【毕业学位论文】（Word原稿）番茄Cf-4Avr4互作系统中信号传导基因的克隆与功能分析蔬菜学博士论文

I 密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士研究生学位论文 番茄 作系统中信号传导基因的克隆与功能分析 of in in of in in 要 叶霉病是番茄的一种主要病害，在设施生产条件下，特别是在我国的日光温室中，经常大面积发生， 严重地影响番茄的产量和品质。利用寄主对病原菌的 过敏反应 （ 目前番茄抗叶霉病育种的主要途径。但是番茄叶霉病病菌的生理小种变化较快，给抗病育种带来一定的难度。 在抗病 基因的编码蛋白与无毒基因编码产物 激发子 互作 后，通过一系列信号传导途径被诱导产生 的 。 许多研究已经表明， 信号传导途径在植物中是保守的 。因此，研究叶霉病菌 番茄抗病基因在寄主体内互作以及诱导 生的信号 传导 过程及其相关基因，利用基因工程创造具有广谱抗 性的育种材料，可能是番茄抗叶霉病育种的有效途径之一。荷兰瓦赫宁根大学植物病理实验室究小组，在研究番茄抗叶霉病基因 相应的生理小种的互作反应中，利用 析技术得到了 420 个 差异表达的 段 。 本论文利用 病毒诱导的基因沉默 （ 技术和 酵母双杂交技术，对这些 行了筛选和功能研究。主要结果如下： 1. 选择了 192 个 利用 析技术获得的 差异表达的 段 ，用 术进行了大规模的功能筛选。获得了 20 个 参与过敏反应的 段 ， 其中 15 个被沉默后，使 基因烟草的 应减弱，另 有 5 个被沉默后使 应完全丧失，表明这 5个基因在 应中起关键作用。 2. 针对上述筛选出的 20 个 段 ，通过 方法已从番茄的全长 库中获得了其中的 6 个 隆，有两个序列基本相同。它们的编码蛋白分别与来源于辣椒的 病基因编码蛋白、拟南芥 糖体蛋白、 拟南芥的一种 合蛋白、 拟南芥的一种 白和甘薯的一种 体类蛋白激酶 具有较高的同源性。其中前三个基因沉默后，使 应完全丧失。除 合蛋白和 受体类蛋白激酶外，其它 3 个基因为首次发现参与 应。暂将与 病基因编码蛋白高度同源的 3. 以 为诱饵蛋白 ， 采用酵母双杂交方法，从番茄全长 库中筛选出两个与之 互作的蛋白 ，分别命名为 码291 个氨基酸， 与拟南芥类囊体内腔蛋白同源性较高， 少编码 248 个氨基酸，与拟南芥转导素高度同源。利用 术对这两个基因进行了功能分析。结果显示 R 反应的减弱，而 因沉默后使 应完全丧失，表 明这两个互作蛋白均参与了过敏反应。 键词 ：番茄； 过敏反应 ； 病毒诱导的基因沉默； 酵母双杂交 o to be be by of is an of a of R R) of of a at of a of it is is as a R. In R be to of R in 426 by in R 0 of to be in of in a of R. 0 to a s2 19 a to be R. R in to a s2 GL as is a 91 is a 48 of in a R, in ey 录 第一章 引言 . 1 1. 植物抗病机制 . 1 病基因介导的信号传导 . 1 病信号传导分子 . 3 2. 植物广谱持久抗病基因工程策略 . 14 病基因的直接利用 . 15 敏反应（ 利用 . 15 统获得性抗性（ 利用 . 16 性氧的利用 . 16 控抗病反应的其它关键基因的利用 . 17 御基因的直接利用 . 17 3. 病毒诱导的基因沉默 . 17 介 . 18 体的发展 . 20 4. 酵母双杂交系统 . 22 母双杂交系统的基本原理 . 22 母双杂交系统的应用 . 23 5. 论文的研究目的和 主要技术路线 . 23 究目的 . 23 术路线 . 24 第二章 用 能 . 26 1. 材料与方法 . 26 料 . 26 法 . 27 2结果 . 30 与 应的功能基因的筛选 . 30 因的功能多态性 . 34 3. 讨论 . 35 第三章 全长 克隆 . 38 1. 材料与方法 . 38 料 . 38 法 . 38 2结果与分析 . 43 长 隆的获得 . 43 因的序列分析 . 44 3. 讨论 . 58 第四章 利用酵母双杂交技术在 番茄全长 库中筛选与 作的蛋白的基因 . 60 1. 材料与方法 . 60 料 . 60 法 . 60 . 结果 . 75 22 蛋白基因的 增结果 . 75 切分析结果 . 75 番茄全长 库从噬菌体中自动亚克隆到质粒载体上的结果 . 76 增检测结果 . 76 茄全长 库酵母转化的结果 . 77 粒 22(1)和 222(8)的酶切分析结果 . 77 母双杂交的筛选 . 78 性克隆的测序与序列分析 . 78 3讨论 . 85 第五章 应用 术对互作蛋白的基因进行功能分析 . 87 . 87 料 . 87 法 . 87 2结果 . 91 增 31， 403 的部分片段的结果 . 91 粒的浓度与纯度测量结果 . 92 作蛋白基因的功能验证 . 92 3 讨论 . 93 第六章 结论 . 95 参考文献 . 96 致 谢 . 115 作者简历 . 116 发表论文 . 116 附 录 . 117 中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 1. 植物抗病机制 植物一生中会受到多种生物的侵 害，包括病原微生物、线虫和昆虫等，它们给植物带来了巨大的危害。然而经过长期的进化，植物已经获得了抵御大多数入侵者的有效对策。通过识别病原微生物，植物激活了一系列早期防御反应，导致一些具有广谱抗性的防御分子的产生（ 1999； ， 2000）。 由抗病基因（ R）介导的对病原物的专化抗性是植物中最有效的抗病机制之一，它通过专一性地识别病原物无毒基因编码的产物 (来感受某种病原物的入侵，进而激活它自身的防御反应（ 1999； ， 2000）。 R 基因介导 的抗性也称为基因对基因 (抗性，通常表现为侵染点周围细胞的迅速死亡，这种现象被称为过敏反应（ 它对限制病原物进一步侵染其它组织非常有效。与此同时，病原物也会通过突变 逃避植物对它们的识别，除非 病原物的侵染和毒性非常重要。这在许多植物与病原物的互作中得到了证实（ ， 2000） 。 除了侵染点的局部抗性外，植物也进化出了一种系统免疫机制，它是局部防御反应在整个植株中建立起的一种针对病原物再次侵染的更高 层次的抗性，这种现象被称为系统获得性 抗性（ 它对病原物具有更高效更广谱的抗性。 最近，一种与 同的抗性机制被发现，它是对一种在植物根部的非病原菌反应，被称为诱导系统抗性 (它也对多种病原物产生有效抗性（ ， 1998） 。有趣的是， 依赖于 且与 白的表达也没有关系。相反， 要对植物生长激素茉莉酸（ 乙烯（ 应答反应的信号传导途径的参与。 随着对植物抗病机制研究的不断深入，许多参与抗病反应的基因和一些小分子信号物质被不断发现，本章就植物的抗病机制及信号传导方面的研究现状阐述如下： 病基因介导的信号传导 有两种模型用于解释植物中基因对基因的抗性，即 由植物 R 抗性蛋白和病原物产生的激发子的直接识别 )(1971) 和 植物的 R 蛋白与其对应的激发子并不发生直接的互作 ) (2001; 2001; it 2002)。植物抗病基因所编码的蛋白不仅要能专一性地识别病原物无毒基因的产物，而且也必须充当信号的传感器，去激发下游的防御反应。许多对细菌、真菌、病毒和线虫具有专化抗性的抗病基因已经被克隆（ 1999； ， 2000）。中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 2 令人惊讶的是，尽管它们针对不同的病原物，但是它们的蛋白结构却只存在少数的几种序列特征，其序列特征包括富亮氨酸重复（ 亮氨酸拉链（ 核苷酸结合位点（ 与果蝇胞内效应因子 受体有较高同源性的 构域等。抗病基因拥有这几个有限的基元结构暗示了由抗病基因介导的抗病 机制具有高度保守性，很可能只有少数一些下游防御因子参与其中。 在几种植物如番茄、大麦和拟南芥中，对抗病基因介导的抗性突变体和系统免疫突变体的分析，已经为我们大致展现了一个植物防御信号传导的网络图，确定了一些信号分子的位置及其它们之间的相互关系。研究发现，一些信号基因对多个抗性基因赋予的抗病性是必需的，进一步证实了植物识别病原物后，具有共同的下游信号传导途径。迄今为止，拟南芥是遗传学研究中最理想的模式植物，它是主要类别病原物（细菌、真菌、病毒和线虫）的天然寄主。对拟南芥的两个抗病信号基因突变体（ 分析表明，它们对两类不同抗病基因的功能是必不可少的（ ， 1998） 。 码一种类似脂肪酶的蛋白（ 1999） ，它的突变消除了 抗性蛋白的抗病性。而 突变则抑制了 抗病基因所赋予的抗性。有趣的是，另一个 抗病基因一性地对卵菌 生抗性（ ， 1998） ，但其赋予的抗性在 突变体中并没有被强烈抑制（ ， 1998） 。进 一步分析表明这两个基因并没有冗余地参与到信号传导中，而是利用了另一个未知的信号途径（ 2000） 。相比之下，另一个基因 这两类抗性蛋白的功能都是必需的（ 2002； ， 2002），因此推测 多个抗病基因介导的下游信号传导途径的节点。 因已经被克隆，它编码一类新的锌结合蛋白（ ， 1999） 。最近通过酵母双杂交分析，筛选出一个与 作的蛋白质 参与了大麦 导的抗病反应（ ， 2002），对拟南芥 突变体分析表明，多个 病蛋白赋予的抗性是必需的 (， 2002； ， 2002)。2002 年 人采用病毒诱导的基因沉默（ 术，对 植物抗病中的功能进行了更进一步的研究。结果发现， 于 以及多个其它抗性蛋白所赋予的抗病反应都是必需的，而且研究还表明， 非寄主抗性中也扮演重要角色。与先前鉴定的一些重要的抗病 信号分子相比， 植物抗病中可能是一个更广泛的参与因子。 除上述关键基因外，还有一些重要的基因和小分子信号物质参与到植物抗病反应中。这些成分并不参与所有的抗病反应，也不是都全部参与了某一特定的抗病反应。不同的植物拥有不同的抗病信号传导网络，同一种植物针对不同的病原物，甚至是同一病原物的不同生理小种，也会有不同的信号传导途径。所有参与的基因和小分子物质存在于抗病信号传导网络中的不同位置。有些只专一性地参与某种信号传导途径，如番茄 变体，它只使 第一章 引言 3 抗性基因的功能丧失，但对 功能没有影响 ，而这两个 R 基因识别不同番茄叶霉病菌的生理小种，在氨基酸水平上有 93的相似性 (， 2000)。另外在拟南芥中， 基因 抗性，但没有对其它 R 基因产生影响(， 1999)；有些被许多不同的信号传导途径共同采用，成为网络中的节点，只是共用的程度不同，如上文的 ，下文将对信号传导网络中的一些其它节点成分进行阐述。 病信号传导分子 杨酸（ A）与植物抗病 在病原物侵染的寄主植物中，内源 累水平的增加总是与 白表达量的增加和抗病反应的激活保持一致。 因编码水杨酸羟化酶，可转变 无生物活性的几茶酚。通过在寄主植物中表达 因 (， 1993； ， 1994)或阻止 合成 (， 2001； ， 1999)，抑制 植物体内的积累，结果有效地阻止了 赖的防御反应的激活；相反，外源 它的功能类似物苯并噻二唑 (应用导致了 白的表达，增加 了植物的抗病性。 在拟南芥中已经鉴定出许多参与 合成和信号传导的成分。 赖 号途径 在对拟南芥的突变体筛选中第一次发现 R 蛋白的表达或植株的 应 (， 1994； ， 1995； ， 1996； ， 1997)，而 因的过量表达增加了拟南芥和水稻的抗病性 (， 1998； ， 2001；， 2001； )；另外， 其类似物的应用刺激了 因产物向核 内的转运(， 2000)。 含一个锚蛋白重复序列结构域，该结构域介导蛋白质间的互作，它在 功能中扮演重要角色。研究发现亮氨酸拉链 合蛋白质中的 在互作 (， 2001)， 鉴定为一类与 列元件 合的蛋白质， 在于不同的植物和病毒基因启动子区 (， 1995)。 2002）研究证明了拟南芥 与了 导的 号途径。 一种缺失 合活性的 烟草植株中， 活 白表达的作用被抑制 (， 2000)。然而一个相反的例子中，一种缺失 合活性的拟南芥 A 的过敏反应，这些烟草在 病原物处理后 因表达的诱导效应增强 (， 2001)。上述研究表明： 赖的基因表达中扮演正中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 4 负双重调控角色，并且正负双重调控元件在拟南芥 因的启动子区均已被发现 (1998)。 施用 接种病原物都能增加 表达。研究发现 导的蛋白复合体与 结 合对 表达是必需的 (， 2001)。 动子区的 此 先激活 表达，然后刺激 细胞核内的转移。 依赖 号途径 拟南芥对芜箐皱纹病毒和黄瓜花叶病毒的抗性分别是 因赋予的。这两种抗性在转 株中丧失，但在 变体中依然有效 (， 2000； 2002)。同样是 不是 制了拟南芥对 抗性 (， 2002； ， 2002)。拟南芥的 变体对 有更高的抗性(， 2001)，这些研究表明：植物体内存在一类不依赖 依赖 抗病机制。这种抗性在 株中丧失，但仍然保留在 变体中。 因编码一种去饱和酶，它一般催化硬脂酸生成油酸 (， 2001)。但 等位突变所抑制。 码 3磷酸甘油脱氢酶，用于甘油脂的生物合成。 一种过氧化物酶 化 16 和 18 碳脂肪酸 (e ， 2002)， 激活 义抑制 ，使植株增加了对 无毒菌株的感病性。药理学研究也暗示了脂氧化作用在 活 因表达中的作用 (， 1998)。 以上研究显示脂肪酸衍生物可能参与了植物防御反应中的 号途径。 莉酸（ 乙烯 (植物抗病 除水杨酸外，茉莉酸和乙烯也在植物抗病信号传导途径中起重要作用，水杨酸非依赖型的抗病信号传导途径也能使植物获得广谱抗性。 一种脂肪酸衍生物，一些有损于 成和识别的突变体，如 许多种病原物的感病性增加 (， 1998； ， 2001； ， 1998； ， 1998；， 2000)。 一些对 成型反应的突变体最近已被鉴定出来，如 of 变体对中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 5 白粉病菌 ， 2001)。在过量表达 成基因的拟南芥中， 的基因组成型表达，并且对灰霉病菌 现出更强的抗性(， 2001)。 乙烯对植物抗病的作用尚存在一些争议，在有些植物与病原物的互作中，它对植物的抗病性起着积极作用 (， 2000； ， 1999)，但在另一些互作中却起负面作用 (， 1992； ， 1998； ， 1999)。 如拟南芥 突变体对灰霉病菌 ， 1999)和软腐病菌 ， 1999)的感病性增加，但却减弱对 假单胞菌 抗性 (， 1992)，类似的现象也在大豆中被观察到 (， 1999)。 已有大量研究显示， 防御信号路径并不是各自独立地起作用的，相反，它存在于一个庞大的复杂信号网络中，在这个网络中不同的路径交织在一起，互相影响，既相互排斥，又相互协同。在 径互作中，黑斑病菌 染后， 信号途径都需要防御相关基因 表达 (， 1996)。 表达过程中 具有协同作用 (， 2000； ， 1998)。研究发现，在 导的防御相关基因中，有近一半是两者共有的 (， 2000)。在 互作中， 染后， 积