【毕业学位论文】（Word原稿）鉴别犬瘟热病毒强毒株和弱毒株的复合RT-nPCR方法的建立及初步应用预防兽医学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 鉴别犬瘟热病毒强毒株和弱毒株的复合法的建立及初步应用 of a of of of a of of I 摘 要 犬瘟热（ 由犬瘟热病毒（ 染犬或其它食肉目动物引起的一种高度接触传染性、致死性疾病， 于副粘病毒科麻疹病毒属，该属成员还包括麻疹病毒（ 牛瘟病毒（ 负链单股不分节段的 毒，基因组全长 15690要由 N 基因， P 基因， M 基因， F 基因， H 基因， L 基因组成，只有一个血清型。 本研究旨在建立一种能区分 毒株、弱毒株的复合 检测方法。根据 因组全序列，选择 、弱毒株间有差异区域，选择其高度保守区设计了一对通用引物 在该对引物跨越区域的内部设计了 毒株特异性引物 弱毒株的特异性引物 引物 4 进行 后用引物 3/行复合套式 立了一种能区分 、弱毒株的复合 鉴别诊断方法。应用该方法从 、弱毒株的基因组中分别扩增出了大小为 247 177特异性片段，从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为 247 177两条特异性片 段，与犬细小病毒（ 犬腺病毒（ 犬冠状病毒（ 狂犬病病毒（ 新城疫病毒（ 细胞培养物，以及正常细胞对照组进行复合 增时均为阴性。该方法敏感性为可以检测到相当于 1 10测耗时短，最快可在 6h 内完成。对从黑龙江省及吉林省采集的 30 份疑似 料（分别来自于犬、狐、貉的脾脏、肝脏、肺脏、膀胱）进行了检测，结果表明，有 20 份为 中 15 份为 毒株， 5 份为 毒株。 选择 2 株复合 测为强毒的样品（ 其余 25 株具有代表性的 株进行 H 基因序列分析，结果显示，复合 检测结果是准确的；并且目前 病毒株之间由于地域性及年代的不同，主要可区分为强毒株与弱毒株两个基因型，其中强毒株又可分为亚洲 1 型（ 亚洲 2 型（ 欧洲型（ 美国型（ 北极型（ 五种基因型。我国有 3 株流行野毒（ 于 1 株流行野毒（ 于 ， 属于 。 本研究建立的复合 以检测 染，并能作为强毒株、弱毒株的鉴别诊断方法，可用于临床快速检测，流行病学监测。 关键词 犬瘟热病毒，复合 别诊断，基因型，序列分析， H 基因 is a of or by , is a NA to of DV is 5690 nt in , P, M, F, H, L. A of A of 1 4 DV to DV as a in CR of 2 3 DV or as 4 in of A 77 bp a 47 bp in 47 bp 77 bp of No or 10be to 0 D As a 20 to 15 DV to be to be by to be of 5 DV as a of to of of DV be in in of in of in of be to DV DV be on 录 第一章 绪论 . 1 犬瘟热及其诊断方法研究现状 . 1 1 犬瘟热概述 . 1 瘟热简介 . 1 主范围 . 1 行病学 . 1 其基因组结构 . 2 要蛋白 . 3 床症状 . 5 病机制 . 6 原变异性 . 6 2 断方法发展现状 . 7 毒的分离培养 . 7 镜诊断 . 8 涵体检查 . 8 脊液的检查 . 9 原检测 . 9 体检测 . 10 子诊断学技术 .究的目的与意义 . 13 第二章 鉴别犬瘟热病毒强毒株和弱毒株的复合 法的建立及初步应用 . 14 1 材料 . 14 要仪器和试剂 . 14 毒 . 14 检病料 . 14 胞与 胚 . 14 粒和菌株 . 15 2 方法 . 15 别 、弱毒株的复合 断方法的建立 . 15 、弱毒鉴别诊断引物的选择 . 15 增殖和现地分离株的分离、增殖 . 15 病毒 提取 . 16 转录 . 16 . 17 异性试验 . 17 感性试验 . 17 复性试验 . 17 基因种系发生分析 . 18 基因扩增引物的选择 . 18 毒 提取 . 18 转录 . 18 . 18 物的回收 . 18 的基因 物的连接与转化 . 19 性重组质粒的筛选 . 19 粒 定和纯化 . 20 粒 测序 . 20 基因的序列比对分析 . 20 3 结果 . 21 合 法的建立 . 21 一步反应条件的确定 . 21 二步反应条件的确定 . 21 异性 . 23 感性 . 24 复性 . 24 似 料的检测 . 24 基因的序列分析 . 26 毒 物电泳鉴定结果 . 26 粒 定结果 . 26 基因序列比较分析 . 27 地病料的 测 . 30 4 讨论 . 31 别诊断方法 的建立 . 31 基因进化分析 . 32 V 第三章 结论 . 33 参考文献 . 34 附录 . 42 致谢 . 45 作者简历 . 46 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 0 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 瘟热病毒 瘟热 转录 P 物 0% 数组织培养感染量 胞病变 苄青霉素 升 L 升 nt 苷酸 基对 r/分钟转速 H/h 时 钟 s 克 g 克 酸盐缓冲液 道尔顿 氧核糖核苷三磷酸 糖核酸 氧核糖核酸 二胺四乙酸 B 培养基 放阅读框 碳酸二乙酯 特定病原体 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 犬瘟热及其诊断方法研究现状 1 犬瘟热概述 瘟热简介 犬瘟热（ 由犬瘟热病毒（ 染犬或其它食肉目动物引起的一种高度接触传染性、致死性疾病，幼龄动物多为急性、致死性经过，成年动物可呈慢性持续性感染，以双相热、红疹、结膜炎、白细胞减少及中枢神经系统损害为主要特征，少数病例出现鼻部和脚垫的高度角化，患病动物在 康复后还遗留有麻痹、抽搐、癫痈样发作等后遗症（殷震等， 1997）。 欧洲发生于 18世纪后叶（ et 1999），最初认为是细胞性疾患。 实了本病的滤过性，认为可能是病毒，后来， 确定了本病的病原为病毒。据报道，目前本病几乎分布于全世界，所有养犬国家均有本病存在，从 60 年代起，我国部分省区的皮毛动物饲养场不断爆发本病，并逐渐在全国范围内流行，是当前对我国 养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的疫病之一。 主范围 染的宿主范围相当广，除了犬之外，犬科的其它动物如狼、狐狸、豺等食肉动物也能自发地感染本病；鼬科动物如貂、雪貂、白鼬、水獭等以及大小熊猫等对 自然易感性；此外海狮、海豚和海豹等海洋哺乳类动物（ et 1994; et 1997; et 1999; et 2001）也能自然感染发病。在灵长类也有报告指出 自然感染曾经发生在日 本的雪猴中（ et 1989），以及在人类 s 骨病变中，也可侦测到 et 2003; et 1998）。 行病学 传染源主要是病犬和带毒犬（ et 1992; et 1991; et 1997），其次是患 其他动物和带毒动物。病毒大量的存在于感染犬和患病动物的鼻、眼分泌物、唾液中，也见于肝、脾、肺、脑、肾和淋巴结等多种器官与组织中，通过眼泪、鼻汁、唾液、尿液以及呼出空气等长期排出病毒，污染周围环境。 病犬临床恢复后，可长时间地向外界排毒，成为不被人们注意的传染源。 传染性极强，中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 同一环境中饲养的动物无论采取怎样的隔离措施，最后还是难免相互传染。实验证明，传播的途径主要是呼吸道，其次是消化道。如通过气溶胶、飞沫、食物或不洁的医疗卫生用具以及眼结膜、口腔、鼻腔粘膜感染。另外还可以经阴道感染（ et 1995; et 1998; et 1988）。 复犬可获得终身免疫力。 犬感染 有明显的年龄、品种和季节性（ 10 月到第二年的 2 月），而且似有每 2 3 年流行一次的周期性，但现在有些地方这种周期性不明显，常年发生。断奶至 1 岁的幼犬多发，老龄犬和哺乳仔犬发病极少。可能是 产生获得性主动免疫与母源被动免疫有关。发病的和轻度感染的犬，不但可产生很强的主动免疫力，而且可以通过胎盘和初乳将此免疫力被动地传递给新生的仔犬，结果使犬群的易感性大为降低（蔡宝祥等， 2001）。 在狐、水 貂、貉等毛皮动物养殖场流行，造成严重的经济损失。猫和猫属动物可隐性感染，雪貂对 别易感，自然发病的病死率常达 100%（华国荫等， 1983）。近几年来，随着我国军犬、警犬、实验用犬和宠物犬饲养量的大幅度增加，以及异地交流的增多， 我国犬中的发病率和死亡率均有升高的趋势，而且临床表现也与以往有所不同。 其基因组结构 于副粘病毒科麻疹病毒属，该属成员还包括麻疹病毒（ 牛瘟病毒（ 1995）。 负链单股不分节段的 毒，病毒粒子呈多形性，多数 为球形，直径为 100 300糖中的浮密度为 值为 有宽径约 15 17螺旋形核衣壳，核衣壳外被覆的双层脂质囊膜由细胞膜和脂类衍生而来，膜上排列有 杆状纤突，纤突只含血凝素，而无神经氨酸酶（殷震等， 1997）。 迄今为止，己经对许多 株的基因进行了克隆，如 和 7 等毒株的基因组核苷酸已被完全测序，这为进一步了解 因组的结构和功能创造了有利条件。 分子量为 6 长 15690et 1993），它的 3端到 5端依次为3端前导序列、 N、 P、 M、 F、 H 和 L 基因以及 5端前导序列。各序列长度分别为 N 1683P 1655 1422F 2205H 1947L 6573et 1985）。基因组 身不具有感染性，它是转录和复制互补的 间体的功能性模板。基因组 3端（ 55导序列（ 5端（ 38随序列（ 启动、调节序列，指导基因的转录复制过程，同时又是 因的转录终止、重起始序列（ et 1985）。其中 5端尾随序列在功能上又显得尤其重要，一方面该区域可能含有核衣壳蛋白的衣壳化起始位点，另一方面反基因组 3端的启动子核苷酸也由其编码。 端的尾随序列与其它副粘病毒的同源性存在着较大的差异，其中与同属麻疹病毒的同源性最大为 73%。基因组 3端与反基因组 3端的 18 个核苷酸中有16 个相同，验证了这一区域作为新的反基因组和基因组合成的启动子序列的观点。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 要蛋白 表 1 主要蛋白及其分子量 白名称 分子量 核衣壳蛋白（ N） 60蛋白（ P） 73质膜蛋白（ M） 34合蛋白（ F） 59凝蛋白（ H） 77蛋白 (L) 180 血凝蛋白（ H） H 蛋白基因由 1944 1946 个核苷酸组成，它的 5端的非编码区含有 20 个核苷酸，3端非编码区则至少含有 100 个核苷酸。在这两个区域内没有发现稳定的茎环结构。整个基因仅含有一个 有毒株的起始密码子均起始于 21 23 位的 终止密码子在不同毒株间有一定差异。 苗株终止于 1833 1835 位的 et 1991），编码 604 个氨基酸残基，分子量为 77苗株终止于 1842 1844 位的 码 607 个氨基酸残基，分子量为 85毒株终止于 1842 1844 位的 码 607 个氨基酸残基，分子量为 84et 1997; et 1998; et 1997; et 1997）。在氨基酸水平上 蛋白与 同源性分别为 53%和 52%，而 蛋白的同源性为 60%，三者的 同源性为 36%， H 蛋白同源性比较结果表明 早于 离出来（ et 1991）。 H 蛋白是 糖蛋白，在该蛋白 N 末端（第 3555 位氨基酸残基处）存在着 H 蛋白仅有的疏水区，一方面作为穿膜的信号序列，另一方面为 H 蛋白的锚定区（ et 1991）。通过大量针对病毒各结构蛋白的单克隆抗体分析野毒株和疫苗株病毒结构蛋白的变异，发现 H 蛋白的抗原变异率在所有结构蛋白中是最高的（ et 1993; et 2000）。 构蛋白相应表位的表达进行研究，发现 同毒株间 H 蛋白的结构存在着差异（ et 1993）。由于蛋白质糖基化的程度可能影响病毒的抗原性（ et 1997），目前野毒株和疫苗株 H 蛋白潜在的天冬酰胺糖基化位点的研究令人关注，目前最常用的两疫苗株和 的糖基化位点分别为 7 个和 4 个，而野毒株为 89 个，其中 309311位的糖基化位点是野毒株所特有的。为进一步了解 H 蛋白 变异的分子基础，对许多毒株的 H 基因进行了遗传多态性分析，结果表明，野毒株与疫苗株在核苷酸和氨基酸水平上存在着较大的差异（ 10%左右），而分离株间的同源性可达 9399%（ et 1997; et 1998; et 1997; et 1997; et 1999）。 H 蛋白基因序列的系统发生分析表明 分离病毒 H 蛋白基因的遗传差异可能是近年来爆发 重要原因。因此 H 蛋白是最适合做 因改变监测的蛋白 (et 1997; et 2004; et 2002; et 1999)。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 H 蛋白是诱导机体产生中和抗体的主要蛋白之一，存在着许多中和性抗原表位，是抗 蛋白的单克隆抗体具有中和病毒的活性，对实验鼠的保护力强于抗 et 1991），此外， H 蛋白至少含有一个细胞毒性 T 淋巴细胞表位，在小鼠和犬 体内能诱发特异的 性 (et 2003; et 1998)。 染过程中 H 蛋白至少具有两个方面的作用。首先，病毒通过 H 蛋白吸附到细胞表面的受体上，因此， H 蛋白决定 主的特异性（ 1993; et 1995），并协助 F 蛋白使 囊膜与宿主细胞膜发生融合的方式进入宿主细胞。现已发现人 胞表面蛋白跨膜 4 超家族成员）以及其它动物的同系物是靶细胞摄入 胞体形成以及子代病毒增殖的必需因子（ et 1997; et 1985）。 广泛存在于前 B 细胞和活化的 T 细胞等细胞的表面蛋白，其编码基因位于人的第 12 号染色体上（ et 1997），推测 体位于人的第 19号染色体上。其次，一般认为 et 1990; et 1992），然而近期很多研究表明， H 蛋