【毕业学位论文】（Word原稿）棉属8个基因组物种荧光原位杂交比较及其起源与演化研究作物遗传育种博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 棉属 8 个基因组 物种 荧光原位杂交比较及其 起源与演化 研究 on on I 摘 要 棉花是我国乃至世界上最重要的纤维经济作物 ，阐明棉花的遗传进化和遗传亲缘关系，对于棉花遗传改良具有重要的理论和实践意义。 本研究以 16 个棉种为材料进行荧光原位杂交分析 ，以明确 其种间关系和起源与演化规律 。主要研究结果如下 : 1 以 45S 探针，对二倍体棉种 A、 B、 C、 D、 E、 F、 G 等 7 个基因组共 9个棉种 究发现，除索马里棉有 4 个 号、长萼棉有 2 个 号、比克氏棉有 8个 余二倍体棉种均有 6个 显看到亚洲棉有2 个强的杂交信号位于染色体短臂的近端部， 2 个中等强度的杂交信号也位于染色体短臂的近端部，另外 2个弱信号位于染色体短臂端部，而草棉的 6个杂交信号中 4个为中等强度的信号， 2个为弱信号。三裂棉的 6个 45S 且全部位于染色体短臂的端部 。值得注意的是在雷蒙德氏棉棉的 6 个交信号中，其中 2 个比较清楚的可以看到大的随体， 交位点位于次缢痕处。在所有的以 45萼棉和比克氏棉是 2个特殊的棉种，长萼棉的 45S 交信号最少，仅有 2 个，并且位于着 次缢痕处 ，这一点不同于其他棉种，其他棉种的 45S 交信号位于染色体的端部或近端部；比克氏棉有8个 45S 中 2个强信号杂交位点位于染色体长臂的端部，这也是该棉种与其他棉种的不同之处。 2 在以自身基因组 身染色体 非利加棉和雷蒙德氏棉具有不同的结果。对于阿非利加棉而言，所有的染色体均有比较强的信号分布，但是也可以看出，这些信号主要分布在染色体中部，个别染色体上杂交信号仅仅在着丝粒上，而在染色体的端部却没有杂交信号。而对于雷蒙德氏棉而言，杂交信号要弱的多。 3 以 1 染色体为靶 亚洲棉石系亚一号为探针，以雷蒙德氏棉封阻的结果，可以明显的看到 26条红色的 6条蓝色的 观地证实了陆地棉是一个双二倍体起源的棉种。以 地棉染色体为靶 鱼 精 中有 2个强信号位于 明陆地棉的供体种是亚洲棉而非草棉。 4 以陆地棉染色体为靶 陆地棉染色体为靶 明陆地棉的 45S 基因组提供。 5 在所有以陆地棉染色体为靶 维逊氏 为探针的杂交信号最强，说明陆地棉的 6 海岛棉具有 6个 中 2个在 4个在 并且海岛棉的 亚染色体组。 7 以海岛棉染色体为靶 蒙德氏棉为探针的杂交中信号最强，说明海岛棉与雷蒙德氏棉的亲缘关系最近，雷蒙德氏棉为海岛棉 8 以阿非利加棉基因组为探针，以黄褐棉基因组为靶 鲑鱼精 阻的试验，黄褐棉的 26个 2个大的 亚基因组上，但没有发现另外 4个 黄褐棉基因组为靶 阿非利加棉基因组为探针，以戴维逊氏棉封阻时，也仅能看到 2 个 双色荧光原位杂交发现，黄褐棉的所有 6 个 位 于 A 基因组上。并且这些所有的 45S 在位点已全部同步进化为 9 瑟伯氏棉的基因组与黄褐棉的 断瑟伯氏棉为黄褐棉 关键词 ： 棉花 ， 基因组 ， 起源 ， 演化 he is in It is to on in to of as 1. 5S in of in of in of in of It is 5S is in 5s in 45S in of 2. as . as of in in of 3. 6 6 as as as It is a is of . to a D 5. is of . of in of in OR . is of of . 6 as as NA as in is G. as as of in on in of 5S to a A 9. is of ey V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 细菌人工染色体 bp 基对 牛血清白蛋白 cM 摩 绿体 十六烷基三甲基溴化胺 6, 62二乙基二硫代氨基 酸 in 位杂交 乙二胺四乙酸二钠 in 荧光原位杂交 异硫氰酸荧光素 因组 h 时 内部转录间隔区 因的间隔区 kb 碱基 钟 核仁组织区 酸盐缓冲液 万分之一 糖体 DS 二烷基磺酸钠 鱼精子 AC 酵母人工染色体 录 第一章 文献综述 . 1 属的分类研究 . 1 倍体棉种起源与演化的研究 . 4 倍体棉种起源与演化的研究 . 7 属起源与演化的 究 . 9 术的发展 . 9 针的的标记及其种类 . 9 术在棉花起源与演化研究中的应用 . 12 复序列的研究 . 15 复序列的分类和结构 . 15 复序列的功能 . 15 复序列的同步进化 . 17 复序列的应用 . 19 研究 的目的、意义 . 21 第二章 二倍体棉种荧光原位杂交分析 . 22 验材料 . 24 试材料 . 24 试探针 . 25 要试剂 . 25 验方法 . 25 探针 提取 . 25 色体制片 . 28 针的制备 . 28 性和杂交 . 29 脱和信号检测 . 29 光观察 . 29 据统计 . 30 果与分析 . 30 倍体棉种的 45S 光原位杂交分析 . 30 倍体棉种的基因组比较荧光原位杂交分析 . 34 论 . 37 于 . 37 关于长萼棉的分类地位 . 37 于比克氏棉的分类地位 . 38 第三章 四倍体栽培棉种荧光原位杂交分析 . 39 料与方法 . 40 试材料 . 40 验方法 . 40 果与分析 . 41 地棉基因组的荧光原位杂交分析 . 41 岛棉基因组的荧光原位 杂交分析 . 45 论 . 49 倍体棉种 A 亚基因组供体种的问题 . 49 倍体棉种 D 亚基因组供体种的问题 . 50 因组间重复 列的同源性 . 52 、 D 基因 组与四倍体棉种亚基因组的关系 . 53 第四章 四倍体野生棉种荧光原位杂交分析 . 55 料与方法 . 55 试材料 . 55 验方法 . 56 果与分析 . 56 论 . 60 褐棉与四倍体栽培种 较 . 60 倍体棉种中的 步进化 . 61 于 丢失 . 62 褐棉的供体种 . 63 第五章 全文结论 . 66 参考文献 . 69 致谢 . 78 作者简历 . 79 中国农业科学院 博 士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 属的分类研究 棉属 (分类上属于被子植物锦葵目 (锦葵科 (棉族 (棉属是棉族中第一个被林奈 (1753)所命名并加以描述的一个属 (最初只有 3 个种 (亚洲棉 (.)、草棉 (.)和海岛棉 (.)，后来林奈又增加了 2 个种：陆地棉 (.)和宗教棉 (.)。十九世纪中叶，意大利植物学家 表了有关棉属专题论著 (866;877)，对棉属分 类首次进行了专门的研究。 他的专论中，棉属被分成 54 个种。这是一部十分成熟的论著， 979)因而称其为棉属分类史上的第一个里程碑。 1907 年， 界野生棉和栽培棉为棉属分类树立了第二个里程碑。在他的专著中，将棉属分成 42 个种和 21 个变种。 早期的棉属植物分类研究，基本依据是棉属植物的形态特征和地理分布。由于棉属植物的世界性分布，其形态特征和生长习性存在着广泛的变异，不同的分类学家所偏重的形态特征不尽相同，因而，早期分类始终未能摆脱混 乱的局面。据 976)统计，在棉属的分类历史中，棉属的种名竟达 675 个之多。 细胞学研究手段得以广泛应用之后，棉属的分类才有了关键性的突破。 1903 年，先报道了海岛棉和陆地棉棉杂交种染色体数目 X=28，后来 910)报道了海岛棉品种 染色体数 X=20。尽管他们的结论显然都是错误的，但他们确为棉属细胞学研究的开拓者。二十年后， 1923）提出亚洲棉和草棉的体细胞染色体数目 2n 26，陆地棉和海岛棉的染色体数目 2n=52。随后 924)证实了 结论。这些工作为棉属的染色体组 (分和细胞学分类奠定了基础。 1928 年， 专著棉属分类的贡献根据前人和他本人对棉花染色体数目的研究成果，把染色体数目和倍性作为棉属分类的主要依据，并结合形态特征和地理分布，把棉花分成两大类、四个亚类、 16 个种，即旧世界的二倍体棉 (2n=2x=26)和新世界的四倍体棉 (2n=2x=52)二个大类。新世界棉又分成中美洲亚类和南美洲亚类，旧世界棉分成非洲亚类和亚洲亚类。 形态特征 千差万别的具有纤维的棉种，以其共同的细胞学特征进行归类，每个亚类又具有完整的地理分布，为棉属的正确分中国农业科学院 博 士学位论文 第一章 文献综述 2 类指明了方向。 在棉属分类学中作出划时代贡献的当推美国的 940， 1942)。他在总结前人已积累的棉属细胞遗传学知识的基础上结合他本人进行的大量的种间杂交研究成果，以杂种后代减数分裂时染色体的配对情况为依据，参照棉种的地理分布，提出了划分染色体组的细胞学分类原则：即凡种间染色体同源性较高的棉种归为同一染色体组，反之则列为不同的染色体组。据此将二倍体棉种分为 A、 B、 C、 D 和 E 等 5个染色 体组，分别代表亚洲棉、非洲棉、澳洲棉、美洲棉和阿拉伯棉种的染色体组。四倍体棉种被认为是 A 染色体组和 D 染色体组种间杂交产生的双二倍体种，因此，将其定为 色体组。至此，现代棉属的分类框架才最终得以形成。以后的有关棉属的分类研究基本上就是在此框架内进行一些种或亚种（变种）的修订及新种的发现、鉴定、定名等工作。 在东非征集到的新种长萼棉（ 地理分布地归为E 染色体组， 1961）把它确定为 966)等根据陆地棉 长萼棉的杂种 倍体（ 2n=3X）及人工合成的六倍体 (2n=6x)细胞学研究，并参考前人关于陆地棉和海岛棉 色体组与 A、 B、 C、 D 和 E 染色体组杂交后产生的倍体和六倍体的染色体配对资料进行了比较分析，结果发现 萼棉与 在减数分裂时二价体和多价体频率有显著的差异， 萼棉的三倍体的单细胞平均二价体为 均多价体为 的二价体和多价体分别为 明长萼棉与 E 染色体组对 色体组棉种的遗传亲和性有很大的差异。同时在染色体大小上， E 具 有较长的染色体，而长萼棉却是中等大小的染色体。据此，966)把长萼棉定为一个新的细胞型从而提出 F 染色体组，把长萼棉确定为 原产于澳大利亚的比克氏棉（ 曾确定为 据 1979）的核型分析，它的核型显著不同于 C 染色体组的模式种斯特提棉(其染色体普遍较小，单细胞中染色体的总长度和单个染色体的平均长度分别比斯特提棉减少 且比克氏棉无随体，这是当时棉属中各棉种 所没有的现象。据此， （ 1979）提出将比克氏棉从 C 染色体组分出，另立为 G 染色体组，并确定比克氏棉为 而王坤波等（ 1994）的核型分析提供了清淅可辩的照片，比克氏棉明显具有两对随体。王坤波等（ 1994）通过比克氏棉与木槿组（ 其它棉种在随体数及 m 和 色体数目比较分析，不支持比克氏棉单独另立染色体组，建议与木槿组的其他棉种归为一个新的染色体组。最近， （ 1991）研究了比克氏棉、斯特提棉、澳洲棉、和奈尔逊氏棉的叶绿体 核糖体 限制性内切酶的内切位点。结果表明，比克氏棉的中国农业科学院 博 士学位论文 第一章 文献综述 3 叶绿体 斯特提棉的叶绿体 在着很大的同源性；核糖体 与澳洲棉和奈尔逊氏棉的同源性较好。他们认为比克氏棉来源于两个祖先：类似斯特提棉的祖先种只提供细胞质；类似澳洲棉或奈尔逊氏棉的祖先种提供细胞核。 (1997)的 析结果也支持这种看法。由此可以看出比克氏棉染色体组的复杂性，值得进一步深入的探索与研究。 最近 991)等对在澳大利亚 区发现的棉种进行研究，考虑到这些 棉种全部起源于 区，将这些棉种划归为 K 染色体组。 在棉属分类史上， 947)的分类方案上也占有重要的地位。947)继承了 928)的思路并吸收了 1940,1942)的研究成果，在其棉属的进化专著中将棉属分为 8 个组， 20 个种。 1954 年 947)分类方案相似。 1979 年， 照947 和 954)的分类方案，根据 1928)的分类传统，采用940,1942)的染色体组表示方法，进行修订，将棉属分成 4 个亚属 (7 个组 ( 10 个亚组 ( 39 个种，这是一种比较系统、最具权威并被广泛接受的棉属分类方案。近年来，随着新棉种的不断发现、补充和棉属研究工作的不断深入， 1992 年 次修订了其棉属分类方案，将棉属分成 4 个亚属、 8 个组、 9 个亚组 50 个种，这是目前最新的分类方案（表 1）。 表 . of 名 中 译 名 染色体组 地理分布 o f sp n 草棉 A 1 中东和非洲 m 亚洲棉 A 2 远东和印度 桑纳尔棉 B 非洲 异常棉 B 1 非洲 三叶棉 B 2 非洲南部 顶棉 B 3 佛得角群岛 m 三叉棉 B 非洲 斯特提棉 C 1 澳洲中部 南岱华棉 C 1 - N 澳洲东南部 鲁宾逊氏棉 C 2 澳洲西部 澳洲棉 C 澳洲中北部 纳尔逊氏棉 C 澳 洲中部 宁汉氏棉 C 澳洲最北部 瑟伯氏棉 D 1 亚利桑那州 辣根棉 D 2 - 1 墨西哥，加里福尼亚 哈克尼西氏棉 D 2 - 2 墨西哥，加里福尼亚 戴维逊氏棉 D 3 - d 墨西哥，加里福尼亚 中国农业科学院 博 士学位论文 第一章 文献综述 4 续表 1 . 名 中 译 名 染色体组 地理分布 o f sp n 克劳茨基棉 D 3 - k 加拉帕戈斯 地棉 D 4 墨科利马地区 雷蒙德氏棉 D 5 秘鲁 拟似棉 D 6 墨互哈卡州 裂片棉 D 7 墨米却肯州 三裂棉 D 8 墨西哥西部 散棉 D 9 墨哥雷罗 特纳氏棉 D 10 墨索诺拉州 施沃恩蒂曼氏棉 D 11 墨西哥 斯笃克氏棉 E 1 阿拉伯地区 索马里棉 E 2 北非 G.a 亚雷西棉 E 3 南也门 白棉 E 4 阿拉伯南部 贝纳钬尔棉 E 北非 布雷切狄氏棉 E 北非 佛伦生棉 E 索马里 长萼棉 F 1 非洲东部 比克氏棉 G 1 澳洲中部 孪生叶面棉 K 澳大 利 亚 金 伯 利 地区 m 皱壳棉 K 澳 大 利 亚 金 伯 利 地区 杨叶棉 K 澳 大 利 亚 金 伯 利 地区 m 小丽棉 K 澳 大 利 亚 金 伯 利 地区 绒棉 K 澳 大 利 亚 金 伯 利 地区 地棉 K 澳 大 利 亚 金 伯 利 地区 小小棉 K 澳 大 利 亚 金 伯 利 地区 伦敦德里棉 K 澳 大 利 亚 金 伯 利 地区 马全特氏棉 K 澳 大 利 亚 金 伯 利 地区 贵棉 K 澳 大 利 亚 金 伯 利 地区 园叶棉 K 澳 大 利 亚 金 伯 利 地区 陆地棉 (1 中美洲，世界广泛栽培 海岛棉 (2 南美，世界广泛栽培 m 毛棉 (3 夏威夷 黄褐棉 (4 巴西 达尔文氏棉 (5 加拉帕戈斯群岛 可以看出 ,经形态学、细胞学研究形成棉属的分类框架后，有关棉属物种的研究，以分类涵义而言，仅限于少数 物种的调整修订及新种的发现、定名等工作。总体而言，对棉属细胞学为主的分类系统未作重大改变。也就是说，以鉴