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中药新药安全性评价技术与方法 毒理学药物毒理学新药安全性评价中药新药急性毒性试验中药新药长期毒性试验中药新药一般药理学试验中药注射剂过敏 刺激 溶血性试验其他 中药新药注册分类 1 未在国内上市销售的从植物 动物 矿物等物质中提取的有效成分及其制剂 2 新发现的药材及其制剂 3 新的中药材代用品 4 药材新的药用部位及其制剂 5 未在国内上市销售的从植物 动物 矿物等物质中提取的有效部位及其制剂国家药品标准中未收载的从单一植物 动物 矿物等物质中提取的一类或数类成份组成的有效部位及其制剂 其有效部位含量应占提取物的50 以上 6 未在国内上市销售的中药 天然药物复方制剂6 1中药复方制剂 6 2天然药物复方制剂 6 3中药 天然药物和化学药品组成的复方制剂 7 改变国内已上市销售中药 天然药物给药途径的制剂 8 改变国内已上市销售中药 天然药物剂型的制剂9 已有国家标准的中药 天然药物 药品属性三原则安全性有效性质量稳定可控 中药 天然药物申报资料 综述资料 1 药品名称 2 证明性文件 3 立题目的与依据 4 对主要研究结果的总结及评价 5 药品说明书样稿 起草说明及最新参考文献 6 包装 标签设计样稿 中药 天然药物申报资料 药学研究资料 7 药学研究资料综述 8 药材来源及鉴定依据 9 药材生态环境 生长特征 形态描述 或培植 培育 技术 产地加工和炮制方法10 药材标准草案及起草说明 并提供药品标准物质及有关资料 11 提供植 矿物标本 植物标本应当包括花 果实 种子等 12 生产工艺的研究资料及文献资料 辅料来源及质量标准 中药 天然药物申报资料 药学研究资料 13 确证化学结构或组分的试验资料及文献资料 14 质量研究工作的试验资料及文献资料 15 药品标准草案及起草说明 并提供药品标准物质及有关资料 16 样品检验报告书 17 药物稳定性研究的试验资料及文献资料 18 直接接触药品的包装材料和容器的选择依据及质量标准 中药 天然药物申报资料 药理毒理研究 19 药理毒理研究资料综述 20 主要药效学试验资料及文献资料 21 一般药理研究的试验资料及文献资料 22 急性毒性试验资料及文献资料 23 长期毒性试验资料及文献资料 24 过敏性 局部 全身和光敏毒性 溶血性和局部 血管 皮肤 粘膜 肌肉等 刺激性 依赖性等主要与局部 全身给药相关的特殊安全性试验资料和文献资料 25 致突变试验资料及文献资料 26 生殖毒性试验资料及文献资料 27 致癌试验资料及文献资料 28 动物药代动力学试验资料及文献资料 中药 天然药物申报资料 临床试验资料 29 临床试验资料综述 30 临床试验计划与方案 31 临床研究者手册 32 知情同意书样稿 伦理委员会批准件 33 临床试验报告 急性毒性试验 动物单次或24小时内多次接受一定剂量的受试物 动物在一定时间内出现的毒性反应 急性毒性试验主要包括 半数致死量 LD50 试验最大给药量试验最大耐受量试验近似致死剂量试验 一 中药新药急性毒性试验 定性观察 包括动物体重变化 饮食 外观 行为 分泌物 排泄物 动物异常反应的症状 起始时间 严重程度 持续时间 是否可逆以及动物死亡情况定量指标 半数致死量 LD50 近似致死剂量 ALD 最大耐受量 MTD 最大给药量 实验方法与结果 受试物受试物采用制备工艺稳定 符合临床试用质量标准规定的中试样品 注明名称 提供单位 批号 性状 含量 剂型 配制方法 保存条件等 如不采用中试样品 应有充分的理由 若由于给药容积或给药方法限制 可采用原料药进行试验 试验动物1 5类药至少必须用2种动物 啮齿和非啮齿 一般采用啮齿类和 或非啮齿类动物 雌雄各半 所用动物应符合国家有关药物非临床安全性研究的要求 如临床为单性别用药 可采用相对应的单一性别的动物 如受试物拟用于儿童 建议考虑采用幼年动物 中毒反应或死亡率与动物的性别有明显相关时 应选择性别敏感的动物进行复试 试验分组按性别 体重采用分区随机法分组除受试物不同剂量组外 还应设空白 和 或阴性 对照组 充分对照给药途径须与临床拟给药途径一致 若不同应充分说明理由 根据新药研究技术指南 需要进行两种给药途径试验的受试物 如临床为非血管内给药 另一给药途径采用静脉给药方式 如果因为制剂等原因不能采用静脉给药 应充分说明理由 给药容量经口给药前动物禁食不禁水过夜 大鼠给药容量每次一般不超过20ml kg 小鼠每次一般不超过40ml kg 观察期限一般观察14天 如观察时间不足14天 应充分说明理由 观察指标应定期记录动物的体重及耗食量 如有异常情况 应跟踪观察 给药当天 尤其是给药后4h内应严密观察记录 然后每天上 下午各观察1次 连续14天 包括动物体重变化 饮食 外观 行为 分泌物 排泄物 动物异常反应的症状 起始时间 严重程度 持续时间 是否可逆以及动物死亡情况 剖检 死亡动物应及时进行尸检 其他动物在观察期结束后 给药第15天 进行大体解剖 记录病变情况 当发现器官出现体积 颜色 质地等改变时则须进行病理检查并记录 半数致死量的测定剂量设定 根据预试结果所获得的0 和100 致死量范围内选用几个剂量进行试验 分4 6个剂量组 组距设计一般为0 65 0 85 用Bliss的方法求出LD50值及95 的可信区间 各剂量组的死亡率 若毒性反应有明显的性别差异 应求出不同性别的LD50 详细报告试验过程中动物出现的中毒表现及致死症状 综合评价受试物毒性大小 最大耐受量的测定剂量设定 根据预试结果在动物死亡的剂量下按等比级数设剂量组 可分2 5个剂量组 组距设计一般为0 65 0 85 最大剂量应有动物死亡 死亡率小于50 详细报告试验过程中动物出现的异常表现及致死症状 计算出动物总给予药量g kg 或以含生药量g kg表示 即动物的最大耐受量 评价受试物毒性情况 最大给药量的测定剂量设定 以允许并合理的最大浓度 最大容量单次或一日内2 3次给予动物 体重 雌雄分别进行组间比较 详细报告试验过程中动物出现的异常表现 计算出动物总给药量g kg 或以含生药量g kg表示 即动物的最大给药量 推算出相当于临床拟用药量的倍数 评价受试物毒性大小 犬急性毒性试验 近似致死剂量法 动物试验前隔夜禁食不禁水 根据小动物毒性实验 参照药物临床实验治疗使用量 估计可能引起毒性反应和死亡的剂量范围 按50 递增法 设计出含10 20个剂量序列表 以最大给药剂量预实验一条犬 根据情况完成下列步骤 若出现死亡或明显毒性反应 由剂量序列表中找出可能的致死剂量范围 在此范围内 每间隔一个剂量染毒一只动物 测出最低致死剂量和最高非致死剂量 然后用两者之间的剂量染毒一只动物 则此剂量即为近似致死剂量 若没有死亡或没有出现明显的毒性反应 则按照最大给药剂量实验放样观察药物的可能毒性反应 同时平行实验作为对照组 检测指标常规观察1中毒表现 犬给药后密切观察4个小时 此后每天上 下午各观察一次 连续观察14天 观察动物的体重变化 饮食 行为 分泌物 排泄物等 并记录中毒死亡时间 中毒反应起始时间 持续时间 恢复期是否可逆 动物最短死亡时间 最长死亡时间 平均死亡时间等 报告近似致死剂量和最大耐受剂量 2剖检 动物死亡应及时剖检 其他动物在观察期结束后进行大体解剖 记录病变情况 主要观察心脏 肺脏 肾脏 肝脏 脾脏 胃肠道等内脏 观察是否有出血点 水肿等异常情况 并作书面记录 当发现器官出现体积 颜色 质地等改变时须进行病理检查 对于创新药物 还可进行以下指标检测 体重 摄食量 体温 心电图等指标可酌情增加1 2次检测 二 中药新药长期毒性试验 对动物反复多次连续给药的毒性试验试验的目的1 反复多次给药的情况下 实验动物出现的毒性反应 量效关系 主要的靶器官 损害程度及其可逆性 2 获得反复给药情况下 实验动物能耐受的剂量范围及无毒性反应的安全范围 一般药物的长期毒性研究给药期限表 动物SPF级SD或Wistar健康大鼠 一般每组10 30只 若药物毒性大 或试验周期为6个月 每组应增加10只动物 6 9周龄 动物体重差异应在平均体重的20 之内 应有动物质量合格证书 试验周期3个月以上可选5 6周龄大鼠 每组雌雄各半 雌性应未孕 如临床为单性别用药 应采用相应的单一性别的动物 饲养管理饲料应有合格证 写明供应单位 批号 检测报告等 动物饲养应在取得实验动物使用许可证的动物房内进行 大鼠每笼不宜超过5只 雌雄分笼饲养 试验前适应性饲养 一般观察5 7天 应作好观察记录 受试物受试物一般为中试样品 应和药效 一般药理 急性毒性 药代动力学研究用药有相同的质量标准 如果由于给药容量或给药方法限制 可采用原料药进行试验 应有受试物名称或代号 提供单位 批号 保存条件 使用注意事项等 溶媒或赋形剂要注明批号 提供单位等 分组一般设高 中 低三个剂量组和对照组 对照组则给予相应的溶媒或赋形剂 若溶媒或赋形剂有毒性 则应增设空白对照组 蒸馏水 给药1给药途径1 1一般要求与临床给药途径一致 若不同则充分说明理由 1 2口服可采用直接灌胃给药 1 3临床静脉注射的药物采用静脉注射给药 特殊情况另作说明 大鼠长期毒性试验剂量设计低剂量原则上应高于动物药效学试验的等效剂量或预期的临床治疗剂量的等效剂量 高剂量原则上应使动物产生明显的毒性反应 甚至可引起少数动物死亡 高 低剂量组之间应再设一个中剂量组 对中药复方或其他特殊情况下 可采用长毒可允许的最大浓度和最大剂量作为高剂量 剂量设计参考方法临床剂量法 中药 天然药物的复方制剂多根据拟推荐临床剂量决定 一般3个月以上长期毒性 大鼠高剂量组原则上应使动物产生明显的毒性反应 甚至可引起少量动物死亡 低剂量组原则上应高于动物药效学试验的等效剂量或预期的临床治疗剂量的等效剂量 高 低剂量组之间再设一个中剂量组 此为最常采用的方法 最大耐受量法 MTD 新药研究可参考国外文献资料或最大耐受量决定 用一个最大耐受量 MTD 1 3MTD 1 10MTD分别为大鼠长期毒性试验的高 中 低三个剂量 最大浓度法 对毒性较低的中药可采用最大浓度法 以药物可进行顺利灌胃的浓度作为高剂量组的给药浓度 给药容量 给药容量一般为1 1 5ml 100g体重 次 若每天给药2 3次 每次给药容量可酌情减少 每周可根据体重情况调整给药量 一般以不等浓度等容量给药 给药频率 试验周期 3个月 每周7天连续给药 3个月 可考虑每周给药6天 每天给药时间应尽量保持一致 检测指标 一般观察外观体征和行为活动 流涎等腺体分泌 粪便性状与颜色 毛色 行为 给药局部反应 食量及体重变化 对死亡动物应进行系统病理学检查 血液学指标 10项 红细胞 网织红细胞计数血红蛋白血液学指标白细胞总数及分类血小板凝血时间 33 可编辑 血液生化学指标 15 16项 天门冬氨酸氨基转换酶 AST 丙氨酸氨酸氨基转换酶 ALT 碱性磷酸酶 ALP 血液生化尿酸氮 BUN 总蛋白 TP 主要指标白蛋白 Alb 血糖 ALU 总胆红素 TB 肌酐 Cr 总胆固醇 TC 谷氨酰转移酶 非啮齿类动物 特殊检查 可能引起眼 耳毒性的药物 应增加眼及耳毒性的检查 有些药物尚需研究对酸碱平衡 水盐代谢的影响 系统尸体解剖 脏器系数 10个 心 肝 脾 肺 肾 肾上腺 胸腺 睾丸 附睾 子宫 卵巢 脑组织病理学检查 34项 脑 脊髓 视神经 眼 垂体 心 肝 脾 肺 肾 肾上腺 甲状腺 睾丸 子宫等 注意事项大鼠在解剖与取血前禁食不禁水过夜 采血顺序 对照组 高剂量组 中剂量组 低剂量组各取一只 依次重复循环血清标本应避光保存 需要保存的血清 可在4 6 的冰箱中保存7天备用 7天后应放在 70 冷冻保存 低温下保存的标本不能在室温慢慢溶解 而应放在25 37 水浴中短时间快速溶解 充分混匀 标本应避免重复的冻结溶解 以免标本成分变化 采集的样本异常 应予以记录 检测时间 应于给药终期及恢复期结束时进行相关指标检测 或于给药中期增加1次指标检测 试验数据的统计 体重 耗食量 脏器指数依雌雄分别进行组间比较 结果与分析注意毒性反应出现的时间 恢复时间及动物死亡时间 对所获取的数据进行全面和科学的分析 对在背景数据范围以外的各实测值应在试验结果中详细列出 并予以合理的分析 应正确理解均值数据和单个数据的意义 并注重个体分析 同时结合其它相关安全性试验及药代 毒代动力学的结果进行分析 综合考虑数据的统计学意义和生物学意义 试验报告 试验报告应全面客观反映整个试验过程收集的原始资料和信息 犬长期毒性观察指标 一般状况观察每天根据体重给药并填写给药记录表应观察包括犬外观体征 行为活动 恶心呕吐 腺体分泌 呼吸 粪便 尿液 11项 摄食量 体重 给药局部及眼科反应等 每天应观察记录犬的一般状况 填写观察表 每周应固定时间测量1次犬体重及摄食量 心电图检查指标 导联心律 心率 PR间期 QT间期 QRS波群 T波等 眼科检查指标 角膜是否浑浊 虹膜有无充血 肿胀 结膜有无充血 水肿及分泌物 瞳孔对光反射是否正常 必要时检查眼底血管是否正常 检查结果记录在附表 2 其他情况 内 观察到有异常情况时详细记录 血液学指标应观察红细胞计数 网织红细胞计数 血红蛋白 白细胞计数及分类 血小板 凝血酶原时间等 必要时做骨髓涂片检查 犬长期毒性观察指标 系统尸解大体解剖 系统尸检应全面细致 解剖过程同大鼠大体解剖 称重并计算脏器指数的器官 组织病理学检查所有药物长期毒性均应进行给药部位及给药部位淋巴结的病理学检查 对照组 高剂量组及尸检异常时要详细检查 其它剂量组应取材保存 在高剂量组有异常时再进行检查 一般需进行病理组织学检查的组织或器官 详见下表解剖时肉眼可观察到的其他异常器官组织应做详细的病理组织学检查 应根据中药的性 味 功效 主治等情况增加相应的组织病理学检查 组织的病理学检查应根据药物的特点及国家规定的技术要求进行 三 中药新药免疫毒性研究技术要点 免疫毒性指外源性化合物对机体免疫系统的损伤作用 包括两类 免疫抑制免疫增强 型过敏反应试验主动皮肤过敏试验 ACA 主动全身过敏试验 ASA 被动皮肤过敏试验 PCA 试验一主动皮肤过敏试验 ActiveCutaneousAnaphylaxis ACA 动物 豚鼠阳性药 2 4 二硝基氯代苯 1 的致敏浓度和0 1 的激发浓度 试验方法 致敏 在第0 第7和第14天 以致敏剂量皮肤局部给药 致敏接触阶段应保证受试物在皮肤上的停留时间 6小时 激发 末次给受试物致敏后14天 再次将受试物涂于脱毛区激发 6小时左右后 观察72小时内皮肤过敏反应情况 记录各组各时间的平均分值 并按皮肤过敏反应评分标准进行评分 同时应密切观察动物是否有哮喘 站立不稳或休克等严重的全身性过敏反应出现 根据试验组和对照组动物皮肤反应的差别 判断受试物对皮肤过敏反应的性质 计算致敏发生率 将出现皮肤红斑 水肿或全身过敏反应的动物例数除以受试动物总数 试验二主动全身过敏试验 ActiveSystemicAnaphylaxis ASA 动物 豚鼠阳性对照组 1 5mg 只牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏阳性物质试验方法 每组动物数至少6只 低剂量组 临床最大剂量高剂量组 低剂量的数倍量 致敏 静脉 腹腔或皮下注射 隔日一次 共3 5次激发 末次致敏后第10 14日一次快速静脉内给药 剂量为致敏剂量的2 5倍 给药容积1 2ml观察每只动物的症状及体重 计算过敏反应发生率 试验三被动皮肤过敏试验 PassiveCutaneousAnaphylaxis PCA 动物 大鼠 小鼠 有时用豚鼠阳性对照 1 5mg 只牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏阳性物质试验方法 每组动物数至少6只 制备抗血清 低剂量组 临床最大剂量高剂量组 低剂量的数倍量 致敏 静脉 腹腔或皮下注射 隔日一次 共3 5次激发 末次致敏后10 14天左右采血 制备抗血清 放样 将上述各组抗血清用生理盐水稀释成1 2 1 8 1 32或合适的稀释度 在动物背部预先脱毛3 4cm2的皮内注射各对应组的抗血清0 1mL 经24或48小时后 各组静脉注射与致敏剂量相同的激发抗原加等量的0 5 1 伊文思兰染料共1mL 激发注射30分钟后麻醉处死各组动物 剪取背部皮肤 进行蓝斑的测定 可采用直接测定法或比色测定法 四 中药新药刺激性和溶血性研究技术要点 刺激性是指中药 天然药物制剂 包括活性成分和赋形剂 经皮肤 粘膜 腔道 肌肉 血管等非口服途径给药 经局部吸收或注射后对给药部位以及全身产生的毒性作用 包括血管 肌肉 粘膜等刺激性 溶血性是指中药 天然药物制剂 包括活性成分和赋形剂 产生的溶血或红细胞凝聚等反应 一 刺激性试验方法1 血管刺激性试验试验动物 家兔 动物数每组不少于3只 生理盐水或溶媒对照可采用同体左右侧自身对比法给药部位 选用耳缘静脉 多次给药一般不超过7天 单次给药刺激性试验 给药后48 96小时对动物和注射部位进行肉眼观察 多次给药刺激性试验 每天给药前以及最后一次给药后48 96小时对动物和注射部位进行肉眼观察 给药部位组织病理学检查 2 肌肉刺激性试验试验动物 家兔 也可选用大鼠生理盐水或溶媒作为阴性对照分别在左右两侧股四头肌内以无菌操作法各注入一定量的受试物 观察给药后不同时间注射局部肌肉反应情况 如充血 红肿 变性 坏死等 注射后48小时处死动物 解剖取出股四头肌 纵向切开 观察注射部位肌肉的刺激反应 并计算相应的反应级 并进行局部组织病理学检查 提供病理照片 3 皮肤刺激性试验试验动物 家兔 每组动物数4 8只 雌 雄各半 也可选用小型猪或其他种属的动物 设赋形剂或溶媒对照 采用同体左右侧自身对比法 将受试物0 5ml直接涂布于一侧已去毛的皮肤上 然后用二层纱布 2 5cm 2 5cm 和一层玻璃纸或类似物覆盖 再用无刺激性胶布和绷带加以固定 另一侧涂布赋形剂或溶媒做对照 贴敷时间至少4小时 贴敷结束后 除去受试物并用温水或无刺激性溶剂清洁给药部位 破损皮肤刺激性试验时在用药部位用砂纸磨或划 井 字并以渗血为度 单次给药在去药后30 60分钟 24 48 72小时观察 如延长不超过14天 多次给药皮肤刺激性试验应连续在同一部位给药 每次给药时间相同 贴敷期限一般不超过4周 末次去药后30 60分钟 24 48 72小时观察 如延长不超过14天 三 溶血性试验 体外溶血试验加样表 不同剂型的中药 天然药物试验项目的选择 静脉注射剂 血管刺激性试验 肌肉刺激性试验及溶血