【毕业学位论文】（Word原稿）瓜枝孢弱毒菌株诱导黄瓜抗病性与致弱机理研究植物病理学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 瓜枝孢弱毒菌株诱导黄瓜抗病性 与致弱 机理研究 on of on of on of on of I 摘 要 本论文对瓜枝孢（ 毒菌株的弱致病性、诱导抗病性及其遗传稳定性进行了较系统的研究，从瓜枝孢弱毒菌株形态特征变化、细胞壁降解酶活性变化、可溶性蛋白变化等方面初步阐明了瓜枝孢弱毒菌株的致弱机理。 1、瓜枝孢弱毒菌株可以诱导黄瓜产生对黑星病的抗病性，并且这些特性可以稳定遗传。 在一致的温度、湿度环境条件下，诱导接种浓度、挑战接种浓度以及诱导迟滞期对黄瓜诱导抗病性作用均有影响：在相同挑战接种浓度和表达时期时，诱抗效果随着弱毒菌株诱导浓度的提高而明显增强；在相同诱导接种浓度和表达时期时，诱抗效果随着挑战接种 浓度的提高而迅速递减；在相同诱导接种浓度和挑战接种浓度时，抗病性表达有迟滞期，在诱导后 48h 抗病效果最高。 通过继代培养证实，瓜枝孢弱毒菌株的弱致病性、诱导抗病性都能够连续 9代稳定遗传。 2、瓜枝孢弱毒菌株较强毒菌株相比，孢子形态变小，致病酶活性降低、可溶性蛋白带明显减少。 分析 瓜枝孢弱毒菌株 毒力减弱机 理 ，证明 瓜枝孢弱毒菌株 无论是离体外还是寄主 活 体内，细胞壁降解酶（ 活性都要明显低于其母本 强毒菌株。 并且在各个时期内，弱毒菌株产生的酶活性变化幅度小，而强毒菌株在各个时期产生的酶活性差别 大，动态变化显著。 从可溶性蛋白电泳图谱分析看出，强毒菌株间蛋白带有明显的相似性，弱毒菌株的可溶性蛋白带明显减少，并在 缺少一条蛋白带。 关键词： 瓜枝孢弱毒菌株；诱导抗病性；致弱机理 he is on of of of on of of of 1 of be by In or of in of of If of of be to h 2. to By of x) of in in in in in of f in in 录 第一章 绪 论 . 1 1诱导抗病性现象 . 1 导抗病性 . 1 导抗病性影响因子 . 2 抗剂的获得 . 2 2诱导抗病性机理 . 3 织病理学机理 . 3 理生化机制 . 4 子生物学机理 . 4 3本论文研究目的和意义 . 6 第二章 瓜枝孢弱毒菌株诱导黄瓜抗病性研究 . 7 1瓜枝孢弱毒菌株弱致病性研究 . 7 料与方法 . 7 果与分析 . 9 结与讨论 . 10 . 11 料与方法 . 11 果与分析 . 13 结与讨论 . 15 . 17 料与方法 . 17 果与分析 . 19 结与讨论 . 22 . 23 料与方法 . 23 果与分析 . 25 结与讨论 . 27 第三章 瓜枝孢弱毒菌株致弱机理研究 . 28 . 28 料与方法 . 28 果与分析 . 29 结与讨论 . 31 . 32 料与方法 . 32 果与分析 . 34 结与讨论 . 36 . 38 料与方法 . 38 果与分析 . 40 结与讨论 . 41 第四章 全文结论 . 42 . 42 . 42 望 . 43 参考文献 . 44 致 谢 . 47 作 者 简 历 . 48 V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 烯酰胺 ,N,N 丙烯酰胺 ,N,N,N 叉 双丙烯酰胺 瓜枝孢菌 羧甲基纤维素钠 细胞壁降解酶 甲基纤维素酶 ,5,5磷酸盐缓冲液 聚甲基半乳糖醛酸酶 胶甲基反式消除酶 二烷基 磺 酸钠 十二烷基 磺 酸钠 烯酰胺凝胶电泳 ,N,N,N N,N,N,N- 四 甲 基 二 乙胺 三羟甲基氨基甲烷 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪 论 目前，植物诱导抗病性已成为植物病理学、微生物学、植物生理学乃至生物化学领域最活跃的研究分支之一。植物病理学家发现植物具有可激活的抗病免疫机制，现在已经得到了有关专家的肯定，这也揭开了植物诱导抗病性研究的新篇章。这种抗病免疫性可以通过在植株局部接种，使整个植株获得系统性抗病性，从而保护植株在整个生长期内免受病害的侵袭。用弱毒菌系诱导抗性是改变寄主 、弱毒菌系都具有与植物发生前期互作的能力，但前者能把互作继续发展为建立寄生关系并使其发 病，后者在给予寄主刺激后就停止互作向抗寄生关系方面发展，而这个刺激可以诱导植物的抗性。其基本思想是：把同种或近缘的弱毒菌系接种于寄主，使被保护的植物获得对强毒菌系的抗性，又称获得性免疫。 早在 1901 年， 报道了可以用锈菌的弱毒小种感染小麦来抵抗锈菌的再次侵染。 1929） 首先在植物病毒病害上也发现了这种现象。 10 年后 1939）在真菌病害中也发现这种现象后，引起了植物病理学家的高度重视，诱导抗病性实现了植物不同部分的沟通，用生物的手段控制植物体内的防卫反应，而且可诱导植 物产生普遍的抗性。随着研究的进展， 20 世纪 60 年代初 现用病毒诱导烟草、蚕豆、豇豆后，产生了抵抗病菌侵入的能力。 20 世纪 70 年代，科学家在瓜类作物的诱导抗病性中取得了很大进展，用真菌、细菌或病毒局部侵染瓜类作物（即免疫化处理），可免遭多种真菌、细菌和病毒的危害。 8090 年代，人们又开始对诱导抗性的机制和应用进行了较为深入的研究。有些成果已经在生产上开始推广应用，在日本用弱毒菌株 到的产品 护番茄免受病毒病的危害，瑞士生产的 防治植物的卷叶病等，为植物病害的防治开辟了一条新途径。近些年来，这个领域的研究取得了可喜的成绩和进展，诱导免疫已成为控制植物病害的新策略。 1诱导抗病性现象 导抗病性 植物诱导抗病性的现象在二十世纪初就被发现，然而关于植物诱导抗病性的研究工作却始于二十世纪 50 年代。最初人们把这种现象叫做获得抗性（ 获得性免疫（ 近几年才正式使用诱导抗（病）性（ 概念。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 诱导抗性是指利用物理的、化 学的以及生物的方法处理植物以改变病害反应，使原来感病的植物产生局部的或系统的抗性。它分为局部诱导抗性和系统诱导抗性。局部抗性（ 只在诱导部位周围产生的抗性，其典型例子如过敏性坏死反应（ 是通过侵染点周围细胞的坏死而阻止病菌扩展的现象。系统抗性（ 指诱导植物局部后植物全身都表现出抗病性。植物系统获得抗病性是植物抵抗病原物侵染的一种主要特性，指植物经病原菌或其弱毒株系诱导或接种 后、某些化学物质处理，几天内被接种的植物产生新的、广谱的系统抗性，从而对病原物再次侵染以及其他病菌的侵染均具有很强的抑制性，该抗病性可扩展到整个植株。 导抗病性影响因子 导浓度（压力或强度） 诱导浓度和诱导免疫作用的效果之间有着直接的相关性，一般情况随着诱导浓度的逐渐增加，免疫效果也逐渐提高，但达到一定浓度后，诱导效应不再增强，趋于稳定。如在番茄枯萎病诱导抗性研究中，番茄尖孢镰刀菌（ 为诱导菌，当它与挑战菌同时接种时，它的接种量需要占绝对优势，才能产生理想的诱导效果。 导迟滞期 诱导抗性的产生需要在诱导处理和挑战接种之间有一个时间间隔 迟滞期，它是植物对诱导刺激发生“免疫应答”到防卫基因表达和产物积累所需要的时间，在此迟滞期前进行挑战接种，植株将不表现或只表现较弱的诱导抗性。不同的诱导因子 病原物之间有不同的诱导迟滞期，即使同一系统中，表现局部诱导抗性或系统诱导抗性所需的迟滞期也不一定相同。董汉松（ 1993）用烟草赤星病菌弱毒株 导烟草抗赤星病研究表明诱导抗性在诱导处理 6 天后开始表现。蔡新忠等（ 1999）用番茄叶霉菌小种（番茄 系的非 致病小种）诱导处理研究表明诱导局部抗性其迟滞期为 3d，而系统抗性大于 3d。不同诱导因子诱导不同植物所需的诱导时间差别很大。如黄瓜幼苗经短暂热激后 3 小时即开始表现出对 抗性， 12h 后诱导的抗性水平达到最高限度。而用 诱导接种，则经过 48始表现诱导抗性作用。 抗剂的获得 诱抗剂（ 指能诱导植物产生抗病反应的物质和因素。大量研究证明，能起到诱导抗病作用的诱导剂种类很多，包括生 物性的和非生物性的，生物诱抗剂主要有病原物的非亲和小种（株系）、病原物的弱毒株系、病原物的近似种、中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 病原物、病原物的处理物、生物性激发子、异种病原菌、无毒菌株、植物提取物、根际细菌（ 等。 非 生 物 诱 抗 剂 主 要 是 与 诱 导 抗 病 有 关 的 信 号 分 子 水 杨 酸（ 茉莉酸（ 乙烯等以及它们的结构类似物和衍生物（徐建明， 2001；于让才， 1996）， 另 外 还 有 寡 糖 类 诱 抗 剂 （ , 1984）、 硅 （ R,1995）等。 获得诱抗剂的方法主要是从自然界筛选和人工改造，人工改造包括诱变， 热处理，遗传工程等方法。但是这些相关的研究大多还只局限于植物本身的反应，而对于诱导剂特别是生物源诱导剂如何作用于植物而使其对病原菌产生免疫力的机制还没有一个明确的认识。 石 破 知 加 子 等 （ 1981） 用 从 葫 芦 科 根 系 上 分 离 出 对 黄 瓜 幼 苗 不 致 病 的 理黄瓜下胚轴切口端，可诱导黄瓜真叶对炭疽病的抗性。 1965）将热杀死的烟草野火病菌引进烟叶叶片的间隔， 诱导了对随后接种的野火病菌的抗性。高压灭菌杀死的 孢子预处理咖啡叶，能诱导对病菌侵染的抗性（ ， 1997）。 1985 年日本专家后藤等从患病番茄上分离了具有减轻病症效果的 星 其导入 病株上成功地获得了弱毒株系。吴营昌等利用从黄瓜枯萎病病株上分离到的尖孢镰刀茵的弱毒菌接种西瓜，用于诱导西瓜对枯萎病的抗性 （ 吴营昌， 1991） 。国际水稻所植病系遗传室用紫外光诱变稻瘟病菌而得到的浅黄色素突变体是非致病菌株，对水稻抗稻瘟病有诱导抗病现象（ 沈瑛 ,1992）。王彰明等从小麦纹枯病病株上分离的小麦纹枯病菌 ( 带菌小木段叶鞘嵌入法接种小麦，获得较好的诱导抗病效果（王彰明， 2003）。 2诱导抗病性机理 使用非（弱）毒菌作为诱抗剂来处理植株可产生对病害的抗性是无可置疑的，但这种诱导抗性的机制还一直处在研究当中。目前，对诱导抗性机理的认识不断深入，总体上认为，免疫的机制是复杂的，并不是单一的。 织病理学机理 诱导抗性包含从植物细胞壁到细胞内部的一系列结构抗性反应，使寄主形成阻止或抑制病菌侵染 或扩散的结构 ,包括胼胝质，凝胶，侵填体以及与细胞壁修饰有关的结构特征。细胞壁修饰是指植物细胞受胁迫后细胞壁发生变化，包括产生乳突、细胞木质化、积累富含羟脯氨酸的糖蛋白（ 外源凝集素等。细胞木质化是被普遍接受的一种机制 , 研究证明，黄瓜植株中诱导的系统抗性与受侵染后寄主植物木质化能力迅速增强有关（ A,1987）。细胞壁蛋白是普中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 遍存在植物细胞出生壁中的一类结构蛋白，迄今已发现 4 种：富含羟脯氨酸蛋白（ 又称伸展蛋白；富含甘氨酸蛋白（ 富含苏氨酸和羟脯氨酸的糖 蛋白（ ；富含组氨酸和羟脯氨酸的糖蛋白（ 目前， 多的一类细胞蛋白。 充在纤维素构成的细胞壁骨架中，不能被细菌分泌的纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶分解，起到了抵抗病菌侵染的屏障作用。 具有凝集作用，阻止病原菌侵入或在细胞间扩散。 理生化机制 植物在受诱导后所发生的生理生化反应有：可溶性碳水化合物和酚类物质含量增加，植物保卫素（ 称植保素）产生和积累以及多种酶活性的变化、病程相关蛋白（ 产生等。 时叶片中酚类物质沉积作用增强（ ，1994）。施用诱导菌可诱导植物在侵染点产生植保素如萜烯类和其它抑菌物质。许多研究证明，过氧化物酶（ 多酚氧化酶（ 苯丙氨酸解氨酶（ 脂氧合酶（ 超氧化物歧化酶（ 查尔酮合成酶 (抗病酶在诱导后其活性和水平显著增加，同工酶谱带增多。在众多的 白中，以水解酶类如 葡聚糖酶和几丁质酶研究的最为详尽。 植保素是 植物受病原微生物或非病原微生物以及其它因素刺激，而在受感染或受刺激的部位及其周围产生和积累的具有抗菌活性的低分子量化合物，是植物受病原菌侵染后防卫反应在生化上的重要表现。由于植保素具有侵染可诱导性和体外抗菌活性 , 它的合成和累积被认为是植物的一种重要抗病机制。真菌、病毒、细菌以及它们的代谢物、细胞壁多糖、糖蛋白、脂肪酸、寡聚糖以及一些非生物诱导剂如紫外线、重金属、硅（ R， 1995）、代谢抑制剂等均能诱导寄主产生植保素（ ,2003）。酚类物质是植保素、木质素合成的前体，而其 本身和它的氧化产物醌都对病原菌都有很强的毒性，所以植物体内酚类物质的增加，不但自身的抗菌作用增强，而且也使病源物侵染处木质化程度增强，因此使植物抗病能力增强。 子生物学机理 随着现代分子生物学技术和分子植物病理学的不断发展，植物诱导抗性机理也深入到分子水平。 物防卫反应 植株受到微生物诱导后，诱导抗性反应中与末端产物积累有关的编码基因并不是抗病基因，其中大多数属于致病相关蛋白质（ 编码基因，而其中大多数的蛋白质能够抑制病原微 生物的生长与繁殖，如几丁中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 5 质酶、 1,3 葡聚糖酶等。同时在被侵染的部位还会有不同类型的植物防卫相关蛋白质（ 合成，它们同样具有重要的抗病作用。杨依军等（ 1997）利用层析、离子交换以及特异免疫化学分析的方法对诱导性蛋白酶进行分离纯化及鉴定分析，结果从非亲和性稻瘟菌侵染的稻叶中纯化了脂氧合酶（ 两种同工酶 鉴定了其血清学关系。 病基因与无毒基因 早在 1941 年， 人在有关亚麻（ ） 与亚麻栅锈菌（ 互关系的研究中就已发现，亚麻的 R 基因是显性的，而控制亚麻栅锈菌产生抗 R 基因突变小种的基因是隐性的。据此他提出了植物与病原体之间相互关系的“基因对基因”假说（“ 假说认为，对病原体表现抗性（或不相容性）的植株必定存在着一种 R 基因，而在病原体中也必定存在着与之对应的 因；这两种基因中的任何一种的缺失或功能的丧失，寄主植株与病原体之间就不能发生相 互作用，抗病反应就不会被激活，结果导致寄主植株染病。以后的大量研究证明，微生物与植物的相互作用，都遵循这“基因对基因”的关系。 植物的抗病基因与病原微生物的无毒基因，在植物与病原微生物的相互适应过程中失协同进化的。病原微生物可以通过 缺失或突变来避开植物“基因对基因”的抗病防卫反应系统，是自身得以生存，另一方面在进化的过程中，植物又必须产生处新的抗病基因，用以抵抗病原体的侵染。 近些年来，运用分子生物学技术，通过科学工作者的不懈努力，已经从有关的植物中至少分离到了至少 20 种以上的不同的抗病基因，从细菌 中已经至少分离到 40 个以上的无毒基因，从病毒中也分离到了数种无毒基因（包括烟草花叶病毒的外壳蛋白基因、复制酶基因和运动蛋白基因等），从真菌中分离到的无毒基因较少，现在仅分离得到番茄的叶霉病菌暗黄枝孢（ 的 番茄叶霉病原菌的无毒基因 乃虎， 1998）。 导抗病性信号传导 诱抗菌诱发基因表达时一般能都涉及信号传导问题。目前认为，传导信号的分子可能是水杨酸（ 、乙烯、茉莉酮酸和茉莉酮酸甲酯（ 1992；1993） 。水杨酸作为系统获得抗性必不可少的信号分子已得到证明。但水杨酸并非通常理解的可以通过输导组织送到远处组织的信号分子；在远处组织建立系统抗性所需的水杨酸是由另外的可移动的因子或信号转换成的。近年的研究表明，在细胞内的信号传递途径中，诱导菌通过与特异受体结合，将信号跨膜传递到细胞质内，经过一系列信号传导，包括离子通道打开、活性氧爆发蛋白激酶的活化等，使细胞核内防卫基因表达，产生防御物质以抵抗病原菌的侵染。信号传递不断激起人们的重视，是诱导抗性研究的热点领域。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 6 3本论文研究目的和意义 本研究以黄瓜黄化 苗、瓜枝孢弱毒菌株及其对应强毒菌株为试验材料，对瓜枝孢弱毒菌株诱导寄主抗病性、诱导寄主系统抗病性及其相关遗传稳定性进行了系统研究，并从菌体形态特征、细胞壁降解酶、可溶性蛋白等形态特征和生理生化方面显著变化来对瓜枝孢弱毒菌株致弱机理进行了研究，最后，对瓜枝孢弱毒菌株的分子生物学机理进行了预测和展望。 植物诱导性抗病是植物适应外界环境的一种反应。通过本文的研究，以期能够阐明弱毒菌株诱导植物抗病性的产生条件、表达规律、机制以及与植物正常生命活动的关系；并为克隆相关弱毒菌无病基因、寄主植物抗病基因和开发植物真菌疫苗 ，提供强有力的理论支持和科学依据，从而完善病原微生物和寄主植物之间的互作机制的研究，进一步丰富我国在诱导抗病机制领域的科研成果，推动农作物病害综合防治体系的建立。 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 瓜 枝 孢 弱 毒 菌 株 致 弱 机 理 研 究 7 第二章 瓜枝孢弱毒菌株诱导黄瓜抗病性研究 早在 1901 年， 报道了可以用锈菌的弱毒小种感染小麦来抵抗锈菌的再次侵染。 1939 年 在真菌病害中也发现了这种现象，这引起了植物病理学家的高度重视。 诱导抗病性是 通过在植株局部接种，使整个植株获得系统性抗病性，从而保护植株在整个生长期内免受病害的侵袭。用弱毒菌系诱导植物抗病性 实现了植物不同部分的沟通， 改变了寄主 、弱毒菌系都具有与植物发生前期互作的能力，但前者能把互作继续发展为建立寄生关系并使其发病，后者在给予寄主刺激后就停止互作向抗寄生关系方面发展，而这个刺激可以诱导植物的抗性。其基本思想是：把同种或近缘的弱毒菌系接种于寄主，使被保护的植物获得对强毒菌系的抗性，又称获得性免疫。 本章以黄瓜黄化苗为供试菌株，选取课题组自主筛选的瓜枝孢弱毒菌株及其对应的强毒菌株，通过黄瓜黄化苗子叶喷雾接种法系统研究了瓜枝孢弱毒菌株弱致病性、诱导黄瓜抗病性及其遗传稳定性；通过 黄瓜黄化苗根部涂抹法和子叶涂抹法系统研究了诱导黄瓜系统抗病性及其遗传稳定性等内容，同时并详细研究了相关影响因子对瓜枝孢弱毒菌株诱导黄瓜抗病性、诱导黄瓜系统抗病性的影响。这为下一章研究瓜枝孢弱毒菌致弱机理提供必要的理论依据和试验基础。 1 瓜枝孢弱毒菌株弱致病性研究 料与方法 料 试植株 “山东密刺”黄瓜黄化苗：参照李宝聚（ 1997）方法，将黄瓜种子经 升汞表面消毒 5，在 20恒温箱中催芽 24h，然后排放于高温灭菌、底部铺有双层纱布的保湿塑料盒中， 20恒温箱中黑暗培养 2d 待黄化苗种壳脱落后备用。试验用黄化苗一直在 20恒温箱中黑暗培养，以后略同。 试菌株 瓜枝孢弱毒菌株： 434322323323 瓜枝孢强毒菌株： 432323。 要仪器 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 瓜 枝 孢 弱 毒 菌 株 致 弱 机 理 研 究 8 超净工作 台 （ 北京市西城区半导体设备一厂 ）、 恒温箱培养箱 （ 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 ， ）、 灭菌锅 （ O. ）、干燥 箱 （ 上海市实验仪器总厂 ， 101 ）、 微波炉 （ ）、 光学显微镜 （ 相机（ 。 要试剂 汞溶液 法 株活化、培养 将瓜枝孢弱毒菌原始菌株（ 434322323323别在 板培养基上活化后培养 4d 备用。 雾接种 用无离子水将弱毒菌株 （ 434322323323别配制成浓度为 2 106 个 /孢子悬液，以喷雾法接种在黄瓜黄化苗子叶上， 23恒温箱中继续黑暗培养。每处理皆设 3 次重复，每个保湿盒（ 42 株黄瓜黄化苗）为一个重复，每重复喷雾法接种液体定量均为 15 立对照 以接种各自对应的强毒菌株 （ 432323）浓度为 2 106 个 /子悬液的黄瓜黄化苗 子叶 为对照。 情调查 喷雾法接种后第 3d、 5d 分别调查发病情况，并记录。 害分级与数据处理 病害分级： 借鉴李宝聚（ 1997）对黄瓜黑星病菌侵染黄化子叶病情分级标准。 0 级：无症状； 1 级：子叶出现可见的红褐色小点； 2 级：子叶出现少量的红褐色小点； 3 级：子叶红褐色病斑占叶面积 1/3 以内； 4 级：子叶红褐色病斑占叶面积 1/3； 5 级：子叶红褐色病斑占叶面积 2/3 以上。 数据处理： 病情指数 （各级病叶数 相应级数）