【毕业学位论文】（Word原稿）我国羊泰勒虫的生物学特性研究预防兽医学博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 我国 羊泰勒虫的生物学特性研究 I 摘 要 羊泰勒虫病（ 由媒介蜱传播的由泰勒科泰勒属的原虫寄生于绵羊和山羊巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞内所引起的疾病的总称。泰勒虫与巴贝斯虫、无浆体、可厥体可分别引起家畜的泰勒虫病、巴贝斯虫病、无浆体病及心水病，将这 些疾病统称为蜱传病 (在全世界每年造成约 70 亿美元的经济损失。羊泰勒虫病危害严重，可引起羔羊和外地引进羊大量死亡，使慢性发病的山羊和绵羊发育变缓，产肉量和产毛量显著下降，从而给养羊业造成重大经济损失。 在 我 国， 羊泰勒虫 病 是一种重要 而常见 的蜱传性原虫病，主要分布于我 国西部 地区 ，包括甘肃、宁夏 、 内蒙古、青海、四川 和 陕西 等省 。 然而， 目前国内对羊泰勒虫病的研究尚不全面。本项研究以我国分布的两种羊泰勒虫为主要研究对象，对其生物学 特性 进行进一步的研究，主要研究结果如下： 1 利用 传 播试验，确定 青海血蜱和长角血蜱 可以作为 我国 新定名的 吕氏泰勒虫的传播媒介。从感染吕氏泰勒虫的羊体饱血的 青海血蜱 幼蜱 和 若蜱 发育而来的 若蜱 和 成蜱 ，能分别传播这种泰勒虫给除脾绵羊；同时，从感染吕氏泰勒虫的羊体饱血的长角血蜱 幼蜱 和 若蜱 发育而来的长角血蜱 若蜱 和 成蜱 ，也能分别传播这种泰勒虫给除脾绵羊。实验 结果 表明，吕氏泰勒虫至少能被 2种硬 蜱 青海血蜱和长角血蜱 传播 ，传播方式为阶段性传播。 2 利用 传播试验，确定 青海血蜱和长角血蜱 可以作为 我国 新定名的尤 氏泰勒虫的传播媒介。从感染尤氏泰勒虫的羊体饱血的 青海血蜱 幼蜱 和 若蜱 发育而 来的 若蜱 和 成蜱 ，能分别传播这种泰勒虫给 除脾和未除脾 绵羊 ； 同时，从感染尤 氏泰勒虫的羊体饱血的 长角血蜱 若蜱 发育而来的 成蜱 ，能 将 这种泰勒虫 传播 给 除脾和未除脾绵羊； 但是，从感染 尤 氏泰勒虫的羊体饱血的 长角血蜱 幼蜱发育而来的 若蜱 ，对 尤氏泰勒虫 的 传播 没有成功。 实验表明， 尤 氏泰勒虫至少能被 2种 硬 蜱 青海血蜱和长角血蜱 传播 ，传播方式为阶段 性 传播。 3 用 液氮保存 的 吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的虫血分别感染绵羊，待虫体出现后，每日做血液涂片、空气干燥、甲醇固定和姬姆萨染色，进行两种虫体的形态学观察。观察内容包括虫体形态种类、各类虫体 出现的先后次序、最高染虫率和染虫率高峰时各类虫体所占比例。结果表明，这两种泰勒虫的虫体 胞浆呈浅蓝色，细胞核成紫色，形态 类型 主要 包括圆形、卵圆形、针形、杆状、三叶草形、十字架形、逗点形和 不规则等多种形态。在整个病程中，以梨籽形、圆形（卵圆形）、针形 3类虫体 占 优势；而且这 2个虫种在形态学上几乎没有 明显 差异。 4 对尤氏 泰勒虫人工感染的试验 绵羊 进行了病理学观察。结果显示： 体表少毛部位、眼结膜、 皮下脂肪 和 大网膜轻度黄染 ； 淋巴结 和肺 脏 肿胀，切面湿润多汁；心、肝、肺、肠道和瘤胃表面可见 针尖至粟 粒 大小出血点 或出血斑。主要 的组织学病变为淋巴结充血、出血及 淋巴窦网状内皮细胞增生； 肺脏间质、网状细胞增生 ， 肺泡隔增厚 ； 肾小球内 皮 细胞 、 血管内 皮 细胞增生 ，淋巴网状细胞灶状积累，甚至形成结节 ； 心肌细胞变性坏死，染色不均 ； 肠道 肌层、粘膜层和 固 膜明显充血、出血 ； 肝细胞颗粒变性 和 有散在细胞坏死，汇 管区和小叶间 有 淋巴网状细胞增生 ；瘤胃 黏膜下层有散在性出血，肌内层见灶状出血。 5 建立了一种从 感染 有 羊泰勒虫 的 羊血液细胞分离羊泰勒虫裂殖子的快速方法。用嗜水气单孢菌产生的细胞毒素 溶血素 解寄生有羊泰勒虫的红细胞，继而用 度离心分离和纯化羊泰勒虫裂殖子。光学显微镜检验表明，从感染羊泰勒虫的红细胞分离 的 裂殖子仍然保 持 正常的 虫体 形态，并从宿主细胞成分中游离 出来 。 6 构建了吕氏泰勒虫 库 ，文库的重组率为 100%， 初级 文库 库容 量 约为 06 增 文库滴度 约 为 08 研究用 存的吕氏泰勒虫虫体直接提取并纯化 用 物合成双链 在其两端加 定向接头。将所产生 的 子定向克隆到具有 粘性末端的 以上连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体，并用之转染大肠杆菌 而构建成吕氏泰勒虫的 7 筛选出 9 个具有免疫反应性的基因。 将吕氏泰勒虫 达文库与宿主菌E3)一定比例混合孵育并铺板，当噬斑出现后将 覆盖于顶层胶表面并继续培养 3.5 h。随后，将此 次与吕氏泰勒虫阳性血清和 碱性磷酸酶标记的兔抗绵羊 后加底物显色，初步筛选得到蓝紫色的阳性克隆，并 复筛直至整个膜上均为阳性信号为止。用所得阳性噬菌体转染宿主菌 之自动亚克隆为重组质粒，用此亚克隆质粒转化宿主菌序和蛋白表达分析，共获得 24个 新基因 ， 10个基因能成功地 诱导表达， 9个具有免疫 反应性。 8 建立了吕氏泰勒虫的 测方法。利用从 吕氏泰勒虫筛选的 因， 根据其序列设计了其特异性引物，用 法检测吕氏泰勒虫感染血样中虫体 基因组 自然感染吕氏泰勒虫 的基因组 中，用该引物扩增出 368用该引物不能从尤氏泰勒虫，羊巴贝斯虫 未定种 、绵羊无浆体和健康羊基因组 扩增出 368段。 %吕氏泰勒虫虫血稀释到 10，仍能检测出虫体 法比光学显微镜检 200个视野敏感。 为 我国 吕氏泰勒虫的流行病学调查 提供了一种可靠的 检测 和 诊断方法。 关键词 泰勒虫病 吕氏泰勒虫 尤氏泰勒虫 长角血蜱 青海血蜱 形态学 病理学 库 is by is by in of a of to of as a in or to a of is an in it is In to is 1. of a in is on . to . to H. on . to . to . be by at H. . of is to 2. of a in is H. on . to . to H. on . to . to . on . to to . be by at H. . of is to 3. of . . . . in of of 0% of . . a 246 239 of an of 00 of as In in in of to a no in . . 4. of . by of of of in in of in of in of in a in in of in of 5. A in or to in a at of 6. of . . 70 . A of , in a a 06 V a 08 7. of on a E3)to an .5 by gG by to by on of of be 8. CR . A a of to A 368NA NA . CR . or NA CR to NA 0-5 is 00 CR a . in 录 第一章 绪论 . 1 . 1 . 2 莱氏泰勒虫 . 2 绵羊泰勒虫 . 3 分离泰勒虫 . 3 隐藏泰勒虫 . 4 吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫 . 5 羊泰勒虫病的分子生物学检测方法 . 6 聚合酶链式反应（ . 6 反向线状印 迹 杂交技术 . 8 的和意义 . 9 第二章 青海血蜱和长角血蜱对吕氏泰勒虫的传播试验 . 11 料和方法 . 12 原始虫种 . 12 试验羊 . 12 供试蜱 . 12 蜱的感染 . 13 传播试验 . 13 . 13 . 13 观察内容 . 13 果 . 14 . 14 . 14 . 14 . 15 论 . 15 第三章 青海血蜱和长角血蜱对尤氏泰勒虫的传播试验 . 19 料和方法 . 20 原始虫种 . 20 试验羊 . 20 供试蜱 . 20 蜱的感染 . 21 传播试验 . 21 . 21 . 21 观察内容 . 22 果 . 22 . 22 . 22 试验 . 22 . 23 论 . 23 第四章 两种羊泰勒虫的形态学观察和比较 . 27 料和方法 . 28 生虫 . 28 验动物 . 28 物感染 . 28 态学观察 . 28 果 . 33 氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的感染结果 . 33 氏泰勒虫的形态学观察 . 33 籽形虫体 . 33 形虫体 . 33 状虫体 . 34 形 /卵圆形虫体 . 34 叶草型和十字架型虫体 . 34 氏泰勒虫的形态学观察 . 34 籽 形虫体 . 34 形虫体 . 34 状虫体 . 35 形 /卵圆形虫体 . 35 叶草型和十字架型虫体 . 35 氏泰勒虫和尤氏泰勒虫在形态 学上的比较 . 35 论 . 35 第五章 尤氏泰勒虫的病理学研究 . 37 料和方法 . 38 氏泰勒虫 . 38 海血蜱 . 38 验动物 . 38 的感染 . 38 物感染 . 39 察内容 . 39 果 . 39 的感染及生化指标的变化 . 39 检眼观变化 . 39 织学变化 . 40 论 . 40 六章 用溶血素从感染红细胞分离羊泰勒虫裂殖子 . 47 料和方法 . 48 泰勒虫 . 48 验动物 . 48 剂及配制 . 48 体增殖 . 49 血收集 . 49 体的纯化 . 49 . 49 柱 . 49 解红细胞 . 49 殖子的分离 . 50 连续梯度的制备 . 50 度离心和虫体保存 . 50 果 . 50 体增殖 . 50 . 50 细胞裂解 . 51 殖子的分离 . 51 论 . 51 第七章 吕氏泰勒虫 达文库的构建 . 54 料与方法 . 55 1 寄生虫 . 55 2 试剂 . 55 3 仪器设备 . 55 泰勒虫 . 55 . 56 氏泰勒虫