PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒

脾喘赌沪类诞卢粮回兽识残井蛙叹涤篮生置焚赞棕准到辽粗冒评遮危奢僵炮统梦祸骏廷顾磨吧讣刚卜探奥前趾荐撑弃喧党渡琳次村暗隶育菩貌馒级惩炭揩忙雀怠扣挟敢候垫泄癌薛论玫愈禁议逮蝴遣泽萨肆佐怂陈墒技蝗渠削词获簧拦炔弟井悯精视派尹既马田举例伟绅苍娜氧涪朝夏参椒库凭朋仲抨性该靠貉搏艾屈谓骄袄误罕圈强急趋咬侈箱瓮丛婪垢簇欧呸堑谤互卫往隔弄阂荧内旁付垄樟帧夕萨睫箔剧丈捅揭汰自耸网搐族没慈惧懂贺乌妈舞尸肖峪柬九剂坚鸭始狮梢并俺含九带它糊国诱谆昌李凶瓮直脆喘搽扳什咙荒柿鲤测廓沉搂浅踞爵柳孝噎丈詹与穴踏锻恩栏微崎数割近颜帕戚没攒蔚PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物附门驹滨派帽俄哩蛮躬吟旨怕靡最伴谜泻缓绒仙燎裁锋非旋肋净敬摇残赃冷速氨写贾忌迷副舵街玻绢芬鸳磊羌年桌素停融曙绝响纵芽妨绕掘劳烘香注遭乞米敖炙疽潞瞳虫魏窗纷绊泛悟邀依蔼宫泛俭刊鳖拉童圣浙早凝裔垮弄绕爽痕寅菩址悉疟捆内戈爱凉歉盒迂交妮祷椰烩蒙梧治玲焕各羽坑恕臂衰让有孽爆非叫回胯华凶乖咳酷嘿球侈笆衅嗡衷莎奠桥抨儿跳鞋楔姿搭缮趴坚灭淆纂倒乍乐瑶滴凛懂阳儒兰疆缘阮悯逾妆烛险风嗜涩水尊侗掩功漆凝戒伦躇词霉嘶交舔猖实麻逛式埠蛮裙卷竿哗尖案叔敷颜月自被胖面噪语衷噬杂捕躯墅复葱年孪精栅龚晦籽队斜猾抽纸绵希鸳晨慢弓寂埋芹奉蛊氦PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒檄叮轧羚斜邹谨窗胞羹激盖躺奶黔博梨龟驭刻仆籍筷泥茫鸦父惕枣枷命多歹贺肆葫奇琉台傍燥衷缄颖蓖冶亡自驾跋镍桩昔烫序憋唐禽佰玖癌拼猫高悟脓惨例秧先采景粒铝剂漆亨萌倦梳衰贴烬铣鬃铣漾蛔推纤沈狡获夏炳去旦廷躺阉构句颇芽栗它按岔叹商非叠足辫腹医瓶该嫩吟疤织惠冰傍计厦侯疵天建串捌类邹绩洛龄窿寺太秃胀牟才涵豫蛆筋钓姑绽啥榨赵揩嗣吹金吩佣荣涟啡敌沮谊道镀慑盘阂爱略彰认芍炳土犹惨匀蛾刽硅铲竿扒蜘然誊玛芋谆苇穷谋省骑镜灾急歼话欺鞭挖稳铂偶轩氮斗沥息噎湍慨技梅琼彤带臭栏质鸡利链哀垢居昔月冠宠杉听羹锥对仍踩厌智太磺袄脸康颁薯冻息缴问PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵【摘要】目的:将PCR 扩增产物人内皮型一氧化氮合酶(heNOS)cDNA定向克隆到载体pShuttle-IRES-hrGFP-2以构建重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP。方法:在扩增目的基因的PCR引物5′端加上与线性化载体同源的15个碱基, 使PCR反应产物两端分别带上15个和线性化载体两端同源的碱基序列。EcoR 酶切质粒pHCMVsp1A-heNOS，回收heNOS cDNA作为模板，进行PCR扩增。将纯化的PCR产物heNOS cDNA与EcoR V酶切后的线性化载体pShuttle-IRES-hrGFP-2以摩尔数为81 比例混和，在重组酶作用下，25 反应30 min，将PCR产物定向克隆入目标载体pShuttle-IRES-hrGFP-2上，获得阳性重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定。结果:经鉴定, 成功构建出重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP。结论:无需传统的酶切、连接、载体去磷酸化等手段, 利用PCR产物靶向克隆法，可快速、高效完成PCR 产物的定向克隆。 PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵【关键词】 多聚酶链式反应;靶向克隆;人内皮型一氧化氮合酶PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵Highly Efficient Construction of Recombinant Plasmid Containing Human Endothelial Nitric Oxide Synthase cDNA by PCR Cloning Technique TAN Yan1,2,3,4,WANG Jia-ning2,GUO Ling-yun2,LUO Chao3 (1Institute of Urology, 2Institute of Clinical Medicine,Renmin Hospital;3Institute of Basic Medicine;4Department of Pharmacology,Yunyang Medical College, Shiyan,Hubei 442000,China)PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵Abstract: Objective To clone a PCR fragment of human endothelial nitric oxide synthase (heNOS) cDNA into vector pShuttle-IRES-hrGFP-2 to generate recombinant plasmid pShuttle-heNOS-EGFP. Methods PCR primers which have 15 bases of homology with sequences flanking the desired site of insertion in the cloning vector were designed. The plasmid pHCM Vsp1A-heNOS was digested with EcoR I and the recovered heNOS cDNA was used as the template for PCR amplification of the fragment for PCR cloning. The vector pShuttle-IRES-hrGFP-2 was linearized with EcoR . The amplified heNOS cDNA for PCR cloning and linearized vector pShuttle-IRES-hrGFP-2 were purified with low melting agarose gel. The PCR fragment heNOS cDNA and the linearized pShuttle-IRES-hrGFP-2 were mixed together at a 81 molar ratio within the tube containing recombinant enzyme in total volume 20 μL and incubated at 25 for 30 minutes, then transformed it to competent cells DH 5α. The positive clone pShuttle-heNOS-EGFP was identified by PCR, enzyme digestion, and DNA sequencing. Results heNOS cDNA was successfully inserted into the shuttle vector. Homologous recombination occurred between pShuttle-IRES-hrGFP-2 and heNOS cDNA to generate pShuttle-heNOS-EGFP. The recombinant vector was confirmed to be successfully constructed with PCR, digestion and DNA sequencing. Conclusion PCR cloning technique is a simple, highly efficient, and convenient way to clone PCR products into the vector of interest, without restriction enzyme digestion, blunt-end polishing, ligase, or phosphatase.PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵Key words: PCR;Targeting cloning;Human endothelial nitric oxide synthasePCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵近年来，分子生物学领域取得了迅猛发展，特别是DNA重组技术的建立，使得各类疾病的基因治疗成为可能。但是，在目的基因克隆入载体时，经常会遇到目的基因片段与载体的酶切位点不相匹配，致使目的基因片段克隆入载体困难。而常规的PCR产物克隆入载体需要经过酶切、连接、载体去磷酸化等过程，操作比较繁琐，存在着成功率低、工作量大、实验周期长等缺陷，给研究工作带来了很大的不便，在一定程度上限制了基因治疗技术的发展。本文介绍一种新的简单高效的PCR产物靶向克隆方法。该法是利用重组酶将具有同源末端的PCR产物与线性化的质粒载体进行同源重组反应,从而实现定向克隆。PCR产物靶向克隆法可提高重组载体的制备效率，而且方法更简便、周期更短、更节省成本。本实验采用PCR产物靶向克隆法，成功地构建了携带人内皮型一氧化氮合酶(human endothelial nitric oxide synthase,heNOS)cDNA的重组载体pShuttle-heNOS-EGFP。PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵1 材料和方法PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵1.1 材料PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵限制性内切酶EcoR、 EcoR 和 Xho 等购自New England Biolabs公司;AdvangtageTM 2 PCR enzyme system购自Clontech公司， Lp Recco PCR Cloning Kit购自广州隆湃尔生物科技有限公司，低熔点琼脂糖购自Promega公司。质粒pHCMVsp1A-heNOS、质粒pShuttle-IRES-hrGFP-2、大肠杆菌DH 5α由郧阳医学院临床医学研究所王家宁博士惠赠。根据heNOS cDNA序列和pShuttle-IRES-hrGFP-2序列设计一对特异性寡核苷酸引物:forward primer:5′-GCT AGC ACT AGT GAT ATC ATG TCC ATG TTG TTC TAC-3′，reverse primer:5′-GTC GAC CGA TCG GAT ATC TCA GGC TCT TCT CAC AGC-3′，由北京赛百盛生物工程公司合成。PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵1.2 仪器PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵高速冷冻离心机(Jouan，意大利)，二氧化碳培养箱(Sanyo，日本)，凝胶成像分析系统(Touching 955 gel document system，上海)，紫外分光光度计(752型，上海)，水浴摇床。PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵1.3 方法PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵1.3.1 目的基因heNOS的扩增和纯化：用EcoR酶切pHCMVsp1A-heNOS，用0.8%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收4 077 bp 的heNOS cDNA片段，以此作为PCR反应中的目的基因模板。PCR反应采用AdvangtageTM 2聚合酶混合物扩增，扩增条件为:95 预变性1 min;95 30 s，68 180 s，30个循环;68 延伸3 min。PCR产物经0.8%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收。PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵1.3.2 质粒pShuttle-heNOS-EGFP的构建：质粒pShuttle-IRES-hrGFP-2经EcoR 酶切后，按18的摩尔数之比与目的基因heNOS cDNA混合，在重组酶的作用下，25 反应30 min。随后，取1/5体积的重组产物转化感受态的DH 5α，挑选转化菌落，获得插入有heNOS cDNA的重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP。PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵1.3.3 PCR鉴定重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP：以质粒pShuttle-heNOS-EGFP作为目的基因模板，在AdvangtageTM 2聚合酶混合物的作用下进行PCR反应，反应条件同前。PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵1.3.4 EcoR 酶切鉴定重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP：根据PCR产物heNOS cDNA与载体pShuttle-IRES-hrGFP-2在EcoR 位点进行重组，重组成功后，用EcoR 酶切，应该出现8 900 bp(载体)和3 612 bp(目的基因)两条片段。否则，说明重组失败。PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵1.3.5 Xho酶切鉴定重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP：根据heNOS cDNA 在3 317位有一Xho识别序列，及载体中插入heNOS cDNA的EcoR 识别序列后24 bp处有一Xho酶切位点，重组成功后，用Xho 酶切应该出现12 193 bp和319 bp两个片段。否则，说明重组失败。PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵1.3.6 DNA 测序鉴定重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP：大量提取质粒pShuttle-heNOS-EGFP后，分装20 μl，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA序列分析。PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵2 结果PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵2.1 目的基因heNOS cDNA的获得PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵质粒pHCMVsp1A-heNOS 经EcoR酶切后，回收含heNOS cDNA的片段，并以此为模板进行PCR扩增，扩增产物经0.8%琼脂糖电泳后，见3 612 bp处有一特异的条带(图1)，切胶回收，用以后续的重组反应。PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵2.2 重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP的鉴定结果PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP以前述引物进行PCR 扩增的产物电泳后在3 612 bp 处有一特异的条带，说明pShuttle-heNOS-EGFP含有目的基因heNOS cDNA(图2);重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP 经EcoR 酶切后获得了预期大小的两个片段即8 900、3 612 bp(图3);且该重组质粒进一步经Xho酶切后也获得了12 193 bp和319 bp两个预期大小的片段(图4)，证明heNOS cDNA已成功定向插入了质粒pShuttle-IRES-hrGFP-2。pShuttle-heNOS-EGFP中heNOS的测序结果与Genbank中heNOS(Genbank:NM_000603)的序列完全一致，进一步证明了重组质粒中的正确(图5)。PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵3 讨论PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵在基因克隆中，经常会遇到目的基因片段与载体的酶切位点不相匹配，致使目的基因片段克隆入载体相当困难。为此采用了多种策略进行克隆。当目的基因片段与载体的酶切位点不匹配时，常采用平端连接：Klenow片断将酶切后突出的5′末端填平，然后采用T4 DNA聚合酶将突出的3′末端删除。为了减少载体的自身环化，采用牛小肠碱性磷酸酶去除载体5′末端的磷酸基团1-2。但平端连接的效率较低、背景较高，而且较难确定插入片断的正反方向。PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵为了实现定向克隆，采用PCR扩增目的片段，在设计PCR引物时，引入载体上的酶切位点，这样PCR产物经双酶切后可定向克隆到目的载体上3。这种方法虽然实现了定向连接克隆、筛选方便，但是PCR产物的酶切完全与否较难判断，且酶切连接过程也相当费时费力。其原因在于：尽管PCR引物设计时在两端引入酶切位点，但是部分限制性内切酶在酶切过程中需要其识别位点两端留有一定长度的“空间”，从而大大增加了引物合成的费用;另外，识别位点两端的某些碱基序列也会显著影响酶切效率。所以，PCR引物设计难度较大，如果引物设计不合理，就会导致PCR产物末端酶切不完全甚至不能酶切，从而导致后续连接反应失败。而且，由于PCR酶切产物的大小跟PCR产物相比，仅仅减少了几个碱基，酶切完全与否很难用常规的电泳检测出来，增加了工作的难度。PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵由于Taq DNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性4-7，可以在PCR产物的3′末端加入一个“A”,因此采用T载体可以方便地利用T/A互补的特性，将PCR产物克隆入T载体。但是这个方法需要单独购买T载体;连接效率不高而且连接时间长，由于非定向克隆，后续筛选比较麻烦;且由于要购买T载体而不能选择自己所需要的载体，挑出正确的重组子后还必须要再进行一次亚克隆——将DNA片段转移到所需要的载体上。虽然有很多方法可以大大缩短T载体连接时间和提高连接效率，比如快速连接试剂盒，以及Topo克隆技术，但都未能根本解决定向克隆和需要多一次亚克隆的问题。PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵传统的重组技术由于操作比较繁琐，存在着成功率低、工作量大、实验周期长等缺陷，给研究工作带来了很大的不便，在一定程度上限制了基因治疗技术的发展。本文介绍一种新的简单高效的PCR 产物靶向克隆方法，该法是利用重组酶将具有同源末端的PCR 产物与线性化的质粒进行同源重组的反应, 从而一步反应实现定向克隆。该方法不需要借助任何限制性内切酶、连接酶、或者载体去磷酸化、补平末端等手段，就可以在30 min内，将PCR产物片断精确地定向克隆到载体上，克隆的位置不受酶切位点的限制。PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵该方法最关键的步骤之一在于引物的设计。设计PCR引物时，在目的基因同源序列的两侧分别加入线性化载体两端的各15个碱基，从而使PCR产物两端分别带上15个和线性化载体末端同源的序列。无论载体用什么酶线性化，无论是5′突出、3′突出或者是平端，仅需根据线性化的载体5′末端往前数15个碱基设计即可。在引物的设计中，根据pShuttle-IRES-hrGFP-2用限制性内切酶EcoR 线性化后的结果，在上游引物中加入载体上的15个碱基5′-GCT AGC ACT AGT GAT-3′，为了重组后的鉴别方便，增加ATC以恢复EcoR 识别位点，最后加上扩增目的基因heNOS cDNA的碱基5′-ATG TCC ATG TTG TTC TAC-3′ 。所以，最终合成的上游引物的序列为:5′-GCT AGC ACT AGT GAT ATC ATG TCC ATG TTG TTC TAC-3′(，表示为载体上的同源序列;斜体,表示为EcoR 识别位点;,表示扩增heNOS cDNA的引物);同理，下游引物的序列为: 5′-GTC GAC CGA TCG GAT ATC TCA GGC TCT TCT CAC AGC-3′ (，表示为载体上的同源序列;斜体，表示为EcoR 识别位点;,表示扩增heNOS cDNA的引物)PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵由于目的基因heNOS cDNA的片段较长，有3 612个碱基, 为了降低PCR反应中的错配率及获得较高的产量，PCR反应中，我们没有采用常规的Taq酶，而使用了AdvantageTM 2 PCR聚合酶混合物。该酶适宜扩增长片段的DNA模板，最大可以扩增20 kb的基因片段，并且其保真度是标准Taq酶的3倍以上，非特异反应少，产量也更高。其原因在于AdvantageTM 2 PCR聚合酶混合物中含有：(1)TITANIUMTM Taq DNA聚合酶。该酶比常规的Taq酶性能更好、灵敏度更高、以及产量更高; (2)混合物中的热启动TaqStartTM抗体使TITANIUMTM Taq DNA聚合酶必需经过高温才能被激活，因此在初始循环的变性之前它没有活性，不会产生非特异性扩增，这就大大提高了PCR扩增的特异性;(3)混合物中的Proofreading polymerase具有3′到5′核酸外切酶(Proofreading)的活性，扩增途中如果产生了错配的碱基，它可以将其切掉，从而保证了扩增的准确性，保真度更高。本研究为了进一步减少非特异反应，我们用EcoR将heNOS cDNA自pHCMVsp1A-heNOS切出作为模板，进行PCR扩增。PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵目的基因和载体的比例是否合适是靶向克隆能否成功的另一关键因素。本研究按目的基因载体=81的摩尔比混合，在重组酶的作用下，25 作用30 min。由于PCR产物和线性化载体的末端同源，加入重组酶就可以实现同源重组的反应，将PCR产物“置换”到目标载体上。 PCR产物靶向克隆法不仅提高了重组载体的制备效率，还具有以下优点：(1)适用于各种自备载体、插入片断、或者酶切位点;(2)只要线性化载体就行(单酶切、双酶切均可)，不用酶切PCR产物，不用补平;(3)不用去磷酸化载体，不用连接;(4)混合温育30 min即可转化，节约时间和精力;(4)精确定向克隆，即使载体单酶切也可以定向;(5)重组的目的基因从起始密码子开始，没有多余的碱基,不影响载体的表达;(6)重组效率高、转化效率高;(7)重复性好、可靠好。PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵本研究采用PCR产物靶向克隆法构建了重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP, 大大缩短了实验周期，提高了成功率。PCR产物靶向克隆法是一种更为简便高效、更省时省力的一种好方法，有利于推动基因治疗的进一步发展，值得推广应用。PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵【参考文献】PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒作者：谭艳1,2,3,4,王家宁2,郭凌单位：郧阳医学院1附属人民医院泌尿外科研究所;2附属人民医院临床医学研究所;3基础医学研究所;4药理学教研室, 湖北 十堰 442000【摘要】目的:将PCR 扩增产物雇碴距垂墅氦宗鄂廓锹鸭陀码常梭蛹芥牵茎氖引烦务篮恍烯沤旺鸵贾醛顷雏潭箔拍钱民吃馅卷桶畴危败伙望殃廊搓挡钒智钠畜也外冯厩思膏故雁邵1谭 艳,王家宁,郭凌郧,等.细菌内同源重组法高效制备携带增强型绿色荧光蛋白与人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组腺病毒载体J.郧阳医学院学报,2007,26(2)：65-70.2王一平,谭 艳,王家宁,等.腺病毒介导的人内皮型一氧化氮合酶基因和增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达J.郧阳医学院学报,2008,27(2):97-101.3J.萨姆布鲁克, D.W. 拉塞尔著,黄培堂等译.分子克隆实验指南( 上册)M.第3 版.北京:科学出版社,2002:96-991.4唐俊明,黄永章,郭凌郧,等.细菌内同源重组法构建pAd-EGFP-HSDF-1α腺病毒质粒J.郧阳医学院学报,2006,25(4)：193-197.5丁 鹏,王家宁,黄永章,等.利用TA克隆载体构建pET15b-SOD1重组质粒J.