孙宙--------2009114010233----------木芙蓉花中有效成份的提取与性能研究

湖北师范学院09届生命科学学院综合实验论文木芙蓉花中有效成份的提取与性能研究报告题目: 木芙蓉花中有效成份的提取与性能的研究 作者姓名： 孙宙 指导教师： 倪明 所在院系： 生命科学学院 专业名称： 生物科学 班级学号： 0902/2009114010233 完成时间： 2012 年 3 月 目 录1 实验材料与方法3 1.1 实验材料和仪器3 1.1.1 实验材料3 1.1.1.1 木芙蓉和芦丁3 1.1.2 仪器设备3 1.1.3 试剂及溶液3 1.2 实验方法4 1.2.1 样品的处理及提取4 1.2.2 样品测定4 1.2.2.1黄酮测定.4 1.2.2.1.1 黄酮类物质的鉴定方法. 4 1.2.2.1.2 黄酮类物质定量测定.5 1.2.2.1.2.1 标准曲线的制备.5 1.2.2.1.2.2样品黄酮含量定.5 1.2.2.2 多酚测定.5 1.2.2.2.1 福林酚（Folin-Ciocalteu）试剂的配制.5 1.2.2.2.2 制作没食子酸标准曲线.6 1.2.2.2.3 多酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu反应比法.6 1.2.2.3 抑制亚硝化反应.6 1.2.2.3.1 总黄酮对亚硝酸钠清除率的测定.6 1.2.2.3.2 总黄酮对亚硝胺合成阻断率的测定.7 2 结果与分析.7 2.1 黄酮测定.7 2.1.1 黄酮类物质的鉴定方法.7 2.1.2 黄酮类物质定量测定.8 2.1.2.1 标准曲线的制备.8 2.1.2.2 样品黄酮含量测定.9 2.1.3 多酚测定.9 2.1.3.1 制作没食子酸标准曲线.9 2.1.3.2 多酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu反应比色法.10 2.1.4 抑制亚硝化反应.10 2.1.4.1 总黄酮对亚硝酸钠清除率的测定.10 2.1.4.2 总黄酮对亚硝胺合成阻断率的测定.11参考文献12摘 要：常是植物及微生物中产生的酚类次生代谢产物。具有抗氧化性、抗肿瘤、抗动脉硬化、防冠心病与中风等心脑血管病以及抗菌等多种生理功能，是自然界和人类的“健康卫士”。2l世纪随着抗氧化剂理论及研究工作的深入，以及消费者对食品安全性意识的提高，天然抗氧化剂的应用越来越受到人们的重视，回归大自然已是目前一个大趋势。木芙蓉（Hibiscus mutabilis L.）为锦葵科植物，又名拒霜花、木莲、醉芙蓉，为落叶灌木或小乔木。其花大色艳，花色一日三变，在寒凉的深秋傲霜怒放，观赏价值极佳。其花、叶、根富含生化药物成分，是极优良的中药材。中医认为，木芙蓉性平味辛，有清热、凉血、解毒、消肿、排毒之功效，适用于肺热咳嗽、月经过多、白带过多、痈疽肿毒、疔疮、水火烫伤等疾病。本草纲目言其“治一切大小痈疽，肿毒恶疮，消肿，排脓，止痛”。木芙蓉花、叶中含有多酚、黄酮类化合物。黄酮类化合物广泛存在于天然产物中，大多具有明显的抗炎、抗菌、生物抗氧化性、抗衰老、降血脂、治疗心血管疾病等功能。其中有些可用于心血管病的治疗。这项研究利用植物中有效成分提取及测定方法，了解植物中有效成分的药用价值。本实验通过黄酮类物质的鉴定，总黄酮的测定，多酚测定方法，总黄酮对亚硝酸钠清除率的测定，总黄酮对亚硝胺合成阻断率的测定，了解黄酮的理化性质。在研究药用价值方面有很大的远景。关键词：木芙蓉；理化性质 ； 药用价值 木芙蓉花中有效成份的提取与性能研究孙宙（指导老师：倪明）（湖北师范学院生命科学学院 湖北 黄石 435000）1 实验材料与方法1.1 实验材料和仪器1.1.1 实验材料1.1.1.1 木芙蓉和芦丁 木芙蓉花采自湖北师范学院校区；芦丁购自上海展云化工有限公司1.1.2 仪器设备分析天平 （AB204-N型，梅特勒-托利多仪器上海有限公司）数显恒温水浴锅（DK-8D型，金坛市医疗仪器厂）粉碎机三用紫外仪真空泵分光光度计调温电热套（KDM型，武汉精华科教仪器有限公司）比色管 1.1.3 试剂及溶液 对氨基苯磺酸（分析纯）；柠檬酸（分析纯）；磷酸氢二钠（分析纯）；盐酸萘乙二胺（分析纯）；二甲胺（分析纯）；1-萘胺（分析纯）；钨酸钠（分析纯）；钼酸钠（分析纯）；没食子酸（分析纯）；乙醇（分析纯）；A1(NO3)3（分析纯）；盐酸（分析纯）；NaOH（分析纯）；浓H2SO4（分析纯）；磷酸（分析纯）。1.2 实验方法1.2.1 样品的处理及提取 处理：新鲜木芙蓉花水洗后，于60烘干，粉碎机粉碎，过筛备用。 提取：精密称取干燥、粉碎的木芙蓉花粉末1.0000 g置于锥形瓶中，加入60 %乙醇溶液30mL，于60浸提2 h，滤去残渣，残渣洗涤2-3次，定容至100 mL，即得提取液。1.2.2 样品测定1.2.2.1 黄酮测定1.2.2.1.1 黄酮类物质的鉴定方法(1)盐酸一镁粉反应：取待测液10 mL放在测试瓶中，加入少许镁粉振摇，滴加几滴浓盐酸，观察反应现象。(2)氨水反应：取待测液10 mL放在测试瓶中，滴加几滴氨水振摇，观察反应现象。(3)硝酸铝反应：取待测液10 mL放在测试瓶中，滴加几滴硝酸铝振摇，观察反应现象。(4)三氯化铝反应：取待测液10 mL放在测试瓶中，滴加几滴1 %三氯化铝振摇，观察反应现象。(5)氯化铁反应：在试管中加1 mL提取物，再加入10 mL的2FeCl3，观察反应现象。(6)浓硫酸反应: 在样品液中滴加少量浓H2SO4溶液，观察反应现象。(7)碱性试剂显色反应在样品液中加入5 % NaNO2溶液; 摇匀，旋转6 min 后，加入等体积10% A1(NO3)3溶液，6 min 后再加入4 % NaOH 溶液，混匀，用65 %乙醇稀释，观察反应现象。(8)与5的醋酸铅反应：在5的醋酸铅溶液中滴加数滴提取物，观察反应现象。(9)与1高锰酸钾溶液反应：在试管中加10 mL 1KMnO4，滴入34滴提取物，观察KMnO4溶液是否褪色。(10)与碱性试剂(1NaOH)反应：在1 mL提取物中加入05 mL的1NaOH，观察颜色变化。1.2.2.1.2 黄酮类物质定量测定1.2.2.1.2.1 标准曲线的制备精密称取芦丁对照品10 mg，置50 mL量瓶中，加80%乙醇溶解至刻度，摇匀即得对照品溶液。分别精密吸取1.0 mL，2.0 mL，3.0 mL，4.0 mL和5.0 mL置于10mL比色管中，各加80%乙醇至5 mL，加5% NaNO2溶液0.5 mL，摇匀放置6 min，再加10 % A1(NO3)3。溶液0.5 mL，摇匀，再放置6 min，加4 % NaOH溶液4mL，摇匀放置15min，在510 nm波长处，以同法配制空白对照，测定吸光度值，得回归方程。1.2.2.1.2.2 样品黄酮含量测定精密吸取提取液1.0 mL于10 mL比色管中，按“各加80 %乙醇至5 mL”起依法进行操作，同时精密吸取黄酮提取液1.0 mL于10 mL比色管中，加80 %乙醇至5 mL，再加1mL水，4 mL4 %NaOH溶液，作样品空白测定吸光度值。按回归方程计算样品黄酮提取得率。1.2.2.2 多酚测定1.2.2.2.1 福林酚（Folin-Ciocalteu）试剂的配制称取100 g钨酸钠和25 g钼酸钠置于2L的磨口圆底烧瓶中，用700 mL蒸馏水溶解，再缓慢加入50 mL 85 %的磷酸和100 mL的浓盐酸，充分混匀，放入数粒玻璃珠，连接回流冷凝装置，文火回流10 h。用50mL蒸馏水冲洗冷凝管上的附着物，拆开冷凝管后加入150 g无水硫酸锂和几滴溴水（边加边摇晃），开口继续加热沸腾15 min，使溴水完全挥发为止，终点颜色为黄绿色。冷却后定容至1000 mL，过滤，储存于棕色瓶中，放入冰箱中保存备用。1.2.2.2.2 制作没食子酸标准曲线精确称取0.070 g的干燥没食子酸标准品，用蒸馏水溶解，定容于100 mL的容量瓶中，配成浓度为700 mg/L的没食子酸溶液。然后分别精密吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 mL没食子酸标准溶液定容于50 mL容量瓶内，配成浓度为0-56 mg/L的系列标准溶液。再从各系列标准溶液中吸取1mL于25 mL比色管内，加10 mL蒸馏水，摇匀，再加1.5 mL Folin- Ciocalteu试剂，充分摇匀，立即加入6 mL 10 % Na2CO3溶液，混匀，加水定容，再混匀，然后在30下避光放置反应1h，以试剂样为空白，在波长760 nm处测定吸光值，以吸光度值为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。1.2.2.2.3 多酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu反应比色法取1mL提取稀释液（样液稀释10倍）于25mL比色管内，加10 mL蒸馏水，摇匀，再加1.5 mL Folin- Ciocalteu试剂，充分摇匀，立即加入6 mL10 % Na2CO3溶液，混匀，加水定容，再混匀，然后在30下避光放置反应1 h，以试剂样为空白，在波长760 nm处测定吸光值，根据绘制的标准曲线方程计算提取液中多酚含量(以没食子酸计)，经进一步计算即得多酚提取得率。1.2.2.3 抑制亚硝化反应1.2.2.3.1 总黄酮对亚硝酸钠清除率的测定分别吸取50 mg/L的NaNO2标准液1.0 mL于6支25 mL比色管中，再分别加入提取液0.0、1.0 、2.0 、3.0 、4.0 、5.0 mL，加入pH3.0 的柠檬酸- 磷酸氢二钠缓冲液10 mL， 37条件下反应1h。加入质量分数0.4 % 对氨基苯磺酸2.0 mL，摇匀静置5 min，再加入质量分数0.2% 盐酸萘乙二胺1.0 mL，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀静置15 min。在确定的最大吸收波长max = 540 nm 处测定吸光度，并计算总黄酮对亚硝酸钠清除率。1.2.2.3.2 总黄酮对亚硝胺合成阻断率的测定分别吸取总黄酮提取液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，于6支25 mL 比色管中。加入pH 3.0 的柠檬酸- 磷酸氢二钠缓冲液10 mL，1 mmol/L 的NaNO2 溶液1.0 mL，1 mmol/L 的二甲胺溶液1.0 mL，用蒸馏水稀释至刻度，在37条件下恒温1 h。用移液管吸取1.0mL 上述溶液加到7 cm2 培养皿中，加入质量分数0.5% Na2CO3 溶液0.5 mL，于紫外分析仪(254nm 波长)上辐照15 min。取出后加入质量分数 1% 对氨基苯磺酸1.5 mL，再加入质量分数0.1% 1-萘胺1.5 mL，蒸馏水0.5 mL，摇匀静置15 min。用分光光度计在确定的最大吸收波长max = 525 nm 处测吸光度，计算总黄酮对亚硝胺合成阻断率。2 结果与分析2.1 黄酮测定2.1.1 黄酮类物质的鉴定方法 (1)盐酸一镁粉反应：取待测液10 mL放在测试瓶中，加入少许镁粉振摇， 滴加几滴浓盐酸，产生泡沫反应，反应完后溶液呈橙红色，表明有黄 酮类化合物。 (2)氨水反应：取待测液10 mL放在测试瓶中，滴加几滴氨水振摇，反应 完后溶液呈黄色，表明有黄酮类化合物。 (3)硝酸铝反应：取待测液10 mL放在测试瓶中，滴加几滴硝酸铝振摇。 反应完全后溶液呈黄色，表明有黄酮类化合物。 (4)三氯化铝反应：取待测液10 mL放在测试瓶中，滴加几滴1 %三氯化 铝振摇，反应完全后溶液呈黄色，表明有黄酮类化合物。 (5)氯化铁反应：在试管中加1 mL提取物，再加入10 mL的2FeCl3，若 呈蓝绿色或绿色，表明含有酚类化合物。 (6)浓硫酸反应: 在样品液中滴加少量浓H2SO4溶液，观察反应颜色变橙色， 表明有黄酮类化合物。 (7)碱性试剂显色反应在样品液中加入5 % NaNO2溶液; 摇匀，旋转6 min 后，加入等体积10% A1(NO3)3溶液，6 min 后再加入4 % NaOH 溶液， 混匀，用65 %乙醇稀释，观察反应颜色变橙红色，表明有黄酮类化合 物。 (8)与5的醋酸铅反应：在5的醋酸铅溶液中滴加数滴提取物，有黄色 沉淀产生的表示有黄酮类成分。 (9)与1高锰酸钾溶液反应：在试管中加1.0 mL 1KMnO4，滴入34滴 提取物，观察KMnO4溶液是否褪色，若褪色表明含有酚类化合。 (10)与碱性试剂(1NaOH)反应：在1 mL提取物中加入05 mL的1NaOH 观察颜色变化，若呈黄色、橙色或红色，表明含有黄酮类成分。2.1.2 黄酮类物质定量测定2.1.2.1 标准曲线的制备 芦丁体积0.01.02.03.04.0吸光度值00.2210.4560.7501.071 2.1.2.2 样品黄酮含量测定 样品A510=0.685，带入标准曲线 回归方程可得黄酮的体积为：2.71 ml 根据样品黄酮提取含量按照如下公式计算 式中：Y：黄酮提取含量（%）； V：提取黄酮液体积（mL）； C：提取原液中黄酮的浓度（g/mL）； M：木芙蓉花质量（g）。M=1.009g v=100ml则Y=5.4%即黄酮提取含量为5.4%2.1.3 多酚测定2.1.3.1 制作没食子酸标准曲线 没食子酸体积 00.51.01.52.03.04.0吸光度值0.0090.0220.0520.0700.1120.1270.170 2.1.3.2 多酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu反应比色法 多酚含量的测定123平均吸光度值0.1660.1670.1620.165 样品A760=0.165，带入标准曲线根据制作标准曲线回归方程可得x=3.78 根据多酚提取得率按照如下公式计算 式中：Y：提取得率（%）； V：提取多酚液体积（mL）； C：提取原液中多酚的浓度（g/mL）； M：木芙蓉花质量（g）。 M=1.009g v=100ml得到多酚提取含量为0.1022.1.4 抑制亚硝化反应2.1.4.1 总黄酮对亚硝酸钠清除率的测定 根据石榴皮总黄酮对亚硝酸钠清除率的测定 式中：A0 为未加样品溶液时NaNO2 的吸光度(以试剂空白溶液为参比溶液)； A 为加入样品溶液后NaNO2 的吸光度(以样品溶液为参比溶液)。提取液体积吸光度值清除率00.86200.20.69819.02%0.40.66323.09%0.60.58432.25%0.80.46732.95%1.00.46745.82%2.00.42151.16%3.00.36158.12%2.1.4.2 总黄酮对亚硝胺合成阻断率的测定 根据总黄酮对亚硝胺合成阻断率按照如下公式计算 式中： A0 为未加样品溶液时NaNO2 的吸光度(以试剂空白溶液为参比溶液)； A 为加入样品溶液后NaNO2 的吸光度(以样品溶液为参比溶液)。 体积液体积吸光度值清除率00.12601.00.07540.47%2.00.05258.73%3.00.06052.38%4.00.05853.96%5.00.04961.11%【注意事项】1. 使用浓硫酸时一定要小心，注意安全。2. 使用紫外分析仪时，三用紫外分析仪使用和