【毕业学位论文】（Word原稿）马铃薯Y病毒CP基因不同区段对发夹RNA和人工的miRNA介导的病毒抗性的影响-生物化学与分子生物学

分类号： 授予学位单位代码： 10434 U D C： 密 级： 研 究 生 学 号 ： 東農業大學 博 士 学 位 论 文 马铃薯 Y 病毒 因不同区段对发夹 人工的导的病毒抗性的影响 P of NA 011 年 5 月 10 日 研 究 生 ： 学科专业 ： 生物化学与分子生物学 研究方向 ： 植物抗病毒基因工程 学院 ： 生命科学学院 指导教师 ： 教授 教授 论 文 提 交 日 期： 论 文 答 辩 日 期： 学 位 授 予 日 期： 学 科 门 类 答 辩 委 员会 主席： P of NA 2011 关于学位论文 原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文 纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到 中国学位论文全文数据库并向社会公众提供信息服务 。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导 师 签 名 日 期： 符 号 说 明 异 常 人工的 35S 花椰菜花叶病毒 35S 动子 羧苄青霉素 互补 查尔酮 合成酶 十六烷基 三甲基 溴化铵 焦碳酸二乙脂 双链 乙二胺四乙酸 酶联免疫检测 发夹 R: 反向重复 卡那霉素抗性 微小 （ 乙磺酸 磷酸盐缓冲液 源于病原物获得的抗性 转录后基因沉默 NA 依赖于 合酶 导的沉默复合体 导的病毒抗性 扰 十二烷基硫酸钠 小干扰 沉默 转录水平的基因沉默 目录 中 文 摘 要 . 1 英 文摘要 . 4 1 前 言 . 7 因沉默 . 7 默 . 8 干扰 . 8 小 . 9 联系 和区别 . 10 他 参与沉默的 小分子 . 11 默的作用机制 . 13 径 . 14 径 . 14 导的病毒抗性 . 15 导的病毒抗性的特点 . 17 导的病毒抗性是转录后基因沉默的结果 . 18 于 抗病毒策略 . 19 物抗病毒研究中高效的发夹 物表达载体的构建 . 20 结构 长度的影响 . 20 区域的影响 . 21 酸序列同源性的影响 . 20 录速度的影响 . 22 于 抗病毒策略 . 22 工 术的影响因素 . 23 列的设计与优化 . 23 然的 体的选择 . 24 铃薯 Y 病毒与抗病毒基因工程 . 24 研究的目 的及其意义 . 26 2 材料与方法 . 28 料 . 28 源 . 28 试植物 . 28 株、质粒 . 28 法 . 28 建含发夹结构的转基因植物表达载体 . 28 物表达载体的构建策略 . 28 增特异性引物设计 . 29 建 基因植物表达载体 . 30 物表达载体的构建策略 . 31 筛选 . 31 物的设计 . 31 增目的片段 . 32 的片段与克隆载体的连接 . 33 的片段和质粒 酶切 . 33 段的回收（试剂盒法） . 34 的片段与质粒 连接 . 34 受态细胞的制备 . 35 粒 大肠杆菌中转化（热激法） . 35 化菌落 定 . 35 粒 大量提取（碱性 ） . 36 组质粒的酶切鉴定 . 38 组质粒向农杆菌转化（冻融法） . 38 杆菌介导的瞬时侵染 . 38 杆菌介导的烟草转化 . 39 物总 提取（ ） . 40 基因植株的 测 . 40 基因植株的抗病性鉴定及 测 . 40 基因植株的抗病性鉴定 . 40 基因植株的 测 . 41 交分析 . 41 基因植株总 提取（ 步提取法） . 41 含有甲醛的凝胶上进行 泳 . 42 膜 . 42 针制备 . 43 记有效性检测 . 44 交 . 45 基因植株 提取及杂交分析 . 46 基因植株 提取 . 46 泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳） . 47 膜（电转膜）及固定 . 48 针的制备 . 49 交 . 49 3 结果与分析 . 50 向于 马铃薯 Y 病毒 因 不同区段的 导的病毒抗性 . 50 物表达载体的构建 . 50 P 不同区段正向和反向目的片段的获得 . 50 向目的片段与表达载体 的连接 . 51 向目的片段与重组中间载体的连接 . 51 杆菌介导的瞬时侵染验证 物表达载体的有效性 . 53 化 农杆菌 株 . 53 时表达靶向 P 的 检测 . 54 交检测瞬时侵染时靶 积累 . 55 基因烟草的获得 . 56 基因烟草的检测 . 57 基因烟草的抗病性分析 . 59 基因烟草的 交分析 . 63 基因 烟草植株中 杂交分析 . 64 2 代转基因植株的抗病性分析 . 65 工的 导的马铃薯 Y 病毒抗性 . 66 筛选及引物设计 . 66 南芥天然 体的克隆 . 66 向于 P 基因不同区段的 人工 达载体的构建 . 68 组表达载体的鉴定 . 68 杆菌介导的瞬时侵染检测 达载体的有效性 . 70 化农杆菌 株 . 70 时表达靶向 P 的 检测 . 70 交检测靶 积累 . 71 基因烟草的获得 . 72 基因烟草的检测 . 72 基因植株的抗病性分析 . 74 基因烟草的 交分析 . 77 基因烟草植株中 杂交分析 . 78 2 代转基因植株的抗病性分析 . 79 4 讨论 . 81 5 结论 . 89 参 考文献 . 90 致 谢 . 106 攻 读学位期间发表论文情况 . 107 山东农业大学博士学位论文 1 中文摘要 基因沉默是生物体长期以来形成的一种防御机制，阻止 外源基因、转座因子、病毒等外源核酸的侵入，保护生物基因组的完整性。 小干 扰 微小 两种序列特异性地转录后 基因表达的调节因子，是 沉默 入植物细胞的病毒基因组与转基因转录产物具有部分同源性，因此在 转录后基因沉默 所导致的 近乎免疫 ） 、抗性持久、生物安全性高等优点 。 在基因沉默的研究中 已 发现 “位置效应” 的存在 ， 能 受到靶序列所处的位置 影响。在 前尚未见有关“位置效应”的系统报道。 本研究以马铃薯 方式 构建 体，系统性的比较 寻找引发基因沉默的有效片段及更好利用 研究结果和主要结论如下： （ 1） 马铃薯 Y 病毒 因不同区段对发夹 导的病毒抗性的影响 将 P 基因人工的划分为 16 段各 50区段。 通过 增，得到相应的不同区段的正向和反向的片段 ， 通过酶切连入植物表达载体 中 ； 热 激 法转化大肠杆菌 筛 选 并 获得 构的 植 物 表 达 载 体 用 成功 构建的 16 个植物表达载体（ 另外 8 个为吴斌构建）瞬时侵染本生烟 验证其有效性 ， 果 显示 ， 16 个植物表达载体均能在植物体内成功表达产生 瞬时表达的 有效地下调靶基因 P 的表达 。 将构建的 8 个 植物表达载体利用冻融法 导入农杆菌 叶盘法转化烟草经卡那霉素抗性筛选和 测 确定 转基因植株。 转基因植株自交， 种子置于 含卡那霉素的筛选培养基上 进 行 筛选 ，共 得到 的 50 株、62 株、 56 株、 55 株、 45 株、 63 株、 72 株 和 55 株 转基因植株。 抗病性分析 发现除了转基因株系 获得抗性植株外，其余 12 个转基因株系中抗性植株的比例分别 为 马铃薯 Y 病毒 因不同区段对 发夹 人工的 导的病毒抗性的影响 2 结果 表明 在利用 导的抗 毒的研究中，以 P 基因上的 50列为茎 足以介导宿主植株的基因沉默的产生， 但 由于 位置的 差异 产生不同的抗病效率 ， 靶向于 3端 段 表现最高水平的抗性 ； 且 以 因 3端为靶序列的 5端 为靶序列的植株 更能有效地介导对 抗性 。 转基因植株的 交 分析表明，转基因都在 平上得到了表达， 抗病植株中 积累量明显低于同类型的感病植株，抗性与 累量呈负相关 ， 证实 病毒抗性是由 导的；对转基因植株的 达量的分析 ， 表明 植株对 病毒的敏感程度与 累量之间没有明显的相关性。 对 的转基因植株的抗病性分析结果发现， 几乎 所有的 抗性转基因植株的后代均表现很强的抗病毒侵染能力， 说明由 导的 性在 植株中能够稳定遗传。 （ 2） 马铃薯 Y 病毒 因不同区段对人工的 导的病毒抗性的影响 以 P 基因 的全长 列 为靶基因， 根据 特征选取 8 个不同的位置， 、 和 为靶区。 选用 拟南芥 体 作 为 达的 骨架， 通过 增的方式 替代 掉 原有的 具有生物学功能的 得到含有 段 。将扩增 产物 连入 植物表达载体 。 热 激 法转化大肠杆菌 筛选并获得重组 表达载体 用构建的 达 载体瞬时侵染本生烟， 证其有效性， 结果 显示 ， 8 个 物表达载体均能在植物体内成功表达 瞬时表达的有效地下调靶 P 基因的表达 。 将成功构建的 达载体 利用冻融法导入农杆菌 叶盘法转化烟草 生植株经卡那霉素抗性筛选和 测 确定为转基因植株。 自交 后 ，经卡那 霉素 筛选和 定 ， 分别获得 转基因植株 98 株、 96 株、 114 株、 116 株、 117 株、 111 株、 110 株 和 116 株。 抗病性 结果显示，表达 靶向于马铃薯 Y 病毒 因的 基因植株能介导对马铃薯 Y 病毒的抗性 ，抗性比例分别为 针对马铃薯 Y 病毒 因不同区段设计的 转基因植株所 介导的抗山东农业大学博士学位论文 3 病 性 效果 之间 存在差异， 靶向于 3端的 能 表现更高水平的抗性。 转基因植株的 交 分析表明，转基因都在 平上得到了表达， 且植株的 抗性与转基因的表达量成负相关，表明 导的病毒 抗性是由 导的。对转基因植株的 析，结果显示，所有抗病转基因植株中 都有 在，且植株的抗性与 表达量成正相关。 对 的转基因植株的抗病性分析结果发现，所有的抗性转基因植株 的后代都表现高的抗病率 ，表 明由 导的 性 在 植株中