【毕业学位论文】（Word原稿）茶氨酸生物合成研究天然产物生物化学硕士学位论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 茶氨酸生物合成研究 on s 缩略词 文缩写 英文全称 中文名称 卞青霉素 苷三磷酸 基对 化乙锭 GA 氨酰胺酶 氨酰胺转肽酶 氨酸盐 氨酰胺 丙基硫代半乳糖苷 种培养基 密度 合酶链反应 基还原假单胞 摘 要 茶氨酸是茶叶中特 有的氨基酸，具有很高的医用价值和商业价值，但由于从茶叶中提取高纯度的茶氨酸，成本高昂。因此，开展茶氨酸的生物合成研究具有重要的理论意义和实践价值。本研究的主要目的是筛选得到可合成茶氨酸的微生物菌株，并对该菌株的培养、生物合成茶氨酸的条件以及茶氨酸合成关键酶类的基因克隆和表达等进行研究，以期为今后利用微生物发酵和基因工程的方法工业化生产茶氨酸提供理论依据。主要研究结果如下： 1. 从 6 种含有谷氨酰胺酶的微生物中筛选得到一株可以合成茶氨酸的微生物菌株硝基还原假单胞菌 ( 2. 培养研究表明，该硝基还原假单胞菌在丰富盐离子培养基中 7 小时以后进入对数生长期，18 小时以后进入稳定期。其最佳培养条件是：培养基 养温度 30、 1葡萄糖为 C 源、 氨酸钠为 N 源、自然通气量、装液量 30 40。该菌株 在传代 10 次时基本保持稳定，传代 40 次时出现不稳定性质 。 3. 摇瓶实验结果表明，硝基还原假单胞菌生物合成茶氨酸的最佳条件为：底物浓度 氨酰胺 /胺、 细胞量 70mg/养温度 30， 培养时间 24 小时。此时，茶氨酸的最大生成量为 。底物浓度 氨酰胺 /胺、 细胞量 70mg/养温度 30， 培养时间 24 小时。此时，茶氨酸的最大生成量为 。发酵小试结果表明，该条件下发酵 15 小时，； 60 小时发酵终点时，发酵液中茶氨酸平均含量为 。 4. 试图克隆硝基还原假单胞菌中谷氨酰胺酶的基因。由基因测序可知，克隆得到的基因序列与已 道的假单胞菌的谷氨酰胺酶基因序列同源性很低，其原因有待于进一步研究。 5. 本实验成功克隆、表达了 的谷胺酰氨转肽酶基因 ；所得 基因工程菌 在 底物浓度 氨酰胺 /胺、 细胞量 70mg/养温度 30，培养 24小时， 茶氨酸 的 最大 生成 量为 。 关键词 ： 茶氨酸，硝基还原假单胞菌，生物合成，谷氨酰胺酶基因克隆 , 谷氨酰胺转肽酶基因克隆和表达 is a in It is to a So of is In a of of of as 1. a 2. 30 ,1% 3. of 0mg/0 . he of 0mg/0 . A . of in 0 4. of in a 5. A . in It a . 目 录 第一章 绪 论 . 1 究目的和意义 . 1 内外研究现状 . 1 氨酸的特性 . 1 氨酸的生理功能、应用 前景 . 2 氨酸在茶树体内的分布、合成、代谢途径 . 5 氨酸的合成方法 . 10 究内容 . 12 第二章 合成茶氨酸的微生物菌株筛选 . 13 料与方法 . 13 株 . 13 器与试剂 . 13 养基 . 13 验方法 . 14 种复壮 . 14 集培养 . 14 氨酸生物合成反应 . 14 氨酸检测方法 . 14 果与讨论 . 15 第三章 硝基还原假单胞菌培养条件研究 . 17 料 与方法 . 17 料 . 17 法 . 17 果与讨论 . 18 养时间对硝基还原假单胞菌的影响 . 18 硝基还原假单胞菌生长的影响 . 19 度对硝基还原假单胞菌生长的影响 . 19 源对硝基还原假单胞菌生长的影响 . 20 源对硝基还原假单胞菌生长的影响 . 20 气量对硝基还原假单胞菌 生长的影响 . 20 液量对硝基还原假单胞菌生长的影响 . 20 基还原假单胞菌株稳定性的研究 . 21 结 . 21 第四章 硝基还原假单胞菌生物合成茶氨酸的研究 . 22 料与方法 . 22 料 . 22 法 . 22 果与讨论 . 23 应体系 茶氨酸合成的影响 . 23 细胞量对茶氨酸合成的影响 . 24 物浓度对茶氨酸合成的影响 . 24 化反应时间对茶氨酸合成的影响 . 26 氨酸发酵小试 试验 . 26 第五章 谷氨酰胺酶基因克隆 . 28 料与方法 . 28 料 . 28 法 . 28 果与讨论 . 32 基还原假单胞菌基因组 提 . 32 氨酰胺酶基因的克隆 . 33 组质粒测序 . 33 第六章 谷氨酰胺转肽酶基因克隆、表达 . 37 料与方法 . 37 料 . 37 法 . 37 果与讨论 . 41 氨酰胺转肽酶基因的克隆 . 41 组质粒表达 . 45 氨酰胺转肽酶活性测定 . 45 结 . 45 第七章 结论与展望 . 46 参考文献 . 47 致 谢 . 52 作者简介 . 53 中国农业科学院硕士论文 绪论 1 第一章 绪 论 究目的和意义 茶氨酸是茶叶中特有的氨基 酸，具有很高的医用价值和商业价值，但由于从茶叶中提取高纯度的茶氨酸，成本还非常昂贵，因此，有关它的生物合成研究越来越受到重视。目前采用茶树愈伤组织、悬浮细胞培养等方法虽然能生成天然 L 型茶氨酸，但由于运行成本过高，产品制率低，暂时还无法产业化。 微生物发酵法是目前工业化生产茶氨酸最成功的方法，日本太阳化学株式会社拥有该方法，而国内目前有关这方面的研究还未见有报道。 本研究试图从微生物的大本营中筛选出可合成茶氨酸的微生物菌株，并对筛选得到的微生物菌株的培养、茶氨酸生物合成条件以及茶氨酸合成关键酶类的基因克隆和表达 等进行研究，以期为今后利用微生物发酵和基因工程的方法工业化生产茶氨酸提供理论依据。 内外研究现状 氨酸的特性 茶氨酸 (茶叶中含有的一种特殊的非蛋白氨基酸，属于次生代谢产物，在一般植物中比较罕见，被认为是茶叶的特征氨基酸。它与茶叶的滋味及香气形成关系密切是构成绿茶品质的极重要的成分之一，甚至被作为鉴别真假茶叶的重要化学指标。茶氨酸是 1950 年日本学者酒户弥二郎首次从绿茶中分离得到的，它的化学名为 属于酰胺类化合物，有的文献中常称作谷氨酸乙胺 ( 分子式为： 子量为 图 1 茶氨酸分子结构 1. of 5自然界存在的茶氨酸均为 L 型，纯品为白色针状晶体，熔点 217 218 （分解），比旋光度 D=+居秀一 1952)。茶氨酸极易溶于水，而不溶于无水乙醇和乙醚，具有很强的茚三酮反应，可用醋酸汞和碳酸钠沉淀（但不为中性硝酸汞沉淀），易于碱式碳酸铜生成浅紫色柱状铜盐，用 25%硫酸或 6 N 盐酸水解，生成 此推 测茶氨酸是由乙胺和谷中国农业科学院硕士论文 绪论 2 氨酰胺为前导物质合成的，这一推测现已完全得到证实。茶氨酸水溶液呈微酸性（ 具有焦糖香和类似味精的鲜爽味 ， 味阀值为 茶氨酸是茶叶中游离氨基酸的主体部分 (赵和涛 1990)并大量的存在于茶树的芽叶、嫩茎及幼根中。它的含量约占茶叶干重的 1 3，占总氨基酸的 50以上，它与绿茶品质呈正相关 。 在茶汤中，茶氨酸的浸出率可达 80，与茶叶滋味等的相关系数达 高档绿茶 (成茶 )中含量最多，一般绿茶次之，红茶较少 (破坏 ) 。自日本学者首次分离出茶氨酸以 来，已出现多种分析测定方法碱式碳酸铜沉淀法、强酸性阳离子交换树脂层析法、茚三酮显色法、纸层析、薄层层析、气相色谱、氨基酸自动分析仪、高效液相及胶束电动气毛细管色谱法等。氨酸的测定方法。随着高效液相色谱技术的迅猛发展，分析速度、灵敏度和自动化程度的不断提高，该技术越来越广泛地应用于氨基酸分析领域。李布青等 (1989)研究了用氨基酸分析仪测定茶氨酸 , 发现增加柱温可以改善 分离，在 中增加乙醇量可以改善 分离。采用 25水和 5乙醇的 及、 G 为洗脱缓冲液，流量 温 70 可达到茶氨酸的最佳分离效果。郭升华在 1996 年研究了 定茶叶中茶氨酸的方法，以异硫氰酸苯酯作衍生剂，醋酸钠缓冲液与乙腈梯度洗脱，方法具有快速，精确，灵敏等特点。周光明等 (2002)研究了用高效液相色谱分离、抑制化学发光测定茶叶氨酸的分析方法。利用茶氨酸抑制 化鲁米诺（ 过氧化氢化学发光反应的性质测定茶氨酸的含量。在茶氨酸质量浓度为 0.2 g/L 时，茶氨酸抑制化学发光产生负峰的相对峰面积与其质量浓度之间的线性回归良 好。朱小兰 (2003)建立了未衍生化 定茶叶中茶氨酸含量的方法。采用 谱柱， (V： V)三氟乙酸水溶液为流动相，检测波长 203茶氨酸质量浓度在 1g L 时，其浓度与峰面积呈良好的线性关系，最低检出限为 收率为 除高效液相谱法之外 ， 1988 年池谷贤次郎等用近红外分光光度法对煎茶和抹茶中的茶氨酸进行了定量测定。 1990 年夏静等研究了用生理体液法测定茶中的茶氨酸，该法能分开茶氨酸与谷氨酰胺，但试剂价格昂贵，检测过程手续较繁琐。随着近年来分析技术和分析手 段的不断提高 ,毛细管电泳技术和液质联用技术也应用到了茶氨酸检测领域。 等 (1996)报道了采用热喷雾液质联用仪分析茶叶中多酚类物质的方法，通过测定其准分子离子峰同时测定了茶叶中的儿茶素、黄酮醇糖甙、黄酮糖甙及咖啡因、可可碱和茶氨酸。 (2000)研究了用毛细管电泳仪同时进行儿茶素、茶氨酸、咖啡因及没食子酸、抗坏血酸分析的方法。 氨酸的生理功能、应用前景 茶氨酸自发现以来，一直是被作为茶叶的主要品质成分广为研究。直至上个世纪九十年代，茶氨酸具有的一些特殊生理 功能不断地被发现，从而成为茶叶功能性成分合成和提取、应用的又一大热点。茶氨酸的主要生理功能有： (1)缓解神经紧张、焦虑作用。 等 (1999)的 动物实验表明，口服茶氨酸后通过肠道吸收后，能迅速进入血液，再通过血液循环输送到各个组织器官。 1 小时后，血清、肺、脑中浓度明显增加，之后血清和肺中浓度逐渐下降，但脑中浓度持续增加，至 5 小时达最高； 24 小时后，血清、肺、脑等组织均未检出，说明茶氨酸主要受体是脑。由于茶氨酸能通过脑中的特殊调节机构 (非特定物质不能通过 )屏障进入脑部，从而能调节脑神经机能 ，具有许多独特的生理功能。 等 (1998)研究发现 ， 茶氨酸在进入脑后使线粒体内神经传达物质多巴胺显著中国农业科学院硕士论文 绪论 3 增加。多巴胺是肾上腺素及去肾上腺素的前驱体，是对传达脑神经细胞兴奋起重要作用物质。 (2)抑制咖啡因引起的兴奋。 (1998)等研究表明茶叶有 提神兴奋作用， 但 饮茶后，却不会产生饮用等量咖啡因的兴奋作用。茶氨酸能消除小鼠因摄入咖啡因所引起的自发运动，说明茶氨酸为咖啡因的拮抗物，具有明显安神、减少紧张和松弛神经等作用。当茶氨酸用量达 1，740 mg/，可显著抑制咖啡 因所引起神经系统兴奋；咖啡因可缩短由环己巴比妥导致的睡眠时间，而茶氨酸可抑制咖啡因这种作用。 (3) 增强脑中的 波的强度，使人产生轻松感，提高学习能力和记忆力。 等 (1998)研究表明 在不同精神状态下，脑部会产生不同电流频率的脑波。脑波按其频率 (同，可分为四种，熟睡时为 波时、打盹时为 4 7 波、松弛时为 8 13 波兴奋时为 14上的 波。曾对 50 名 18 20 岁女学生进行精神焦虑状态检查 (方 法共分五级， 级为高度焦虑状态， 级为低度焦虑状态 )。选 级和 级各四名进行试验，给予 5000 20000氨酸，服用后用脑波仪测定前 30后30结果为在 级中低浓度时影响不大，高浓度时后 30 波明显大约前 30在 级中，无论是服用低浓度还是高浓度的茶氨酸，均使脑部 波的强度都明显大于对照 (0约为 。测试后，询问服用 200 氨酸受试者，服用时均无嗅、无味异常感觉。高焦虑组中服用茶氨酸后有手、足、指尖暖和感觉，说明末端血管得到扩张；同时 ，茶氨酸 有轻松、愉快、心情舒畅、放松感觉（杨志博等 2000）。另有 据 (2001)报道，茶氨酸作为镇静的有效成分，可提高大脑功能，促进大脑对学习和记忆功能。 (4) 降血压作用。 H (1995)研究报道 ， 茶氨酸对原发性高血压大鼠 (降压作用。对每组 5 只体重在 300授茶氨酸 05001,000 1,5002,000mg/配入 授 7ml/口授前和口授 60测定 压和心搏率得出，随着授予量增加，各项血压均随之下降，尤其当授予量达 1,5002,000mg/，可下降血压30且这样降压作用对血压正常的大鼠 (用不明显。另外两组 者的饲与量均为2,000mg/始平均收缩压为 果显示出，茶氨酸能降低收缩压、平均血压和舒张压约 40 谷氨酰胺却无效。 (5) 预防血管性老年痴呆症。 (1996)研究知道 随着年龄的增 长，脑栓塞等脑障碍的发病率也呈上升趋势。由此引起的短暂脑缺血常导致缺血敏感区发生延迟性神经细胞死亡，最终引发老年痴呆症。在沙土鼠的实验中，投给 10度为 50 500 茶氨酸后 ， 并使其处于 3缺血状态，发现脑中完好的神经细胞数目比对照群多，并且保护效果随茶氨酸用量的增加而提高，茶氨酸 125 时神经细胞的存活率为 60， 500 时神经细胞的存活率为 90。这说明茶氨酸能抑制短暂脑缺血引起的神经细胞死亡。兴奋型神经传达物质谷氨酸过多也会引起神经细胞死亡，这通常是老年痴呆的 病因。茶氨酸与谷氨酸结构相近，能竞争细胞中谷氨酸结合部位，从而抑制神经细胞死亡。用鼠的大脑皮层细胞做试验中 400 浓度的茶氨酸可抑制 50 L 谷氨酸引起的神经细胞死亡。这些结果使茶氨酸有可能用于对脑栓塞、脑出血、脑中风、脑缺血以及老年痴呆等疾病的防治。 (6) 增强肿瘤药物的效果。 (1996)研究表明茶氨酸本身虽无抗肿瘤活性，却能提高多种抗肿瘤药物的疗效。茶氨酸与抗肿瘤药物一起使用时，不但提高药物活性，而且还提高其中国农业科学院硕士论文 绪论 4 抑制肿瘤转移活性，并且茶氨酸不增加药物在正常组织中的浓度。其 原理均为防治药物从肿瘤细胞中流出，从而提高了药物在肿瘤细胞中的浓度 ( et 999 ; et 2002)。对于药物从肿瘤细胞内往外流，研究认为谷氨酸盐进入细胞后生成谷胱苷肽，谷胱苷肽会与药物结合而被泵出细胞外。而茶氨酸能减少细胞对谷氨酸的吸收，使细胞中谷胱苷肽的生成量减少，从而抑制了药物流出。这些研究将使肿瘤治疗有了新的发展，利用茶氨酸来减少毒性强的抗肿瘤药物的剂量，减少其副作用，使肿瘤治疗变得更有效并且安全。 (7) 抑制肝癌细胞浸润。在癌细胞的生长过 程中，原生部的癌细胞会通过对周围组织的浸润进行局部扩散，转移到身体其他部位。抑制癌细胞的浸润是延长患者生命的一个有效手段。用大鼠肠道的中皮细胞培养基中，观察肝癌细胞浸润状况的实验中，添加 25 茶氨酸时，癌细胞的浸润开始受到抑制，此抑制作用在 25 400 浓度之间随着茶氨酸浓度的增加而增强。并且在空腹一夜的大鼠胃中投入茶氨酸后，其血清也有抑制癌细胞浸润的作用，在 1 小时采制血清检测结果表明抑制作用最强。此时浸润的癌细胞数减少了约 30，此后抑制作用逐渐降低。这与茶氨酸被吸收到体内后在血液中的 浓度变化相关，血液中茶氨酸浓度高，其阻碍癌细胞浸润的能力也就强 ( et 998; et 000)。 (8)减肥作用。用混有 氨酸的饲料喂养小鼠 16 周后，其体重比对照群有明显减少，腹腔脂肪减少到对照群的 58，同时血压中脂肪级胆固醇减少了 28。因此，茶叶的减肥作用是指茶叶中包括茶氨酸在内的多种成分共同作用的结果。 研究发现 茶氨酸尤其对减少体内胆固醇有效 。 (9) 改善经期综合症。经期综合症（简称 女性在月经前 3 到 10 日中出现的精神及 身体上的不舒适的症状。 等 (2001)考察了茶氨酸对 改善作用，让 24 名女性每日服用茶氨酸 200 个月后 状有明显改善。具体有头痛、腰痛、胸部胀痛、无力、易疲劳、精神无法集中、烦躁等症状得到改善 i。其机理还需进一步调查，可能与茶氨酸的镇静作用有关。 (10) 提高免疫力，防御病毒。 2003 年 5 月美国国家科学院进度报告发表了哈佛大学研究人员 (2003)就茶氨酸在人体肝脏分解为乙胺和谷氨酸后，前者调动了 伽玛 这种人体血液 免疫细胞作出抵御外界侵害的反应，成为抵御放大细菌、病毒因子的第一道防线。继而 T 型细胞促进干扰素的分泌量激增 5 倍，对细菌的歼灭反应提高 10 倍，可是喝咖啡者的免疫细胞的干扰素分泌量没有变化。这种调节机体免疫系统的功能使茶中的 可制成药物以提高体内的抗传染能力 (1999)。 美国的科学家研究发现茶氨酸可以让人体对疾病的抵抗力提高五倍。这种物质具有调动免疫细胞活力的功能，从而使肌体可以更好地抵抗细菌、病毒、真菌等，可以预计未来有一天会把这种物质转化成治疗药物。尤其在 间，国内 外专家都提出，饮用绿茶有助于增起人体免疫力，预防传染病。美国的最新研究，这些可能均与茶氨酸的作用有关，哈佛医学院布考斯基博士通过对志愿者进行测试，证明茶氨酸可以通过调节免疫细胞来增强人体的免疫系统，抵抗致病微生物如病毒、细菌、真菌的入侵 (林智 2003) 。 早在 1985 年，美国食品和药物管理局（ 认可了茶氨酸，并确认人工合成茶氨酸是一种公认安全的物质（ 在使用过程中不作限制用量的规定。其安全性实验表明，茶氨酸的大鼠急性毒性在 5g/上；连续服用 28 天（每天 2g/氨酸的亚急性实 验中，大鼠中国农业科学院硕士论文 绪论 5 未见任何毒性反应；在致突变实验中也没有发现茶氨酸的任何诱变作用；细菌恢复突变实验也证明未导致基因变异。因此，可以说茶氨酸是一种十分安全的，无毒的茶叶天然产物，可广泛应用于食品和医药行业。茶氨酸可广泛应用于下列行业 (杜荣茂 2002)： (1)可作为饮料，食品的品质改良剂、风味的添加剂，改善茶叶中咖啡碱和茶多酚的苦涩味，添加到咖啡，巧克力，布丁，果冻，口香糖，啤酒等食品中 (2)功能食品的添加剂，来缓解神经紧张，提高记忆力和益智等； (3)降血压和抗肿瘤的辅助药物； (4)癌症治疗的辅助药物 (5)可研制增强 人体免疫力，抵抗致病微生物的新药 ； (6)减肥的有效成分，添加到食品、保健品中。 (7)净化饮用水、及除臭剂的有效成分，目前日本以拥有这两项专利。 氨酸在茶树体内的分布、合成、代谢途径 氨酸的分布 发芽前的种子中主要的氨基酸和酰胺是茶氨酸；发芽后，茶树子叶仍以茶氨酸和精氨酸为主。但是，根中的茶氨酸占氨基酸总量的 80左右，精氨酸占 10左右。当茶树幼根和茎叶开始生长时，他们所含的茶氨酸是由子叶运输而来的 (宛晓春， 1979；沈同和王镜岩， 1981)。不久，幼苗即将开始分化，于是根 部开始吸收无机氮合成氨基酸。茶氨酸分布在茶树各个组织的含量差异较大，以第一叶、子叶含量，明显较其他组织高。此外，茶氨酸在各个组织中的相对含量还受茶树的生育阶段、营养状况的影响。茶树新梢开始萌发以后，主根和成叶中贮藏的氮开始趋于减少，而茎、枝、新梢中贮存的含氮量递增。随着新梢的生长发育，氮素不断的往新梢运输，根部吸收的氮则大量的运送给叶部。杨贤强 (1982)研究表明 茶树因施肥种类不同，对其氨基酸、酰胺等的分配和积累亦有明显差异，施用铵态氮肥初期，茶树体内谷胺酰氨的浓度急剧上升，茶树根部茶氨酸、精氨酸和谷氨酰胺 的浓度叶呈直线上升，但不久除茶氨酸的浓度仍继续提高外，其他氨基酸都有所下降。这时，地上以精氨酸为主，根部主要是茶氨酸。硝态氮肥的用量与根部氨基酸类化合物的浓度不呈现上述关系。茶氨酸的积累和分布与其转移速度和利用速度有关（杨贤强， 1981；陈昕， 1999）。茶树氨基酸中以谷氨酸利用最快，而茶氨酸贮存期长，因为茶氨酸由根部转移到叶部的速度和叶部利用速度都比谷氨酸慢，新梢中的茶氨酸从萌发开始就具有较高的含量，随着新梢的生长一直保持较高的水平。 氨酸的体内合成、代谢途径 佐佐冈启等 (1963)用同 位素 记的谷氨酸和乙胺的方法饲喂茶籽幼苗，发现谷氨酸和乙胺是茶氨酸合成的直接前导物，并且随着减少乙胺的饲喂量，