纳米制剂载体材料DSPEPEG的药代动力学研究VIP

纳米制剂载体材料DSPEPEG的药代动力学研究 分分类号R969.1单位代码10183研究生学号xx341044密级公开吉林大学博士学位论文纳米制剂载体材料DSPE-PEG的药代动力学研究Pharmacokiic study of nanocarrier material DSPE-PEG作者姓名宿宿崇专专业药理学研究方向药物代谢动力学学指导教师顾景凯教授培养单位生命科学学院20199年年33月纳米制剂载体材料DSPE-PEG的药代动力学研究Pharmacokiic study of nanocarriermaterial DSPE-PEG作者姓名宿崇专业名称药理学指导教师顾景凯教授学位类别医学博士论文答辩日期年月日授予学位日期年月日答辩委员会组成姓名职称工作单位主席景遐斌研究员中国科学院长春应用化学研究所委员潘卫三教授沈阳药科大学药学院方亮教授沈阳药科大学药学院聂广军研究员中国科学院国家纳米科学中心谢志刚研究员中国科学院长春应用化学研究所I吉林大学博士(或硕士)学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。 除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名日期年月日II关于学位论文使用授权的声明本人完全了解吉林大学有关保留、使用学位论文的规定，同意吉林大学保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权吉林大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 （保密论文在解密后应遵守此规定）论文级别硕士博士学科专业药理学论文题目纳米制剂载体材料DSPE-PEG的药代动力学研究作者签名指导教师签名年月日作者联系地址（邮编）吉林省长春市前进大街2699号，吉林大学前卫南区生命科学楼332室 （130012）作者联系电II中国优秀博硕士学位论文全文数据库投稿声明研究生院本人同意中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程的内容，愿意将本人的学位论文委托研究生院向中国学术期刊（光盘版）电子杂志社的中国优秀博硕士学位论文全文数据库投稿，希望中国优秀博硕士学位论文全文数据库给予出版，并同意在中国博硕士学位论文评价数据库和KI系列数据库中使用，同意按章程规定享受相关权益。 论文级别硕士博士学科专业药理学论文题目纳米制剂载体材料DSPE-PEG的药代动力学研究作者签名指导教师签名年月日作者联系地址（邮编）吉林省长春市前进大街2699号，吉林大学前卫南区生命科学楼332室 （130012）作者联系电V纳米制剂载体材料DSPE-PEG的药代动力学研究摘要纳米制剂是目前在国内外被广泛研究的一种特殊制剂，但是由实验室向临床转化的失败率较高，目前认为纳米制剂“药物代谢动力学行为差，药代评价体系不精准”是导致失败率高的主要原因。 现如今纳米制剂药代动力学研究内容主要针对于载药纳米制剂和游离药物，而纳米制剂载体材料在体内的药代动力学行为却常常被忽视。 纳米制剂载体材料占据了纳米制剂结构的绝大部分，主导了纳米制剂在机体内的命运，此外，作为外源性物质，纳米制剂载体材料也有可能导致严重不良反应事件的发生，所以揭示纳米制剂载体材料的药代动力学行为，对于纳米制剂的体内命运研究以及安全性和有效性评价均具有重要意义。 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)是一种应用广泛的纳米制剂载体材料，它能够对纳米制剂进行PEG化修饰，进而改善纳米制剂的物理化学和药代动力学性质，至今已有多种以DSPE-PEG作为结构材料的纳米制剂被批准上市。 然而，迄今为止尚无任何DSPE-PEG药代动力学信息的相关报道，导致这一现状的主要原因有两点1）研究者们忽视了纳米制剂载体材料药代动力学研究的重要性；2）DSPE-PEG具有多分散性，体内定量分析难度大。 为了更深刻地了解DSPE-PEG纳米制剂在体内的命运，推动纳米制剂的发展，本文以目前最常用的DSPE-PEG2000与DSPE-PEG5000为例，首次建立了DSPE-PEG在生物样品中的定量分析方法，并将其应用于药代动力学研究。 （1）DSPE-PEG2000与DSPE-PEG5000的质谱规律解析应用高分辨飞行时间质谱（Q-Q-TOF）探究了DSPE-PEG2000与DSPE-PEG5000的质谱规律。 观察TOF MS全扫描质谱图可以发现，DSPE-PEG2000与DSPE-PEG5000的分子量呈多分散状态，且分别以大约3000Da和6000Da为总体均值呈正态分布。 在质谱检测过程中发现，DSPE-PEG2000主要呈M+2H2+和M+3H3+电荷状态，DSPE-PEG5000主要呈M+4H4+、M+5H5+和M+6H6+电荷状态，CE（Collision energy，碰撞能量）与DP（Declustering potential，解簇电压）会影响DSPE-PEG在质谱检测过程中的电荷分布。 随着CE与DP的增大，DSPE-PEG向低电荷状态分布。 在质谱裂解实验中发现，DSPE-PEG2000与DSPE-PEG5000具有相似的质谱裂解规律，DSPE V部分与PEG部分均会在CE的作用下产生相应的特征性碎片。 DSPE部分产生的主要特征碎片离子为m/z607.56,PEG部分产生的主要特征碎片离子为m/z89.06，133.08，177.11，221.14，265.19，309.19系列，以及m/z59.05，103.07，147.10，191.13，235.15系列。 在DP作用下，DSPE-PEG的DSPE结构会发生源内裂解，并产生特异性碎片m/z607.56。 DSPE-PEG的质谱规律解析为后续LC-MS定量分析方法的建立奠定了理论基础。 （2）DSPE-PEG2000与DSPE-PEG5000的药物动力学研究建立了DSPE-PEG2000与DSPE-PEG5000在大鼠血浆中的提取方法及LC-MS检测方法，根据FDA指导原则对方法进行了验证，并应用该方法对DSPE-PEG2000与DSPE-PEG5000在大鼠血浆中的药物动力学进行了研究。 结果表明通过尾静脉注射给予SD大鼠25mg/kg DSPE-PEG2000后，DSPE-PEG2000的药时曲线下面积AUC(0-t)为104.913.4?g/mL*h；零时血药浓度C0为83.64.2?g/mL；消除半衰期t1/2为0.9810.078h；表观分布容积V d为0.3270.062L/kg。 通过尾静脉注射给予SD大鼠25mg/kg DSPE-PEG5000后，DSPE-PEG5000的药时曲线下面积AUC(0-t)为271.814?g/mL*h；零时血药浓度C0为104.813.6?g/mL；消除半衰期t1/2为1.540.339h；表观分布容积V d为0.1980.038L/kg。 根据药代参数推测，DSPE-PEG2000与DSPE-PEG5000可能主要分布于细胞外液，不易进入细胞内，且DSPE-PEG2000在大鼠体内的分布程度大于DSPE-PEG5000。 另外，DSPE-PEG2000在大鼠体内的消除速率大于DSPE-PEG5000。 （3）DSPE-PEG2000与DSPE-PEG5000的组织分布研究建立了DSPE-PEG2000与DSPE-PEG5000在大鼠组织样品中的LC-MS定量分析方法，并对该方法进行了方法学验证。 应用所建立的分析方法，对DSPE-PEG2000与DSPE-PEG5000在大鼠体内的组织分布情况进行了研究。 结果表明尾静脉注射给予SD大鼠25mg/kg DSPE-PEG2000或DSPE-PEG5000后，二者在肺脏中的分布浓度最高，提示DSPE-PEG可能对肺功能造成影响；DSPE-PEG2000与DSPE-PEG5000在肝脏中也有较高的分布浓度，提示DSPE-PEG可能影响肝微粒体酶活性，进而引发材料-药物之间的相互作用；DSPE-PEG2000在脾脏当中消除速率较慢，可能引发蓄积毒性；DSPE-PEG2000VI与DSPE-PEG5000可能够透过血脑屏障，进入脑组织，且DSPE-PEG5000在脑组织中的消除速率较慢，提示DSPE-PEG可能影响中枢神经系统功能；在脂肪组织当中，DSPE-PEG2000的浓度明显高于DSPE-PEG5000，这可能是DSPE-PEG2000的亲脂性大于DSPE-PEG5000所导致的。 （4）DSPE-PEG2000与DSPE-PEG5000的代谢与排泄研究尾静脉注射给予SD大鼠25mg/kg DSPE-PEG2000或DSPE-PEG5000后，收集粪便与尿液样品，应用LC-Q-TOF对样品进行全扫描分析，进而鉴定代谢产物。 结果表明DSPE-PEG2000在大鼠体内会被代谢为一系列不同聚合度的PEG分子，其分子量范围在500Da到2000Da之间；DSPE-PEG5000在大鼠体内也会被代谢为一系列不同聚合度的PEG分子，其分子量范围在500Da到5000Da之间。 选择DSPE-PEG2000与DSPE-PEG5000的主要代谢产物PEG2000与PEG5000作为目标化合物，建立了二者在粪样与尿样中的LC-MS/MS定量分析方法，并将该方法应用于排泄研究。 结果表明肾脏为代谢产物PEG2000和PEG5000的主要排泄途径，二者168h内在尿液与粪便中的总累积排泄率分别为28.02%与49.15%。 （5）DSPE-PEG2000与DSPE-PEG5000对人肝微粒体CYP450酶抑制作用的研究本文建立了7种关键CYP450酶（CYP1A 2、CYP2B 6、CYP2C 8、CYP2C 9、CYP2C 19、CYP2D6和CYP3A4）特征性探针代谢产物的LC-MS/MS定量检测方法，并应用其探究了DSPE-PEG2000与DSPE-PEG5000对7种不同亚型CYP450酶的抑制作用。 研究结果表明，DSPE-PEG2000与DSPE-PEG5000不会对以上7种关键肝微粒体酶造成明显的抑制作用。 因此，DSPE-PEG2000与DSPE-PEG5000通过抑制CYP450酶的活性，进而与药物发生相互作用的可能性较低。 据统计，2018年全世界癌症新增病例数量约为1810万，癌症致死病例数量约为960万。 其中，肺癌患者所占的比例最大（约占癌症新增病例的11.6%，癌症死亡病例的18.4%），其次为乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌和肝癌2。 癌症的有效治疗一直是全世界都在共同关注的一个重大医学难题。 在医学领域中，癌症即为恶性肿瘤的总称3。 肿瘤是指机体在各种致瘤因素的作用下，组织细胞在基因水平失去了对细胞增殖的正常控制，从而导致细胞异常增殖分化所产生的新生物。 恶性肿瘤形成后，不会因致病因素的消除而停止生长和分化，反而会失去生理调节进而破坏正常组织与器官4。 与健康细胞相比，恶性肿瘤细胞分化不完全，大多不成熟，且具有不同的形态。 恶性肿瘤表面通常没有薄膜包裹，以向周围浸润扩散的方式生长，且生长速度较快。 恶性肿瘤生长到一定程度后，会出现表面破溃、糜烂出血、渗出异味液体等现象。 恶性肿瘤细胞还能够随着淋巴液或血液扩散到身体的其他部位，发生肿瘤转移现象，进而引发机体出现贫血、无力、消瘦、发热、食欲不振、内脏器官损伤等症状，最终危及人的生命。 到目前为止，临床常用的癌症治疗手段主要包括手术法、放射疗法和化学药物疗法，其中化学药物疗法是癌症治疗过程中最重要的综合手段5。 然而，大多数用于治疗癌症的化学药物具有溶解性差，半衰期短等缺点，而且化疗药物直接进入体内后主要分布于正常组织，只有少部分（2-5%）能够作用于肿瘤组织1，呈现出靶向性差的特点。 因此，化疗过程当中经常伴随着较强的毒副作用，主要表现为嗜中性粒细胞减少、疲劳、炎症、腹泻、呕吐、脱发等6-8。 另外，在临床治疗过程当中，人们还发现肿瘤组织对化学药物存在多药耐药现象（Multidrug resistance，MDR），长期用药后，化疗效果会大幅下降，这为癌症的治疗造成了巨大的障碍9,10。 为了提高化学药物的疗效，并降低其毒副作用，医学工作者尝试对化学药物的剂型进行改造，其中纳米制剂的研究最为广泛，而且临床效果也最为突出，为癌症的攻克带来了新的希望。 纳米制剂是指通过药剂学手段所制备出的粒径尺寸在纳米范围（1-200nm）内的新型制剂11，它能够利用正常组织与肿瘤组织之间的微妙差异，实现抗肿瘤第1章绪论7药物的靶向递送12,13。 在过去的二十年中，纳米技术在药物递释系统研究领域取得了巨大的进步，为药物制剂的发展提供了新的方向14,15。 在健康组织当中，毛细血管内皮细胞之间缝隙致密，因此纳米制剂很难穿过血管壁进入到组织细胞当中发挥作用；肿瘤组织中，毛细血管内皮间隙较宽，结构完整性差，纳米制剂能够通过血管向组织内渗透并蓄积，这种现象被称为肿瘤的增强通透性和滞留效应，简称EPR效应（enhanced permeabilityand retentioneffect,EPR）16。 因此，纳米制剂能够有选择性地将化学药物递送到癌症组织或细胞，具有良好的靶向性。 纳米制剂还具有较大的表面积-体积比，这能够提高药物与机体之间的有效接触面积。 此外，纳米制剂可以通过缓释作用实现药物在体内的长循环，大大延长药物的半衰期。 这些优异的性质能够降低化学药物的给药剂量，实现减毒增效的目的17,18。 纳米制剂表面的化学性质是可以被修饰的，这为化学药物的释放调控提供了可能，进一步增强了药物的靶向性19。 另外，有学者认为，纳米制剂能够避免化学药物与癌细胞表面的MDR受体结合，从而消除癌症治疗过程当中出现的MDR效应20。 因此，纳米制剂的发展对于提高化疗药物的有效性和安全性至关重要。 目前，常用的纳米制剂有脂质体、聚合物胶束、高分子聚合物偶联药物、高分子聚合物纳米粒、固体脂质纳米粒、金属纳米粒、硅纳米粒以及碳纳米管等（图1.1）21。 吉林大学博士学位论文8图图1.1纳米制剂种类1.2纳米制剂载体材料药代动力学近年来，世界各国在抗肿瘤纳米制剂研发领域投入了大量的精力和资源，并且已有数千篇相关论文发表，但经批准上市的抗肿瘤纳米制剂却屈指可数18。 至今，约有95%的纳米制剂进入临床试验后，因为有效性与安全性等问题而被淘汰，除去人与实验动物之间存在较大的种属差异外，目前认为纳米制剂“药物代谢动力学行为差，药代评价体系不精准”是纳米制剂由实验室向临床转化(Bench toBedside)失败率高的主要原因。 药物代谢动力学（Pharmacokiics，PK）是药理学的一个重要组成部分，是定量研究药物在机体内的吸收（absorption）、分布（distribution）、代谢（metabolism）与排泄（excretion）过程（ADME,图1.2），并应用数学原理和方法阐述药物在体内动力学规律的一门学科。 药代动力学还涉及药物在体内的生物转化过程，以及药物与体内代谢酶之间相互作用的研究。 药物的毒性与药效主要取决于药物及其代谢产物在体内各部位的药物浓度，而药物浓度主要取决于给药第1章绪论9剂量和药物在体内的ADME过程，因此药物的毒性及药效与药代动力学行为之间存在重要的联系22。 药代动力学研究结果能够为药物的药效和毒性评价提供理论依据，为药物研发和临床用药方案设计提供指导。 药代动力学研究是药物临床前和临床研究的重要组成部分23,24。 图图1.2药物在体内的ADME过程纳米制剂进入体内后至少存在三种形态，即载药纳米制剂、游离药物（纳米制剂系统释放出来的药物分子）以及解离的纳米制剂载体材料（图1.3）。 由于药物是纳米制剂发挥药效的物质基础，因此目前纳米制剂药代动力学研究内容主要针对于载药纳米制剂和游离药物，而纳米制剂载体材料在体内的药代动力学行为常常被忽视。 事实上，纳米制剂载体材料占据了纳米制剂结构的绝大部分，主导了纳米制剂在机体内的命运，所以揭示纳米制剂载体材料的药代动力学行为，对于纳米制剂体内命运的研究至关重要。 另外，纳米制剂载体材料也有可能导致严重不良反应事件的发生。 例如长期服用PEG会导致肾蓄积毒性25；PEG会抑制P-糖蛋白26-30，进而影响一些药物的药代动力学行为；PEG的酸性代谢产物会引发酸中毒31；PLA和PLGA会引发机体出现炎症反应32,33；PVP会在人体内发生蓄积，并引发毒性34；环糊精具有潜在的肾毒性、肠毒性和肺毒性35-37；壳聚糖会促进血小板粘附，也会减少胃肠道对脂肪的吸收38,39；泊洛沙姆会引发肾功能不全40；一些无机纳米制剂载体材料（例如碳纳米管材料、硅纳米粒材料、金属纳米粒材料）会导致氧化应激41,42、细胞凋亡43-45、炎症46-48、器官及DNA吉林大学博士学位论文10受损49-53。 纳米制剂载体材料的毒性机制主要有以下几种类型1）高分子材料可能不容易在体内被降解，难以从机体内排出，从而导致蓄积毒性；2）纳米制剂载体材料可能与药物转运体发生相互作用，改变药物的药代动力学行为，进而造成材料-药物之间的相互作用；3）纳米制剂载体材料可能产生具有毒性的代谢产物。 这些毒性机制都与纳米制剂载体材料的药代动力学行为密切相关。 因此，了解纳米制剂载体材料药代动力学行为，对于纳米制剂的安全性和有效性评价具有重要意义，能够为纳米制剂的设计和临床转化提供有力帮助。 图图1.3纳米制剂进入体内后可能存在的多种形态1.3DSPE-PEG及其药代动力学研究二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（Distearoyl phosphoethanolamine-polyethylene glycol，DSPE-PEG，图1.4）是一种PEG化磷脂，具有良好的生物相容性和生物可降解性，常被作为纳米制剂载体材料54,55用于协助药物释放，提高制剂的生物相容性和稳定性56。 DSPE-PEG是一种两亲性大分子化合物，由磷酸疏水头部和PEG亲水尾部构成，具有良好的水溶性，它能够与磷脂一起构成脂质体结构，也能够在水溶液中自组装为10-100nm尺寸的