ） 和第 11位 （ 女性 ） 。淋巴瘤的发病率占恶性肿瘤发病率的 近二十年来 发病率每年以 比率上升。每年我国新发病例为 2万左右。非霍奇金淋巴瘤 （ 有逐年增多的趋势，日益危害着人类的健康。如何治疗和提高治疗效果成为临床医务工作者的研究关键。 1955年以来，美国和国际肿瘤的研究中心 在研究动 物体内的肿瘤基因遗传机制时 ，先后发现近万种化合物有抗肿瘤作用。这些化合物 多数在体内不具有活性，但铂化合物约 18%在体内具有活性 。 1969年，美国 B. V. 表了 顺铂）具有广泛的抗 肿瘤的作用，能抑制和完全治愈一系列动物体内诱发的肿瘤，并应用于临床，使顺铂的研究工作深入发展。现今，顺铂（ 治疗非霍奇金淋巴瘤（ 二线 化疗药，但 多数情况下 需很高剂量，顺铂的药理作用才能发挥，治疗过程中会出现许多 毒副反应 ，例如 肾毒性、耳毒性、神经毒性、骨髓抑制、过敏反应 、 恶心、呕吐、食欲减退 等 1 近年来，由于综合治疗的合理应用，相当部分的非霍奇金淋巴瘤可以治愈或缓解，但患者 经长期化疗，全身情况较差，并易 出现干细胞、外周血管受损 等 。研究者发现免疫细胞具有强大的抗肿瘤活性。 1982年， 3报道 外周血单个核细胞（ 加入 重组人白介素 体外培养 4诱导出一种非特异性的杀伤细胞，称为淋巴因子激活的杀伤细胞（ 以杀伤多种对 细胞毒性 T 淋 巴细胞 （ 自然杀伤细胞 (不敏感的肿瘤细胞。 1984年 研究组首次应用 同治疗 25例肾细胞癌、黑色素瘤、肺癌、结肠癌等肿瘤患者。其中 1例黑色素瘤完全消退， 11例肿瘤缩小超过 50%。胞杀伤力不够强，并且 扩增能力有限，需要在输注细胞的同时大剂量应用 治疗过程中可出现毒副反应，最常见和最严重的毒副作用是出现毛细血兰州大学硕士学位论文 胞对顺铂预处理的非霍奇金淋巴瘤细胞株 的 杀伤效应 2 管渗漏综合征（ 主要表现为全身性水肿和多器官功能失调， 可引起胸腹腔积液、肺间质水肿和充血性心力衰竭，但是对 胞的深入研究为随后的工作打下了良好的理论和实验基础 5 1986年 究组 报道了肿瘤浸润淋巴细胞（ 一般来说， 胞中 大多数细胞 表达 不同肿瘤来源的 胞中， 细胞与 细胞 比例有差异，大部分 以 细胞为主。经 来自 胞比较，其特点是：（ 1）增殖50疗过程中可 减 少效应细胞和 且对 疗无效的晚期肿瘤仍有一定的治疗效果；（ 2）主要由 胞诱导而来， 动物实验中发现 伤肿瘤 具有特异性；（ 3）宿主的抑制状态有利于 杀伤作用，治疗时加用环磷酰胺可明显提高疗效，可能与免疫抑制药能消除抑制性细胞或因子，增强过继免疫治疗作用有关，可减少 低毒副反应；（ 4）可从手术切下肿瘤组织、肿瘤引流淋巴液 、癌性胸腹水中获得淋巴细胞，经加 生长、扩增能力强于 胞。但是细胞获取的问题限制了 临床应用。 1989年，一个 研究小组发现 并在体外实验中显示出较 胞更高的杀伤力 8。 在此基础上， 1991年，一类由多种细胞因子诱导的杀伤细胞 （ 由斯坦福大学的 首先报道 9，是以 周血单个核细胞（ 得到的一种具有强大抗肿瘤活性的细胞群。与 胞相比较，其达到近似疗效所需细胞数减少 110， 使用无需联合 胞因可大量 地增殖、细胞毒活性强、 可杀伤自体和异体多种肿瘤细胞、骨髓纯化能力强、回输体内后可继续分裂增生且无需外源细胞因子维持作用、 副作用少 等优点， 显示了很好的发展前景，至此开启了免疫治疗的新时代。 胞 又被称为 胞样 T 淋巴细胞， 多数细胞带有 T 细胞标志，部分带有 胞标志 。其 于 胞同源， 前体细胞主要存在于外周血淋巴细胞中，均来自于大颗粒淋巴细胞。其特点为 ： 1、 胞增殖速度快，抗肿瘤活性细胞可大量增殖，且细胞活性也大大增强； 2、 胞具有识别肿瘤的机制，对正常的细胞无毒性作用； 3、 杀瘤谱广， 可用于白血病、淋巴瘤、肺癌、胃癌、肠癌等多种肿瘤的治疗，对多重耐药肿瘤细胞同样敏感 ； 4、 是典型的个性化生物治疗模式。将这类细胞回输后，还能使机体免疫能力提高，产生特异的抗病毒作用，从而对肿瘤治疗施以双重的作用 ； 5、 由于 胞是活化的自体细胞，用起来非常安全。 兰州大学硕士学位论文 胞对顺铂预处理的非霍奇金淋巴瘤细胞株 的 杀伤效应 3 要效应细胞为 7,9。 胞在正常人外周血中极其罕见，仅占 1在体外经多因子诱导培养，可迅速增多达 1000倍以上。实验证明，扩增出的 胞 多数 来源于 T 细胞。研究 发现 ，在 的 T 细胞中，除 细胞外，其余 3种 T 细胞亚群 ( 、 均可通过诱导获得 后两者在正常人外周血中含量极低。因此间接提示 胞主要来自外周血中 细胞。此外，因 细胞 表型转化能力 高， 也是 胞的一个重要来源 10 胞分泌 源性的 增 胞 13。经实验发现， 胞毒活性方面的影响没有区别，应用 胞兼具 胞及 T 淋巴细胞特性，既有 胞的非 制性，又有 T 淋巴细胞强大的杀伤活性。对于多种肿瘤细胞 14新鲜肿瘤组织均表现出强大的杀伤活性。 胞对正常骨髓细胞毒性小，可以保存 75%以上的 落，对正常髓系克隆生成几乎没有影响，轻度抑制红 系 生成 ， 对正常骨髓抑制可能与 胞产生 巴细胞毒素等有关。 大量体外实验证实 胞比 胞具备更强大的杀瘤活性， 并且不 依赖 究表明在体外 ， 等数量的 胞与 胞相比，杀伤肿瘤细胞能力相近。 但 胞在培养 增殖数量多， 应细胞增长快 ，换算成总杀瘤单位（ 算， 胞的总杀伤单位为 胞的 73倍甚至更高。肿瘤克隆抑制实验显示， 胞的瘤细胞抑制 数为 个 。体内 实验中， 重症联合免疫缺陷鼠 /人淋巴瘤模型研究表明， 胞在清除肿瘤病灶、抑制转移、 延长生存方面明显优于胞。 9用阿霉素和长春新碱诱导出多重耐药细胞系 ， 研究发现，胞对于多重耐药肿瘤亦敏 感， 杀伤效应无显著差异。 继外科手术、放射疗法和化学药物疗法之后 ， 免疫疗法确立为 肿瘤的 第四种疗法。细 胞过继性免疫治疗 (过给患者提供现成的免疫力达到杀伤和抑制癌细胞、清除手术、化疗、放疗后的微小残留病灶， 提高患者的生存质量。 近 年来， 量应用于临床。17应用自体 3例肝癌患者，其免疫功能、生活质量均提高 。 18发现 85名接受过微创治疗的肝癌患者输注 提高患者免疫力，减少复发。 19用 50例肝癌患者进行治疗后，发现 8%，说明这一治疗方案可延长患者术后生存时间。 20将 记的 细胞型淋巴瘤的临床前研究，观察到较强的兰州大学硕士学位论文 胞对顺铂预处理的非霍奇金淋巴瘤细胞株 的 杀伤效应 4 抗肿瘤毒性。 是否有办法增强 化 疗与免疫治疗在抗肿瘤过程中，是否可以相辅相成 呢？ 21将 时指出 22在采用 仅生存率要高于单纯化疗组，毒副作用也要小于化疗组 。袁香庆等 23用 0例转移性肾癌，疗效优于单纯化疗或 本玲等 24采用示患者免疫功能状态较治疗前明显改善。另有 562杀伤及其逆转 甘露聚糖肽增强 研究发现化疗药物具有免疫调节作用，可调节肿瘤宿主的免疫内环境，调变肿瘤细胞的免疫原性，重建机体免疫格局，增强后续联合的免疫治疗的疗效 25 在免疫治疗前给予的化疗方案被称为预处理化疗 (预处理化疗的目的不是以细胞毒作用直接杀伤肿瘤细胞，而是利用其免疫调节特性清除肿瘤宿主的免疫抑制性因素。 多项动物实验和临床研究证实，预处理化疗与 细胞免疫 的 联合可产生强大的抗肿瘤作用 27 本文研究目的主要是通过细胞体外培养的方法研究 非霍奇金淋巴瘤细胞 株 经顺铂预处理后，是否可以增强 其杀伤作用 ，为临床应用化疗联合 兰州大学硕士学位论文 胞对顺铂预处理的非霍奇金淋巴瘤细胞株 的 杀伤效应 5 材料和方法 料与试剂 料 自 齐鲁制药（海南）有限公司（批号 重组人白介素 山东泉港药业有限公司（批号 201207003） 干扰素（ 上海凯茂生物有限公司（批号 20121110） 抗 克隆抗体 司（批号 34554) 号 1255942） 碘化丙啶（ 碧云天生 物技术研究所（编号 司（批号 1161726） 胎牛血清 浙江天杭生物科技有限公司（批号 121122） 淋巴细胞分离液 司（批号 器 流式细胞仪 美国 品 养箱 超净工作台 司 倒置显微镜及照相系统 恒温恒湿箱 热恒湿振荡水槽 速离心机为 温冰箱 显振荡器为 料培养瓶 司 75料培养瓶 司 自动台式灭菌器 山东新华医疗器械有限公司 电子天平 司 微量加样器 上海求精生物试剂有限公司 96 孔培养板 司 流式上样管 美国 司 血细胞计数仪 德国拜尔公司 兰州大学硕士学位论文 胞对顺铂预处理的非霍奇金淋巴瘤细胞株 的 杀伤效应 6 滤器、微孔滤膜， 110心管， 10521度吸管，尖吸管，存管、 。 液配制 磷酸盐缓冲液（ 电 子天平称取磷酸二氢钾 酸二氢钠 化钠 8g，氯化钾 将称好的各种盐类放入烧杯中，加去离子水 800拌溶解，玻璃棒引流至容量瓶中，用 纸条测 ，加浓盐酸调制 容到 1L； 组装灭菌的不锈钢过滤器，将配制好的溶液过滤，分装于 4 个 250水瓶中，高温高压灭菌后 4保存。 胎牛血清： 放入 56水浴锅中，加热 30活血清中的补体等成分，室温冷却后分装至小玻璃瓶中， 存。 双抗溶液： 青霉 素和链霉素在无菌操作台内以无菌生理盐水溶解 ， 青霉素 80 万 U/瓶，用注射器加 4馏水。链霉素 100 万 U/瓶，用注射器加 5馏水，每 0 万单位。分别取 4霉素及链霉素配成混合液，将 8合液稀释 10倍，用时向培养液中加入 1%的双抗。 养液： 取 100水瓶，加入 10牛血清、青链霉素各 100u/成 10%的完全培养基， 4冷藏备用。 法 察指标 （ 1）细胞形态学观察：在倒置显微镜下观察各细胞的生长情况、数量及形态 ； （ 2）流式细胞仪检测： 不同培养时间 胞 疫表达及表型变化 ； （ 3） I 双标法测不同浓度、不同时间预处理后，效应细胞对靶细胞杀伤活性。 验细胞 人类 胞株 巴瘤细胞株 ） 、 弥漫大 均购自上海交通大学医学院附属仁济医院白血病研究室。实验细兰州大学硕士学位论文 胞对顺铂预处理的非霍奇金淋巴瘤细胞株 的 杀伤效应 7 胞株于含 10胎牛血清的 养液中，在 37、 5%和湿度培养箱中培养，每 3 天传代一次，取对数期细胞进行实验。 胞体外培养 （ 1）在短中管中加入适量淋巴细胞分离液，抽取健康人外周血 50 素抗凝处理，与等量 养液充分混匀。用滴管缓慢加入于分层液面上，水平离心 200020 分钟。用毛细管吸取单个核细胞，置于另一干净短中管中。加入 5 倍以上体积的 养液， 150010 分钟， 涤 2 次。弃上清液，加入含 10%胎牛血清的 养液，重悬细胞。把细胞浓度调整为 1106/行后续培养，第一日加入 干扰素（ 1000 u/于 37 ，5%和湿度条件下培养 24 小时，然后分别加入重组人白介素 00 u/组人白介素 500 u/ 克隆抗体 50 ng/37、 5% 和湿度培养箱中进行培养。以后每 3 天半量更换新鲜培养液，并补加重组人白介素 00 u/胞密度调整至 1106/养期间用流式细胞仪监测细胞免疫表型变化。 （ 2）动态观察 胞扩增，换液时取少量细胞悬液使用血细胞计数板计数并制作增殖曲线。 用酒精擦拭血细胞计数板及盖片，并将盖片盖在计 数板上； 吸出少量细胞悬液，滴在盖片上下边缘，使悬液充满盖片； 静置 3 分钟，使悬液扩散均匀； 显微镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞计左不计右，计上不计下。按下式计算：细胞数 /毫升 =4 个大方格内细胞总数 /4 104稀释倍数 （ 3） 胞免疫表型监测 收集 胞，用 涤 1 次，将细胞移入 U 型 96 孔板中，每孔细胞不少于 5105 个，加入荧光抗体 20l 轻轻混匀， 4避光孵育 30涤 2 次，每孔加入 100l 1%多聚甲醛固定，上流式机检测。检测 单抗包括： 种 处理浓度对 伤效果影响 预实验表明， 胞 株 的 100g/ 胞 株 的 145g/取靶细胞生长 70%左右融合时做为实验细胞。分别向胞 株 、 胞 株 中加入浓度为 0ng/25 ng/50 ng/5 ng/ 别接种于 96 孔板中，放入 37 、 5%和湿度条件下培养 18 小时，取出靶细胞，加入离 心管中离心，结束后 洗涤 2 次，并记录靶细胞数目。预温 ，然后加入细胞团中。 浓度控制为兰州大学硕士学位论文 胞对顺铂预处理的非霍奇金淋巴瘤细胞株 的 杀伤效应 8 ，吹打悬浮细胞并调整浓度。在 37温度下放置 5 分钟，加入含 10%胎牛血清 养液，然后离心。离心后细胞加入含 10%胎牛血清养液 10放置 30 分钟。 洗涤 2 次，细胞浓度调整为 5 105/胞， 胞与淋巴瘤细胞 株 的效靶比为 20:1，在 37、 5% 和湿度培养箱中培养 4 小时。 200 目筛网过滤细胞 ，上机检测前加入 浓度为 。实验重复 4 次。 种 处理时间对 伤效果影响 分别向 胞 株 、 胞 株 中加入浓度为 25ng/ 接种于 96 孔板中，在 37、 5% 和湿度培养箱中再分别培养 18 小时、24 小时、 36 小时。在 18 小时、 24 小时、 36 小时时，取出靶细胞。加入离心管中离心，结束后 洗涤 2 次，并记录靶细胞数目。预温 ，然后加入细胞团中。 浓度控制为 ，吹打悬浮细胞并调整浓 度。在 37温度下放置 5 分钟，加入含 10%胎牛血清 养液，然后离心。离心后细胞加入含 10%胎牛血清 养液 10放置 30 分钟。 次，细胞浓度调整为 5105/胞， 胞与淋巴瘤细胞 株 的效靶比为 20:1，在 37 、 5% 和湿度培养箱中培养 4 小时。 200 目筛网过滤细胞，上机检测前加入 浓度为 。实验重 4 次。 计学处理数据 数据处理应用 计学软件，数据均以 s 表示，组间比较采用t 检验， P 有统计学差异。 兰州大学硕士学位论文 胞对顺铂预处理的非霍奇金淋巴瘤细胞株 的 杀伤效应 9 结果 胞的培养 及表型 细胞换液时进行无菌检测（细菌、真菌、支原体、病毒等），光学显微镜下观察细胞形态，并取少量 光放置 25分钟后，上流式细胞仪进行检测，结果显示 1天左右时， 细胞比例 为 细胞比例为 细胞比例为 细胞活性可保持 95%以上，可持续至 25天左右，但 21天后，以上效应细胞比例未见明显升高，所以本实验选择培养 21天时的 图1。 图 1 态学观察 天时，体积未见明显变化，数量稍减少。第 7天时，细胞快速增值，团落增多，可见分裂相。细胞呈蝌蚪样不规则形。头端胞核丰富，胞质量少。第 16天时增殖，扩增成巨大 的增生集落，达到高峰，并持续在较高状态下。第 16胞数目可扩增至分离时的 120见图 2） 兰州大学硕士学位论文 胞对顺铂预处理的非霍奇金淋巴瘤细胞株 的 杀伤效应 10 图 2 诱导第 21天时 光镜下 400） 种 处理 浓度 对 伤效果影响 细胞生长达 70%融合时，分别向 、 中加入浓度为 0ng/25ng/50ng/75ng/8小时， 死亡率为 （ %、（ %、（ %、（ %。 ， 死亡率为 （ %、 （ %、（ %、（ %。加入 淋巴瘤细胞 株 的效靶比为 20:1）， 的杀伤率为 (、 (、（ %、（ %，杀伤 的杀伤率为 (、 (、（ %、（ %。结 果显示，随 入 间差异具有统计学意义（ P 表 1、 2）。 此外，5ng/种淋巴瘤细胞 株 死亡率均低于 5%，未见明显杀伤效果，所以选择此浓度进行以下实验。 表 1 不同浓度 处理后 胞株的杀伤活性 n=4， P 处理浓度（ ng/ 对照组 (%) （ %） 0 5 0 5 州大学硕士学位论文 胞对顺铂预处理的非霍奇金淋巴瘤细胞株 的 杀伤效应 11 表 2 不同浓度 处理后 胞株的杀伤活性 n=4， P 处理浓度（ ng/ 对照组 (%) （ %） 0 5 0 5 种 处理 时间 对 伤效果影响 在两种淋巴瘤细胞 株 中分别加入 25 ng/续培养 18小时、 24小时、36小时， 杀伤率分别为 (、 (、( ， 胞 株 的杀伤率分别为 ( 、(、 (。加入 淋巴瘤细胞 株 的效靶比为 20:1），在不同时间点， 的杀伤效应为 (、(、 (，对 的杀伤效应为 (、(、 (。结果显示，随 细胞死亡率增加。 后，再联合 着时间的延长，靶细胞的死亡率亦增加。联合 间差异具有统计学意义（ P （ 表 3、 4） 表 3 不同 处理 时间 胞株的杀伤活性 n=4， P 处理时间（ h） 对照组 (%) （ %） 18 4 6 4 不同 处理 时间 胞株的杀伤活性 n=4， P 处理时间（ h） 对照组 (%) （ %） 18 4 6 州大学硕士学位论文 胞对顺铂预处理的非霍奇金淋巴瘤细胞株 的 杀伤效应 12 讨论 淋巴瘤 现今成为增长速度 最快的恶性肿瘤，有关其病因、发病机制、免疫学研究、分类研究等有了很大的进展。 由于综合治疗手段的不断完善 和新药的增多 ，临床上获得缓解的 但 仍有相当部分的 治疗后反复复发、恶化，长期生存不理想。 甚至 有的患者因为大剂量的放化疗导致免疫衰竭。 癌症的免疫疗法是建立在分子生物学、分子免疫学、细胞生物学、肿瘤学等学科基础上。 后输注至肿瘤患者体内发挥抗肿瘤作用 33。 研究表明 细胞及 有可大量增殖、对多种肿瘤细胞杀伤活性强大、非 自身组织无细胞毒作用等优点，并可促进患者重建免疫系统、清除微小残留病变及净化骨髓 34。 其 为多种细胞混合体，经多因子体外诱导培养时，主要效应细胞迅速增多，具有更强细胞毒活性。其杀伤机制为， 释放以 阳性细胞 为最大颗粒释放量的具有细胞毒性的胞质颗粒物，作为外源性局部定向的细胞溶解毒素，通过细胞膜渗透，直接杀伤肿瘤细胞。 既可直接抑制肿瘤细胞 , 又可通过调节机体免疫系统反应，间接杀伤肿瘤细胞。许多肿瘤细胞表达 导免疫效应细胞凋亡，使免疫治疗成功性减低。体外培养过程中， 以通过对 期慢性杀伤肿瘤细胞，也对 致的凋亡有对抗作用 35。 闷、恶心少见，发热大多可自行缓解。大多研究者认为发热是机体免疫功能正常反应的结果，对治疗有益，其他严重副反应尚未出现。 些细胞因子对肿瘤细胞有直 接抑制作用，还可通过调节机体免疫系统间接杀伤肿瘤细胞。将其应用于 延长生存期，改善预后。与手术、放疗、化疗相比，生物治疗副作用小。 6等研究显示，定程度上，可克服靶向生物治疗中存在的递呈及定向等难题。 生物治疗对自 身造血系统、免疫系统和器官无明显毒副作用。但化疗药物存在细胞毒性，对机体伤害很大，杀伤肿瘤细胞的同时，对自身造血系统、免疫系统和器官影响很大。化疗和生物治疗联合往往可以起到相加或协同治疗的作用，提高缓解率， 减轻毒副反应。 根据肿瘤的病理类型、临床分期、发生部位和发展趋势，结合患者的全身情况和分子生物学行为，有计划地联合应用化疗药物和生兰州大学硕士学位论文 胞对顺铂预处理的非霍奇金淋巴瘤细胞株 的 杀伤效应 13 物制剂进行治疗， 可 最大限度改善患者生存质量。 机体的免疫抑制性因素可以分为系统性抑制因素和肿瘤性抑制因素两类 37。在系统性抑制中，调节性 髓系来源抑制细胞(挥主要作用 38它们可以阻碍效应细胞的靶灶浸润，抑制 效应 细胞的体 内杀伤，这两个作用均是通过构建机体免疫抑制性内环境实现的 40。肿瘤本身也可抑制免疫应答的发生，通过降低免疫原性逃避杀伤。化疗 能在 而言之为“增敏作用”，从而 改善肿瘤患者的预后 。 早在 1969年，顺铂就被发现具有治疗肿瘤的作用，后来经过长期调查实验、临床研究，顺铂被广泛应用于临床 41但大多高剂量，顺铂的药理作用才能发挥，治疗过程中会出现许多不良反应，随着顺铂的大量、长期使用，化疗耐药性成为治疗肿瘤失败最难攻克的问题及最常见的原因之一，困扰临床 医生及国内外研究者 。 近年来，免疫治疗 联合化疗治疗 肺癌、乳腺癌、胃癌、恶性黑色素瘤等的治疗效果显著， 本实验研究经顺铂预处理后对 验选取 人类 （ 、 ） ，经不同 现 间延长均增强。 25 ng/8小时，靶细胞死亡率低，对靶细胞的杀伤效果欠佳，但联合 增效作用可能依赖于机体 文献报道，内源性 肿瘤抑制性及促进性亚群。肿瘤抑制性 促进发生免疫调节性肿瘤抑制作用，并可增强 淋巴细胞亚群细胞， 瘤微环境中的比例下降，促进免疫应答发生，抑制肿瘤生长 43。 本实验采用与 放实验相关性好的 I 双标法进行检测，一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂， 入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞 蛋白质上。在细胞分裂增殖过程中， 记荧光可平均分配至两个子代细胞中 ,因此其荧光强度是亲代细胞的一半，用流式细胞仪或荧光显微镜在 490 发光处可对其进行分析。荧光探针 胞质和细胞核，在细胞核的荧光染色最强，并证实 光染料 一种很有价值的细胞标记示踪剂，不仅用于细胞增殖的体外实验 ,也可用于追踪细胞在体内的分裂增殖过程。细胞核荧光染料 称 一种常用的细胞核荧光染色剂。它不能透过完整的细胞膜，但 中晚期的细胞和死细胞的膜兰州大学硕士学位论文 胞对顺铂预处理的非霍奇金淋巴瘤细胞株 的 杀伤效应 14 而将细胞核染红。 51细胞的自发死亡与特异性杀伤会造成很强的背景信号，对评价低水平反应有影响。 1法可用于较低反应水平的分析，准确、易操作、重复性好。 综上所述，与单用 顺铂或 更具杀伤作用，可大幅提高肿瘤细胞的杀伤率。本实验可进行进一步研究，更好地为化疗联合免疫治疗的临床应用提供依据。 兰州大学硕士学位论文 胞对顺铂预处理的非霍奇金淋巴瘤细胞株 的 杀伤效应 15 结论 细胞死亡率增加，随