微透析技术在中医药研究中的应用.doc

微透析技术在中医药研究中的应用微透析技术的发展及应用现状微透析(Microdailysis，MD)一词起源于上个世纪50年代后期，为一种新型的生物采样技术，最初主要用于脑部采样，来研究脑内神经递质的释放。微透析不同于以往传统的研究手段,是一种从生物活体内进行动态微量生化取样的新技术。动态：传统的采样方法是在一定时间点处死一批实验动物取血或脏器进行分析，首先样本过大，这会造成实验动物的大量浪费，其次由于实验动物的个体差异，会使实验中的误差过大；而微透析技术可以在同一只动物身上连续动态采样，而且可以在同一只动物的不同组织中植入探针，从而在同一只动物身上同时测定不同的药动学指标，既减少实验动物的用量，节省经费，又使实验中的误差减小。生物活体：取样中的动物可以是麻醉的，也可以是清醒的，因而获得的样品接近生物的正常生理情况，使获得的数据更加的精确、可靠。微量：传统采样方法是抽取拟定时间点动物的全血或其他体液，势必会影响实验动物的体液进而影响药物在体内的药动学行为；而微透析技术是以透析原理为基础，收集拟定时间段内的透析液进行分析，取样量极微小，一般是以L为单位的，不会影响实验动物的体液，因而使测定的药动学参数更加准确、客观。1、微透析技术的发展历史微透析(Microdailysis，MD)一词起源于上个世纪50年代后期，1958年Kslant首次用于描述一种同时透析和提取血液中的极性类固醇的方法。1961年Gaddum发明了推拉式灌流取样技术并应用于监测脑细胞外神经化学物质,之后这项技术得到许多改进，曾广泛应用于脑中许多部位的神经递质的检侧。1966年，Bito等首次报道了利用半透膜对狗血液和脑细胞外液中的游离氨基酸和其他电解质进行了采样。1972年，美国耶鲁大学Delgado等首次利用脑微透析推挽灌流技术研究恒河猴脑内神经递质多巴胺的释放实验，开辟了脑微透析技术在神经科学和脑部研究领域的先河。1974年，Ungerstedt等首次建立了在体微透析技术，即把微透析技术用于活体的动物身上。到20世纪80年代中期，随着微透析技术的日臻成熟及各种分析检测手段的发展，微透析技术开始广泛应用于研究药物在体内组织中的分布和代谢。目前，微透析技术在中医、中药以及针灸研究域发挥着重要的作用。2、微透析技术的组成和原理简单地说，微透析技术的原理就是创造一个“人造血管”,使待测化合物在浓度差的作用下扩散而出入此“人造血管”，即从高浓度到低浓度。人造血管中我们通入的是一种人造透析液，其组成与体内的组织细胞间液接近，如果药物给入生物体，分散在组织细胞间液中，那么组织细胞间液的浓度要高于人造血管中的透析液的浓度，药物由高浓度到低浓度扩散进入人造血管中，我们将其中的透析液取出，即可达到一个取样的目的，相反若将药物加入透析液当中，透析液的浓度即高于细胞组织间液的浓度，药物由人造血管中扩散到组织中，也可达到一个给药的目的。 微透析系统一般由微量注射泵、连接管、灌流液、微透析探针和收集器组成。下面用一个动画具体介绍一下实验过程。首先在生物组织中植入一个具有半透膜的探针装置,这个探针就相当于我上面说的人造血管，探针上的透析膜只可透过水和小分子物质，大分子物质因受到膜屏障的阻碍作用不能通过，探针上接两根连接管，一根进液管，一根出液管，进液管一端连接一部非常精细的微量灌流泵以一定的速度推送灌流液流经探针，组织细胞外液中的小分子游离药物会沿浓度梯度扩散进入探针，而与大分子蛋白结合后的药物及其它大分子化合物因受到膜屏障的阻碍作用不能通过透析膜，药物的这种扩散会达到一个动态平衡，然后被管内连续流动的灌流液不断带出,出液管的另一端连接一个收集装置，设定后可收集一定时间段内的透析液，从而达到从活体组织中取样的目的。且采集到的透析液中由于膜的屏障作用只含有游离药物，可直接用HPLC进样分析，避免了匀浆、除蛋白、萃取等处理，既简化了实验步骤，也降低了实验误差。3、探针是核心刚才说微透析系统是由微量注射泵、连接管、灌流液、微透析探针和收集器组成。微透析探针是核心部件,是最关键部分，通常是由一管式透析膜装于由钢、石英毛细管或塑料制成的双层套管构成。透析膜是一种可对一定分子量物质进行截留的膜，一般由聚丙烯腈、氨基纤维素、纤维素等制成，这些物质有较好的生物相容性和稳定性，不与体内成分发生反应；其截留物质分子质量为5000-10000Da（道尔顿）不等。解释一下这个截留分子量：透析膜制作技术是用激光在膜上面打上数个微小的孔，截留分子量是这些孔的截留分子质量，而孔是圆的，5000Da截留分子量的这个孔，不是说小于这个分子量的物质都能过去的，像4999这个分子量的物质，只有是正正好好地圆球形才能通过膜，但这是不可能的，因为物质分子都是有一定空间结构的，说是5000-10000Da，实际上只有分子量小于1000的小分子物质才能通过，像一般我们所研究的药物的成分都是小于1000的小分子物质，所以完全可以透过透析膜的。常用的探针类型主要有以下几种：（1）同心圆探针主要是一个同心套管，透析膜在套管的顶端。灌流液在里面的管子里流动，通过透析膜，达到采样点。主要用于脑部取样，也有报道用于眼部取样。（2）柔性探针弥补了探针的刚性问题。这种探针由覆盖了半透膜的熔融硅管组成，主要用于血液取样。（3）线性探针主要被用于对肌肉、皮肤、肝脏和肿瘤等外周组织中的药物取样。线性探针对于研究经皮给药，比通过采血测定简单、直接、准确。（4）分流探针分流探针是将一个线性探针装入一段塑料管而制得的，可用于流体的不间断取样，主要用于胆汁取样。世界上生产微透析探针最好的公司是瑞典的CMA公司，该公司主要产品为微透析探针及其设备，是一家历史悠久且以研究为导向的高科技公司。另外瑞典的MAB公司也是一家生产微透析探针的较好的公司，实际上MAB公司是由CMA公司的几个员工跳槽出来自己组建的公司，他们的技术同CMA公司是一样的，但生产水平较CMA公司还是差一点，但他们的探针的价格相比CMA公司要低。除了这两家公司外，日本的株式会社和美国BAS公司也有生产微透析探针，但技术相对较差。目前，这CMA公司和MAB公司基本已经垄断世界上微透析探针的生产，我国国内也有人自制微透析探针，但其技术远比不上进口探针，主要技术就差在激光打孔上，且探针的回收率使用率均较低。目前世界上微透析探针的价格，去年买CMA是2500RMB 3根，MAB是600RMB一根。4、微透析技术在中医药研究中的应用4.1微透析技术在中药药效学与药动学中的应用（1）药效学研究在利用微透析技术在监测血液或组织中药物浓度的同时,观察药效方面的改变会有助于探讨药物作用的机理,如受体定位,配体亲合力强度,药物对递质、激素释放与再摄取的影响等。这方面的报道目前还较少，有待于进一步研究。微透析技术现在国内外应用较多，技术较成熟主要是在药动学方面。（2）药物动力学研究在体微透析取样技术在中药的药物动力学研究中,尤其是研究观察药物转运、分布、游离药物浓度方面具有独特的优点。药物在体内的药动学过程是通过研究体液中药物浓度与时间的变化进行的,其中采样环节是药动学研究中的关键环节。目前,常规的采样方法是由动物血管抽取全血处理后进行样品分析或处死动物取组织匀浆后处理分析,而微透析则是新兴的用于药动学研究的采样技术。微透析技术克服了传统采样方法中的种种弊端。第一，传统采样方法是抽取拟定时间点动物的全血或其他体液，势必会影响实验动物的体液进而影响药物在体内的药动学行为；而微透析技术是以透析原理为基础,收集拟定时间段内的透析液进行分析，不影响实验动物的体液，使测定的药动学参数更佳准确、客观。第二，传统的采样方法是在一定时间点处死一批实验动物取血或脏器进行分析，造成实验动物的大量浪费，而且由于实验动物的个体差异，使实验中的误差过大；而微透析技术可以在同一只动物身上连续动态采样，而且可以在同一只动物的不同组织中植入探针，从而在同一只动物身上同时测定不同的药动学指标，既减少实验动物的用量，节省经费，又使实验中的误差减小。第三，传统的采样技术所得到的样品如血液及匀浆液等需要去蛋白、萃取等处理，在除蛋白的过程中势必会使检测成分有所损失，使实验误差增大；而微透析技术所采得的透析液均为可透过透析膜的小分子物质，可直接用HPLC进样分析，从而减少了实验步骤及其所引入的误差。第四，由于只有游离态的药物才能发挥药效，而传统采样方法所采得的样品多是总药物浓度，不能准确反映发挥药效的药物浓度；而微透析技术采得的是游离态的药物浓度，更能准确反映发挥药效的药物浓度。 具体在实验方面体现为：脑部微透析用于研究活体动物在生理和病理情况下,药物脑内分布、药物透过血脑屏障情况及监测脑内药物有效活性物质和神经递质变化的有效方法；组织和血液微透析用于研究药物在体内的吸收、分布和代谢情况，组织包括肌肉、皮肤、肝脏、肿瘤等。近年来，血液微透析和皮肤微透析在中药药代动力学研究中应用较多，血液微透析可全面监测血液中药物浓度的变化，经皮微透析可以对实验动物或人体皮肤组织进行在体、连续的药物浓度测定，使得在体研究外用经皮吸收制剂的动力学和生物等效性成为可能。利用微透析技术进行动物试验，主要是在被限制动物或在麻醉动物身上，也可以用在自由活动的清醒动物身上，不过需要设计能供动物自由活动的光感应笼。（3）微透析技术在中医藏象和针灸治疗方面均有研究。（4）微透析技术在临床医学方面的应用（5）微透析技术还可作为一种给药途径,可将药物缓慢、直接地作用于靶器官,提高药效分析及药物动力学研究水平并且由于避开了血脑屏障和胎盘的阻隔,可直接观察药物对脑及胚胎的影响。4.2微透析技术在中药有效成分筛选中的应用随着现代分析技术的不断发展，有人提出将微透析技术应用于中药有效分的筛选。传统的有效成分研究方法从植物化学成分分析开始，分离出各种单体，选择、设计几种较能够反映中药药效的药理模型，进行有效成分的筛选。将获得的单体化合物与原药材总提取物、有效部位进行对比药理试验，阐明有效成分。这种方法虽在中药的现代研究中起到了很大的作用，但也存在明显的不足之处，最大的缺陷就是与中医理论的“整体观”和中药的特点相悖。中药是个多成分、多靶点、非线性多元体系，所含成分极其复杂，要想将其成分逐一地弄清楚，再进行药效、药理学研究，几乎是不可能的。更何况单一成分并不能代表该药的全部疗效。人为设定的非生物态成分提取分离模式，极有可能使那些含量甚微又难于分离的活性成分在分离途中丢失，且丢失了也难于察觉。事实证明中药现行质量标准中所谈及或测定的所谓“有效成分”多为主要药物的主要成分或指标成分，并无充分依据证明其为有效成分。中药给药后，经吸收、分布、代谢，生成一种由中药固有成分及其代谢产物组成的混合物，有的直接被排泄，有的被选择性吸收，经肝酶作用进人血液，通过血液运输到各个器官组织或靶点，并在达到一定的血药浓度时才能真正起效。可见，不论中药含有多少成分，只有进人血液或到达各个器官组织的成分才有可能成为有效成分。如果从人体对药物的作用这个角度来考虑有效成分的筛选方法，有可能把以往无限庞大的有效成分筛选工作变得相对的简单。目前，绝大多数中药及复方仍然采用传统的口服给药的方式，口服中药后的血液和各个器官组织细胞外液中含有真正的有效成分，即原形成分、代谢产物及机体产生的应激性成分。因此，通过分析口服给药后血液和各个器官组织细胞外液中的成分，确定中药及复方的体内直接作用物质，将成为快速、准确的研究确定中药药效物质基础的有效途径。微透析作为一种操作简单、组织损伤小、可实现在线分析的持续在体取样技术，能有效解决上述问题。取样时，首先在脏器组织或血液中植人具有半透膜的探针，微量灌流泵使灌流液以一定的流速流经探针，灌流液和细胞外液中待测物质达到一个动态平衡。待测物质被微透析管内连续流动的灌流液不断带出后储存在样品收集器中，通过分析透析液，就可以了解细胞外液中的外来成分及其浓度和代谢变化;出导管也可以在线连接高效液相色谱仪(HPLC)、高效毛细管电泳(HPCE)、质谱(MS)等检测仪器，直接进行在线检测，从而找出中药在体内分布的确切有效成分，最终实现对中药有效成分的筛选。通过微透析技术以及与现代分析技术的联用来分析给药后血液和各个器官组织细胞外液中的成分，确定中药在体内直接作用物质的思想，不仅体现了中医中药的理论特色，而且能较真实反映中药作用多成分、多靶点特点，较好地克服了目前中药有效成分研究中的缺陷。因此，微透析技术在中药有效成分筛选领域中的应用前景是十分广阔的，不失为一种很好的手段。目前还没有这面的理论研究以及相关报道，但是由于其具有众显而易见的优点，能克服当前许多中药有效成分究方法的不足。因此，微透析技术在中药有效成分筛选中的应用前景是十分乐观的，它为中药有效成分筛选提供了一个新的研究思路和方法，为创新中药的质量控制体系提供一种技术手段，同时也为阐明药物的作用过程、机理以及靶向性提供依据。随着微透析技术的不断发展和延伸，它必将给药学工作者在中药有效成分筛选研究领域中开辟出一片更为广阔的天地。5、微透析技术的优点与传统的体内药物分析取样方法如血液或组织匀浆取样等方法相比，微透析取样技术具有以下显著优势：5.1直接在作用部位取样，从而提供更多有关作用部位的真实信息，克服了以往血液或组织匀浆取样只能反映药物在体内的笼统信息的缺点;5.2可根据待测物质的分子量来选择不同的透析膜，从而使样品不含蛋白质、酶等大分子物