【毕业学位论文】（Word原稿）任清早熟禾中DREB基因的克隆及特性分析生物化学与分子生物学博士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 早熟禾中 因的克隆及特性分析 of 密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 早熟禾中 因的克隆及特性分析 of of - - I 摘 要 自然界的植物经常会遭受干旱、盐碱和低温等恶劣环境的胁迫危害，使其生长发育受到抑制，甚至导 致植株死亡。这些非生物胁迫造成的危害已经成为农业增产、生态环境改良、实现可持续发展的重要限制因素。因此，阐明植物对环境胁迫信号的应答机制，应用基因工程手段提高植物的抗逆性，以满足日益增长的人口对粮食的需求，已成为未来农业发展的关键和基础性工作。为了进一步深入研究植物抗逆性的分子机制，获得具有自主知识产权的优良抗逆基因，我们利用 of 术快速克隆了一个基因和两个特异的 段，用于植物抗逆性和遗传工程研究。 一类与逆境胁迫相关的转录因子，它能够识别并结合于与干旱、高盐及低温胁迫应答有关基因启动子区域中的 顺式作用元件，启动下游抗逆基因的表达，从而在转录水平上调控多个抗逆基因。因此，转录因子能够综合改良植物的抗逆性状，是迄今为止较为理想的抗逆工程基因。我们采用方法，首次 从早熟禾中成功分离了 因 和两段低温诱导编码 白的 列。 列全长 833有一个完整的开放阅读框架，编码 264 个氨基酸，氨基酸序列分析表明 有一段核定位信号（ 酸性活化区域（ 63 个氨基酸的 合域（ 属于 因家族。 因在基因组 结构分析证明，有 内含子。利用 因进行组织特异性表达检测，结果分析表明因在茎和叶中高水平表达，而在根中表达较弱。在逆境条件下的表达模式分析表明，因在转录水平的表达受高盐和干旱强烈诱导，而与低温和 导没有关系。上述结果表明 碱和低温胁迫的耐性。交分析显示， 早熟禾基因组中有三个拷贝。两段低温诱导的编码 白的 列分别为 598 296中有 176 重叠序列。 此外，构建了含有 因、 因和 酰转移酶基因 ( 植物表达载体 中， 动子调控 因的表达，应用农杆菌介导法将入水稻，获得了 15 株阳性植株。 上述结果为进一步研究早熟禾的抗逆性机制以及应用基因工程手段改良农作物的抗逆性奠定了基础。 关键词： 抗逆性； 基因水稻；早熟禾 - - to as on of to by of of it is a to of to of to of in To of to to in a by of is a of to to RE in of in of at it be a to of of to we a a oa a 33 bp in a 64 It is to a of NA be no in NA of of in in of is by in of BA It is of oa NA NA oa by as is a 98 bp 96 bp in is a 176 bp in In 5 on oa to by - - 文缩写词表 英文缩写 英文全称 中文全称及注释 落酸 氨苄青霉素 苷三磷酸酶 本局域联配搜寻工具 六烷基三甲基溴化铵 磷酸二乙酯 水反应元件结合蛋白 硫苏糖醇 丙基硫代 那霉素 福平 放阅读框 架 合酶链反应 of 端快速扩增 转录 转录聚合酶链反应 二烷基硫酸钠 冲液 3 非转译区 5 非转译区 43 - - 录 第一章 引言 . 1 1. 植物对逆境胁迫适应性的分子机制 . 1 透调节物质的积累 . 1 性氧的清除 . 4 迫诱导蛋白的产生 . 5 2. 胁迫信号的传导和基因表达调控 . 6 偶联的 号通路和 号通路 . 6 号通路 . 8 赖 信号传导途径 . 8 依赖 信号传导途径 . 9 3. 植物转录因子的结构与调控作用 . 9 物转录因子的结构 . 9 录因子的调控作用 . 12 4. 录因子在提高植物抗逆性中的作用 . 15 录因子的发现 . 15 结构及表达特性 . 15 因与植物的抗逆性 . 16 号传导通路 . 17 5. 选题依据和研究意义 . 19 第二章 早熟禾中编码 录因子基因的克隆及特性分析 . 21 1. 材料和方法 . 21 料 . 21 法 . 22 2. 结果与分析 . 32 熟禾中盐诱导的编码 因 长 隆 . 32 因的生物信息学分析 . 34 因在基因组 结构分析 . 38 因的组织特异性表达分析 . 38 因在不同非生物胁迫因子条件下的表达模式分析 . 39 源基因分析 . 41 熟禾中低温诱导的 因 段的克隆 . 42 3. 讨论 . 44 第三章 利用农杆菌介导法将基因 化水稻 . 47 1. 材料与方法 . 47 料 . 47 法 . 48 2. 结果与分析 . 51 - - V 因植物表达载体的构建 . 51 稻植株再生体系的建立及筛选剂和筛选浓度的确定 . 53 杆菌介导的 水稻的转化 . 55 3. 讨论 . 55 第四章 结论与展望 . 57 1. 结论 . 57 2. 展望 . 57 参考文献 . 58 致 谢 . 68 作者简历 . 69 中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 - - 1 第一章 引言 1. 植 物对逆境胁迫适应性的分子机制 在自然界，植物生长在开放的系统中，常常遭受不良环境的侵袭，如冷害、强光、高温、干旱、水涝和高盐等的胁迫，引起植物体内发生一系列的生理代谢反应，从而产生代谢和生长的可逆性抑制，严重时引起不可逆伤害，甚至导致整个植株死亡（赵可夫， 1999）。各种胁迫中，干旱、盐碱、冷或冻害对植物的影响尤为突出，是影响植物生长和农作物产量的最主要的环境因子。为了适应环境生存，植物在长期演化过程中形成了一系列对不良环境胁迫的抵抗或忍耐能力，即植物的抗逆性。植物的抗逆性不只是单一机制起作用的结果，而是 一个十分复杂的过程，从器官形态、组织结构直到细胞生理和代谢反应，几乎涉及植物生命现象的各个层次。多年来，人们从各个角度对植物与抗逆性之间的关系进行了研究，从最初的形态结构的研究到生态、遗传的研究，再到细胞生理、代谢的研究，己积累了丰富的资料。随着分子生物学的发展，使人们能够在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平上认识植物对胁迫的耐 (抗 )性机理，尤其在植物受到非生物胁迫引发的分子反应方面，开展了广泛而深入的研究。在逆境胁迫下，植物为适应或减轻胁迫造成的伤害，植物体内发生了一系列的分子反应，其中较为普遍的是渗 透调节剂的积累、活性氧的清除以及胁迫诱导蛋白的产生等。本文将简要概述近年来在这些方面的研究进展。 透调节物质的积累 干旱、低温和盐碱等胁迫因素均可导致植物细胞缺水 ， 即诱发渗透胁迫。在一定范围内，一些植物通过在细胞内积累各种有机和无机物质，以提高细胞液浓度，降低其渗透势，这样植物就可保持其体内水分，适应水分胁迫环境。渗透调节一方面可以完全或部分维护由膨压直接控制的膜运输和细胞膜的电性质，另一方面在维持气孔开放和一定的光合速率及保持细胞继续生长等方面都具有重要作用（利容千， 2002）。 参与渗透调节的物质大致 可分为两大类，一类是由外界进入细胞内的各种无机离子，如 K+、；另一类是在细胞内合成的一些小分子有机化合物和蛋白类保护剂，常见的以下几类： 多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇等 ； 糖类，如 蔗糖，海藻糖和果聚糖等； 氨基酸及其衍生物，如脯氨酸、甘氨酸、甜菜碱等（梁慧敏， 2003；王艳青， 2001；林栖凤， 2000）。 机离子 K+是植物细胞生命活动中重要的无机离子，发挥渗透调节作用是其最主要的功能之一。在植物细胞中有两个主要的 K+库，一个在细胞质，另一个在液泡（周峰， 2003）。其中，液 泡是最大的 K+库，其主要生理功能是降低渗透势从而保持膨压促进细胞扩展，而胞质中的 K+既有渗透调节功能又有生化功能（ 1996）。当外界 K+供给缺乏时，胞质中的 K+浓度相对稳定，而液泡中的 K+浓度则有所降低，以补充其它的渗透剂代替 K+以保持膨压，当液泡 K+浓度下降至最小值时，胞质中 K+浓度才会下降，从而造成一系列的代谢失调，生长抑制等现象 (1984)。植物与外界环境 K+的交换是通过根系和土壤之间进行的，一般情况下，植物细胞质中 K+浓度较高，而中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 - - 2 土壤中的 K+浓度较低。因此，植物根系吸收 K+的过程是逆着浓度梯度的主动吸收过程。通常认为，K+的吸收主要通过两种吸收系统进行：系统 1，高亲和 K+吸收系统，即对低浓度 ( )的外界 K+的吸收，该过程属于次级主动吸收过程，由细胞膜上的载体完成，直接依赖初级主动转运体（ H+建立的质子梯度。系统 2，低亲和 K+吸收系统，即在高浓度（ 1）的外界 K+下介导 K+吸收，主要包含三类通道： 周峰 , 2003)。 氨酸 在植物抗逆性的研究中， 脯氨酸 是最受关注的一种小分子有 机物， 也是 水溶性最强的一种氨基酸，许多 植物在胁迫条件下能够迅速积累脯氨酸。但脯氨酸的积累究竟是植物受胁迫伤害而产生的一般生理现象，还是植物耐盐的原因，尚有不同看法。目前，有人把脯氨酸积累的作用大致归结为以下几个方面：一是可作为细胞的有效渗透调节物质 (1974)；二是保护酶和膜的结构（ 1983）；三是可直接利用的无毒形式的氮源，作为能源和呼吸底物，参与叶绿素的合成等。缺水时， 咯啉 的原初积累部位为叶，其次是茎，其它器官的脯氨酸来自叶。植物体内脯氨酸合 成途径有谷氨酸和鸟氨酸两种途径 (1993)。在渗透胁迫下脯氨酸的积累主要是通过谷氨酸途径。在植物谷氨酸合成途径中，由 咯啉 合成脯氨酸是由 种酶催化的 ， 而后者是植物体内合成 脯氨酸的关键酶 (彭志红， 2002)。 目前， 基因已在植物中陆续克隆 (1995)。其中，影响脯氨酸合成的关键酶 转基因烟草中过量表达，转基因植株中的脯氨酸含量大大提高，含量增加 10 18 倍，植物的抗逆性也因此增强 (彭志红， 2002) 。 菜碱 甜菜碱作为一种次生代谢产物，在盐胁迫条件下会在某些植物体内会大量积累，其功能也为人们所熟知，它能够作为渗调剂、酶的构型保护剂 ， 保护质膜的完整性 ， 是无毒的细胞质调渗物质，其积累使代谢过程中的许多酶类在渗透胁迫下能够保持活性。很低浓度的外源甜菜碱具有良好的渗透调节保护作用 (刘祖祺， 1994)。植物中甜菜碱按其结构不同可分为三种类型，即甘氨酸甜菜碱、脯氨酸甜菜碱和丙氨酸甜菜碱，其中甘氨酸甜菜碱在植物中分布广泛，在研究中多以它为代表。甜菜碱的生物合成途径为：胆碱甜菜碱醛甘氨酸甜菜碱。 在高 等植物中，催化第一步反应的是胆碱单加氧酶 (催化第二步反应的是 甜菜碱 醛脱氢酶（ 这两种酶都存在于叶绿体基质中，其活性受盐胁迫诱导 (李秋莉， 2002)。近年来，已经从许多植物中分离到这两个基因。刘凤华等（ 1997）和 1997)分别对植物进行了转 转基因植物都获得了较高的耐盐性。研究表明 :当胁迫解除后 ， 叶片和根中的脯氨酸含量立即下降 ，而甜菜碱的含量基本上保持稳定。这说明脯氨酸的积累可能是植物对胁迫的暂时反应 ， 而甜菜碱的积累则可能是永久性或半永久性 的 (梁铃， 1995)。由于胆碱脱氢酶 (胆碱氧化酶 (兼二者之功能合成甘氨酸甜菜碱 ， 合成途径简单 ， 进行遗传操作方便 ， 且已证明甜菜碱合成后几乎不再被进一步代谢，因而这两种甜菜碱合成酶基因被认为是非常有希望的胁迫抗性 (因之一，在植物抗盐、抗旱研究中越来越受到重视。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 - - 3 类 糖类物质是植物细胞中主要的组成和营养物质，也是植物受到胁迫时常常积累的小分子有机物 ， 如海藻糖、果聚糖和蔗糖等。它们既是一种贮藏性碳水化合物 ， 又能作为渗透调节剂保护生物细胞和生物 活性物质在不良环境条件下免遭破坏。 海藻糖 (甘露醇、甜菜碱、氨基酸等一样，是细胞渗透调节时产生的重要相容性物质之一，它是由两个葡萄糖分子结合而形成的非还原性糖 (江香梅， 2001)。海藻糖一般在细菌、真菌、酵母和昆虫等生物体内大量存在，少数极端耐旱的高等植物中也能合成。目前，已从细菌、真菌以及耐旱的高等植物中克隆到海藻糖合成酶基因，海藻糖的合成分两步进行。 6肠杆菌海藻糖的合成由 经 1992)。 南芥、复苏植物等真核生物中分离得到的海藻糖 1999)。真核生物海藻糖的合成分别由功能分别相当于大肠杆菌的 究表明，从 S. 马铃薯等植物中，该基因在高等植物中表达后能使高等植物积累一定浓度的海藻糖，从而使植物对干旱、盐胁迫具有一定的忍受能力 (1997; 998; 赵恢武 , 2000; 戴秀玉 , 2001)。 果聚糖广泛存在于植物和微生物中，由于其高可溶性使植物的渗透调节能力提高。果聚糖在植物抗盐中起着重要作用 (邱栋梁 , 2002)。在植物中，由蔗糖形成果聚糖包括两种酶：其中果聚糖化 糖分子的合成，三糖分子在另外一个酶的催化下以不同的方式不断延伸 。对不同结构的果聚糖的功能目前还不十分清楚。其链的长度易受环境影响，果聚糖是可溶的，存在于液泡中，能帮助植物耐受干旱、盐等引起的渗透胁迫。如将 因转入烟草，转基因植物能积累果聚糖，提高抗渗透胁迫的能力 (998)。 元醇 多元醇是一类特殊的有机物，普遍存在于植物细胞中，其共同特点是含有多个羟基 ， 亲水性强 ， 能够有效地维持细胞的膨压 ， 从而有效地抵抗盐胁迫下的渗透脱水。多元醇包括单链代谢物 ，如甘露醇、山梨醇、环状多元醇、肌醇和它的甲基化衍生物。多元醇的积累与植物对干旱和 盐胁迫的耐受性有关。多元醇在植物抗盐中起两方面作用：一是渗透调节 ， 一是渗透保护 (应天玉 ,2003)。目前 已将 1因 (和 6梨醇 脱氢酶 基因中单价或双价基因在 烟草、水稻、玉米和八里庄杨等植物中进行了遗传转化， 源基因已转入植物基因组中，并得到表达，同时使转基因植株的耐盐性得到不同程度的提高，在高浓度盐分下 ， 转基因植株被检测到了甘露醇的积累 ， 与对照组相比有较高的盐耐性(江香梅， 2001; 1993; 刘俊君 , 1996)。多元醇除了对细胞起到渗透保护作用外 ， 还能清除活性氧 ， 降低胁迫条件下产生的氧化胁迫，在这方面，甲基肌醇比甘氨酸甜菜碱更为有效（ 997）。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 - - 4 性氧的清除 众所周知，植物必须依赖氧才能获得能量、维持生存。然而，植物体内过量的活性氧又能产生毒害作用。活性氧是指植物体内直接或间接由氧转化而成的氧的某些代谢产物及其衍生的含氧物质。其中包括两种自由基 (超氧自由基， ；羟自由基， 过氧化氢 (脂类过氧物 ()、单线态氧 (1，它们都含有氧并且有着比 氧更为活泼的化学反应性。植物活性氧主要来源于线粒体、叶绿体和一些酶促反应（利容千， 2002）。活性氧的过剩积累会对细胞构成氧化胁迫，造成细胞水平和分子水平的损伤，导致膜系统的破坏、蛋白质和 子结构等损伤。在逆境条件下，植物体内会产生过量的活性氧，为抵御过多的活性氧对细胞的毒害 ， 植物细胞便启动一些活性氧清除机制。植物体内的抗氧化系统主要包括抗氧化酶类和非酶活性氧清除剂。植物体内抗氧化酶类主要有超氧化物岐化酶 (过氧化物酶(过氧化氢酶 (抗坏血酸氧化酶 (植物活性氧清除剂主要有谷胱甘肽、类胡萝卜素、抗坏血酸等（利容千， 2002）。 氧化物歧化酶 (够清除细胞中多余的超氧根阴离子。在高等植物中 ， 根据 类： 中 ， 种超氧化物歧化酶中含量最丰富的一类 ， 主要存在于叶绿体、胞质和过氧化物酶体中； 据 992) 。 实验结果表明， 如， 1993)，而转基因苜蓿叶绿体中1993)。但有的 如，过量表达矮牵牛花叶绿体 未提高转基因植物对臭氧或甲 基紫精引起的氧化损伤的耐受性 (991)。这表明，不同的 3种 3种 种 行了详细的研究，发现不同 外照射和不同范围的光谱的应答存在差异性 (998)。因此，推测 能存在独立的，胁迫特异性的 坏血酸过氧化物酶 (2 它以抗坏血酸为电子供体，催化 2等植物的 种是光合器官型，存在于叶绿体中，另一种是非光合器官型，存在于细胞质、线粒体、过氧化物酶体和乙醛酸循环体中 (998)。 研究结果表明，在各种环境胁迫条件下，包括高温、低温、强光、甲基紫精、高盐、干旱、臭氧、紫外照射等，抗坏血酸过氧化物酶表达增加 (998)。转基因手段也证明抗坏血酸过氧化物酶在胁迫应答中具有重要作用。细胞质 997)；定位在拟南芥过氧化物酶体 第一章 引言 - - 5 强了植株对氨基三唑的抗性 (1999)，过氧化物体基因在拟南芥中的过量表达提高了转基困植株的耐热性 (001)。这些研究表明抗坏血酸过氧化物酶在植物适应逆境条件过程中具有重要的作用。 氧化氢酶 (研究表明 ， 过氧化氢酶主要存在于植物过氧化物酶体与乙醛酸循环体中 ， 它与 2氧化氢酶是 2 而且是 997)。烟草中 3种过氧化氢酶基因产物的功能均已得到确定： 222量的证据表明过氧化氢酶在植物防御反应、衰老或老化过程中起重要作用 (997; 1997; 000)。 坏血酸 (抗坏血酸在 活性氧清除过程中也起重要作用，属于非酶活性氧清除剂，它可直接同 应 ， 将其还原 ， 又可作为酶的底物在活性氧的清除过程中发挥一定的功能。可溶性的抗氧化物抗坏血酸在保护植物免受氧化损伤的过程中至关重要，它的主要功能有： (1)它既可以作为初级抗氧化物直接淬灭单线态氧、超氧化物和羟自由基，也可以作为叶黄素循环中的紫黄质去环化酶的辅助因子，在光保护及光合调节过程中起重要作用。 (2)作为次级抗氧化物直接参与 外，它还参与减数分裂和细胞扩展的调节、氧还信号的传递、病原菌防御以及金属和生物异源物质的清除。 (3)在叶绿体类囊体表面作为还原剂参与抗坏血酸过氧化物酶介入的过氧化氢的清除 ， 在这一过程中 ， 抗坏血酸被氧化成单脱氢抗坏血酸 (1