【毕业学位论文】（Word原稿）棉铃虫感觉神经元膜蛋白和G蛋白α亚基基因克隆表达及其相互作用蛋白的筛选农业昆虫与害虫防治博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 棉铃虫感觉神经元膜蛋白和 G 蛋白亚基 基因克隆表达及其相互作用蛋白的筛选 I 摘 要 棉铃虫是许多国家农业上的重要害虫。研究表明，昆虫的嗅觉在处理来自环境的化学信号过程中起着非常重要的作用，从而使昆虫能够觅食，寻找配偶、产卵场所、寄主和猎物，及发现捕食者等。昆虫的气味识别过程非常复杂，有多种蛋白参与。迄今为止，昆虫的嗅觉识别机制研究取得了一些可喜的进展，但是对整个嗅觉信号传导途径了解得非常少。清楚阐明昆虫的嗅觉信号传导会为研制高效的引诱剂或杀虫剂提供理论依据，为有效防治棉铃虫提供新的思路与途径，延缓或降低棉铃虫对 花抗性演化的速度。本文利用 术结合 隆了 亚基基因；采用半定量 究了 两个基因在棉铃虫体内的时空表达情况；对两个基因进行原核表达和纯化；利用酵母双杂交技术研究已经克隆的 否互作，并筛选与 互作用的蛋白。本研究所取得的结果如下： (1) 利用 合 术从棉铃虫触角中首次克隆了 G 蛋白亚基基因，经过索同源序列发现其属于 G 蛋白 亚基的 q 家族。已被 据库收录，登录号 名为 亚基相似性在 90以上。与近缘种甘蓝夜蛾 与家蚕 相似性高达 与果蝇 (与线虫 相似性高达 与 加勒比龙虾 相似性高达 (2)半定量 究表 明， 棉铃虫雌雄成虫触角中表达，在头、胸、腹、足和翅中也有表达，并且表达量差异不显著；此外，在喙、下颚须和下唇须中也有表达；在 卵、幼虫、蛹和成虫体内也都有表达；在卵中的表达量最高，而在成虫中的表达量最低，在幼虫和蛹的前、中、后期的表达量差异不大 。研究表明 一种普遍存在的蛋白。棉铃虫 这种组织分布广泛性，可能预示其参与细胞的多种信号传导途径。 (3) 棉铃虫感觉神经元膜蛋白基因序列法国人 已经报道（ . 2003 利用特异性引物从本实验室棉铃虫触角中克隆了一条全长 1690 列，感觉神经元膜蛋白（ 读框全长 1572码 523 个氨基酸残基，序列中有 2 个跨膜区，具有昆虫感觉神经元膜蛋白的典型特征。 已报道的其它昆虫的感觉神经元蛋白的氨基酸序列有很高的相似性。半定量 究结果显示， 棉铃虫中不仅在 触角中表达，也在去掉触角的头、足中表达。但是在触角中的表达量最高，在雌雄触角中的表达量差异不显著。在 棉铃虫的味觉器官如： 喙，下颚须 和下唇须中也有表达。在 卵、蛹和成虫体内也都有表达，在卵中表达量相对较低 。 棉铃虫体内的时空表达情况表明： 仅参与棉铃虫的嗅觉识别，而且还参与棉铃虫的味觉识别。 4）将棉铃虫 因分别亚克隆到原核表达载体 多克隆位点上，构建原核表达载体 导，目的基因在大肠杆菌中成功进行表达，但是蛋白以包涵体形式存在。对包涵体进行溶解和重折叠后，经过亲和层析对重组蛋白进行了初步纯化。得到了比较纯的 但是使用同样的纯 化方法没有得到纯的 (5) 通过构建棉铃虫触角的 库，用克隆的 亚基做诱饵进行酵母双杂交筛选，得到与其相互作用的蛋白。共鉴定了 43 个阳性克隆，并且对这些克隆测序。通过 询和分析，发现几个克隆与性外激素结合蛋白（ 度同源，这为 与气味信号传导提供了证据。另外，还发现了与 G 蛋白 亚基互作的蛋白，如， 3糖体蛋白 胞色素氧化酶亚基、细胞色素氧化酶 C 亚基、促咽侧体素神经肽前体（ 翻译控制肿瘤蛋白(体液凝集素前肽 。这些克隆的获得，为进一步研究棉铃虫 G 蛋白 亚基在信号传导中的作用奠定了基础。 (6) 用酵母双杂交系统研究克隆的棉铃虫 G 蛋白 亚基和 间是否存在互作。本试验没有筛到相互作用的阳性克隆，可能是这两个蛋白之间不能结合或结合力很弱，推测棉铃虫中 能与 G 蛋白其他家族的 亚基互作，有待进一步试验证明。 综上所述，本研究首次从棉铃虫触角中克隆了 G 蛋白 亚基，在 的登录号为 G 蛋白 亚基与 行了不同组织和阶段发育转录水平的研究，证实克隆的 G 蛋白 亚基属于普遍存在 的蛋白，可能参与细胞多种信号途径的传导； 时空表达情况说明其在棉铃虫体内不是触角特异性蛋白，既参与气味识别，又参与味觉识别。酵母双杂交的研究表明， G 蛋白 亚基能与性外激素结合蛋白作用，参与棉铃虫的气味信号传导。棉铃虫 G 蛋白 亚基和 上对棉铃虫 G 蛋白的研究结果，目前在国内外均未见报道。这些成果的取得，不仅圆满完成了国家自然科学基金项目规定的研究任务，同时为进一步研究棉铃虫 G 蛋白的功能及其信号传导途径奠定了基础，对今后深入开展昆虫与寄主植物互作机理及植物抗虫机制的研究，开辟防治新途径具 有极为重要的理论和实践意义。 关键词 ：棉铃虫， G 蛋白 亚基， 因克隆， 时空表达，原核表达与纯化， 酵母双杂交，信号传导 is a in an in to of or is a in in is of of of of to t. In a q in by q by by q as (1) G 3/5)It to q 90%) q up , , (2) by q in at in in . no in it in in in no in a it be in IV (3) . . in 003 ( A by to in 57223 wh is it in in a . in in no in it in in 0 in (4) of by q by (5) as D/to 20, c I T2 , of of in V (5) q no of is ma y or is no is to of In G on q a in in an of in G in is no e in It on of 录 第一章 绪 论 . 1 味结合蛋白研究进展 . 1 虫触角气味受体的研究进展 . 2 觉神经元膜蛋白（ 研究进展 . 4 生化特性： . 4 分布及时空表达情况 : . 5 生理作用： . 6 虫触角 G 蛋白 的研究进展 . 7 蛋白的基本结构和种类 . 7 蛋白的调控循环 . 9 蛋白 亚基 . 10 虫 G 蛋白信号途径的研究进展 . 13 母双杂交简介 . 13 母双杂交系统的基本原理 . 13 母双杂交系统的特点及优点 . 14 母双杂交系统的应用 . 15 母双杂交系统的缺陷 . 16 母双杂交系统的拓展 . 19 究的背景和意义 . 20 第二章 棉铃虫 基及 . 22 料与方法 . 22 试昆虫 . 22 养基 . 23 要试剂 . 23 器设备 . 24 验 技术路线 . 25 提取 . 26 合成 . 27 物的设计 . 27 应 . 29 q 5应 . 29 q 3应 . 31 物的回收纯化 . 32 接反应 . 33 肠杆菌感受态细胞的制备 . 33 化大肠杆菌 . 33 粒 小量提取 . 33 性克隆鉴定 . 34 8 序列测定 . 35 铃虫 G 蛋白 亚基及 时 空 表 达 . 35 验室不同品系棉铃虫中肠 G 蛋白 亚基基因变异情况 . 36 蛋白 亚 基 基 因 内 含 子 情 况 . 38 果与分析 . 38 蛋白 亚 基 基 因 克 隆 及 序 列 分 析 . 38 亚基在不同组织及各虫期的转录水平 . 49 基因克隆及序列分析 . 52 铃虫 不同组织及各虫期的转录水平 . 56 验室不同品系棉铃虫中肠 G 蛋白 亚 基 蛋 白 变 异 情 况 . 58 蛋白 亚 基 基 因 内 含 子 情 况 . 60 论 . 61 克隆的棉铃虫 基 因 及 其 时 空 表 达 情 况 的 分 析 . 61 于半定量 法的探讨 . 63 于 术的探讨 . 64 第三章 棉铃虫 G及 原核表达及纯化 . 65 料与方法 . 65 种和质粒 . 65 物设计 . 67 合表达载体的构建 . 67 接产物的转化、鉴定 . 69 胞培养和诱导表达 . 69 烯酰胺凝胶电泳分析 . 69 因的融合表达 . 70 涵体的破碎和重折叠 . 70 3 2 结果与分析 . 70 蛋白 亚基和 合表达载体的构建 . 70 丙烯酰胺凝胶电泳分析 . 72 第四章 酵母 双杂交筛选与 用的蛋白 . 77 料与方法 . 77 料 . 77 剂 . 77 术路线 . 83 别用棉铃虫 建诱饵蛋白 . 84 建 库 . 88 构建好的诱饵蛋白筛选 库 . 90 母共转化法研究克隆的 间的互作 . 94 果与分析 . 95 饵蛋白的构建 . 95 库的构建 . 99 棉铃虫 G 蛋白 亚基做诱饵蛋白筛选 库的结果 . 100 母双杂交研究克隆的 G 蛋白 亚基与 间的互作关系 . 103 对酵母双杂交实验结果的讨论 . 104 母双杂交试验常见问题 . 105 一步工作计划 . 106 第 五 章 结 论 . 107 参考文献 . 110 作者简 历 . 118 致 谢 . 119 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪 论 嗅觉在昆虫处理来自环境的化学信号过程中起着非常重要的作用，从而使昆虫能够觅食，寻找配偶、产卵场所、寄主和猎物，及发现捕食者等。蛾类信息素识别已经成为嗅觉接受和传导机制研究的模式 (et 002)。研究表明昆虫嗅觉识别过程非常复杂，有多种蛋白参与这一过程，这些蛋白主要包括气味结合蛋白 (981; R 2004a; 王桂荣等， 2002a)、嗅觉受体 (J 1999; et 002; B 1999)以及气味降解酶 (E 1999; R 2004b )。气味分子被水溶性气味结合蛋白（ 载到气味受体 (003)，气味受体通过鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（ G 蛋白）把细胞表面的信号传递到细胞内部的效应器 . 气味识别的生化途径如图（图 示： 图 味 识 别 的 生 化 途 径 A. 一个嗅觉感器包括 2 3 个神经元，被 3 个支撑细胞包围。嗅觉树突 /