纤维素酶的结构与功能综述..

研研究究生生课课程程作作业业 综综述述 题目 题目 纤维素酶的结构与功能纤维素酶的结构与功能 食品 学院 食品工程专业 学 号 学生姓名 课 程 食品酶学 指导教师 二 一三年十二月 1 纤维素酶的结构与功能 摘要 摘要 人类的生命活动离不开酶 生物体的一切新陈代谢活动都离不开酶 并且工业酶产业正在迅速发展 本文简单阐述了酶的结构与功能 重点以纤 维素酶为例子 阐述它的来源 结构 分类 催化机制以及在各行业的应用 并对纤维素酶的发展前景作了一定展望 关键词 关键词 纤维素酶 结构 家族 功能 The structure and function of cellulase Abstract Human s life activities is dependent on the enzyme and all the metabolic activity of organisms cannot leave the enzyme and industrial enzyme industry is developing rapidly This article simply expounds the structure and function of enzymes The key to cellulose enzyme as an example expounds its source structure classification catalytic mechanism and application in various industries and lastly expect the development prospect of cellulase Keywords cellulase structure family function 2 1 前言 酶是生物体组织或细胞内具有特殊催化活性的蛋白质 亦称生物催化剂 根据蛋白质分子的组成和盘曲折叠方式 可以将酶分为一级结构和高级结构 二级结构和三级结构 与酶的催化功能密切相关 结构的改变会引起酶 催化作用的改变或丧失 1955 年 Sanger 等报导了胰岛素的氨基酸序列 人 们开始把视线注意在酶的结构上 随后 1963 年 核糖核酸酶的一级结构被 测定 之后用 X ray crystallography 测定了 ribonulease lysozyme chymotrypsin trypsin papain 和 carboxypeptidaseA 的三级甚至四级结构 一级结构就是指蛋白质分子中肽链的氨基酸残基的排 列顺序 由于半胱氨酸侧链的巯基经氧化后 能形成 S S 键 因此在蛋 白质分子的链内或链间都有可能形成二硫键 二级结构指蛋白质分子的肽链 本身三维空间的规律性 三级结构就是蛋白质的二级结构按照一定方式再盘 曲折叠 并通过氢键和疏水键维系的结构 且酶蛋白的一级结构是基础 但 必须有一定的空间构型 一般指二级 三级结构 时才呈现活性 1 酶的基本组成单位是氨基酸 20 种氨基酸按不同顺序排列组合而成具有 一定空间结构的多肽链 各种氨基酸还具有不同的侧链 各种侧链又有不同 的化学反应性 它们的相互作用形成各种化学键 如离子键 氢键 疏水键 等 酶分子的特定化学结构反映了一定的催化功能 酶与那些化学催化剂 相比 有一些显著的催化功能 比如高效催化能力 以及在温和反应条件下 的高度选择性 在有机合成领域 酶已经被作用催化剂选择性的合成有机混 合物 所有的天然高分子聚合物生产都是通过酶的体内催化得到的 2 1961 年国际酶学委员会 Enzyme Committee EC 根据酶所催化的反 应类型和机理 把酶分成 6 大类 如表 1 所示 表 1 酶的分类及其反应本质 大类反应本质亚类亚 亚类 氧化还原酶电子转移供体中被氧化基 团的性质 受体的类型 转移酶基团转移被转移基团的性 质 被转移的基团的 进一步描述 水解酶水解被水解的键的类 型 酯键 肽键 底物的类型 糖 苷 肽等 裂合酶键裂开被裂开的键 C S C N 等 被消去的基团 异构酶异构化反应的类型底物的类别 反 应的类型和手性 的位置 连接酶键形成被合成的键 C C C O C N 等 底物 S1 底物 S2 第三底物 共底物 几乎 3 是核苷酸 自然界中 一切生命现象都与酶有关 生物体的新陈代谢过程都在酶的 催化作用下进行 并受酶的控制和调节 如果离开了酶 新陈代谢就不能进 行 生命也就停止 因此 酶学的研究有着重大的理论和实践意义 近年来 分子生物学领域 在不断涌现的新方法和新技术的推动下 使酶的结构与功 能的关系愈加清晰 本文以纤维素酶为具体例子 详细介绍了纤维素酶的来 源 结构 催化机制 应用等内容 2 纤维素酶的概念 自 1906 年从蜗牛消化道发现纤维素酶以来 陆续报道了细菌 放线菌 丝状真菌等许多微生物中纤维素酶的存在 1954 年开始 美军 Natick 实验室 就已研究了军用纤维素材料微生物降解的防护问题 后来发现纤维素经微生 物降解后 可产生经济 丰富的生产原料 且有望解决自然界不断产生的固 体废物问题 于是纤维素酶得到了广泛的关注 2 1 纤维素酶的来源 不同的微生物合成的纤维素酶在组成上有显著的差异 对纤维素的降解 能力也大不相同 自然界可以产生纤维素酶的微生物主要有细菌 放线菌 真菌等 由于放线菌的纤维素酶产量极低 研究很少 细菌的产量也不高 且主要是内切葡聚糖酶 大多数菌所产纤维素酶对结晶纤维素没有活性 另 外 所产生的酶是胞内酶或吸附于细胞壁上 很少能分泌到细胞外 增加提 取纯化难度 在工业上很少应用 目前 用于生产纤维素酶的微生物菌种大 多都是丝状真菌 其中产酶活力较强的菌种为木霉属 Trichoder ma 曲霉属 Aspergillus 和青霉属 Penicillium 特别是里氏木霉 Trichoderma reesei 及其 近缘菌株较为典型 丝状真菌具有产酶的诸多优点 产生的纤维素酶为胞外 酶 便于酶的分离和提取 产酶效率高 且产生纤维素酶的酶系结构较为合 理 同时可产生许多半纤维素酶 果胶酶 淀粉酶等 同时 其生长环境粗放 酶易提取 且菌株安全无毒 因而里氏木霉被公认为是最具有工业应用价值的 纤维素酶生产菌 3 2 2 纤维素酶的结构 关于纤维素酶的结构 第一次报道是 Pettersson 和 Bhikhabhai 关于里氏 木霉的 I 型外切纤维素酶的氨基酸序列中 发现其与来自同物种的内切葡聚 糖酶相关 4 丝状真菌所产的典型游离纤维素酶分子具有多结构域的构架 包括碳水化合物结合模块 Cellulose binding module CBM 其通过柔性的连 接肽 Linker 连接至催化结构域 Catalyticdomain CD 上 另外部分酶分 子还含有其他结构域 构成厌氧细菌纤维小体的纤维素酶分子一般由一个对 接模块 Dockerin 通过连接肽与一个催化结构域 CD 连接 其中对接模块 4 可与支架蛋白 Scaffoldin 又称作脚手架蛋白 的粘连模块 Cohesin 结合 而支架蛋白一般还会存在一个 CBM 5 CBM 在结合及降解天然纤维素的过 程中具有重要作用 而 CD 则主要是催化糖苷键的断裂 纤维素酶包括三个 酶活性 内切葡聚糖酶 Endoglucanase EG EC 3 2 1 4 可以切断纤维素 链的 1 4 键 外切葡聚糖酶 Cellobiohydrolase CBH EC 3 2 1 91 EC3 2 1 176 又称纤维二糖水解酶 可以移除自由链端的纤维二糖 葡萄 糖苷酶 glucosidase BGL EC 3 2 1 21 可以水解纤维二糖成为葡萄糖单 元 6 不同来源 不同组分的纤维素酶分子量差别较大 如 Geotrichum candidum 产生的一种内切葡聚糖酶 其分子量为 130000D 而斜卧青霉的 EG 的一个组分 分子量仅 24000D 纤维素酶分子的一级结构都具有类似的 结构 即由球状的催化结构域 链结区和纤维素结合结构域 CBD 三部分 组成 从酶分子的高级结构来说 不同来源的酶分子又具有不同的高级结构 如 Clostridium cellulovorans 包括两个多纤维素酶体 每个小体又都包含 9 个 相同组分的亚单位 而其中一个小体的酶活性是另一个小体活性的 4 倍 足 以说明纤维素酶组成的复杂性 7 2 3 纤维素酶的家族 根据蛋白质结构域中氨基酸序列的相似性 将不同物种来源的碳水化合 物活性酶类 Carbohydrate Active enZYmes CAZy 分成不同的蛋白质家族 将蛋白质氨基酸序列相似度高于 30 的归为同一 GH 家族 其中糖苷水解 酶现已有 131 个家族 纤维素酶类分布在至少 17 个 GH 家族中 是糖苷 水解酶数据库中家族数目最多的一类水解酶类 不同家族的纤维素酶具有不 同的演化历史和进化起源 因此不同 GH 家族之间的亲缘关系不同 有的亲 缘关系比较近 如 GH7 家族只含有真菌的水解酶类 GH8 家族只含有细菌 产生的水解酶类等 有的亲缘关系较远 如 GH9 家族的纤维素酶 产生该 类酶的生物种类广泛 有细菌 包括好氧菌和厌氧菌 真菌 植物与动物 原生动物与白蚁 另外 GH5 与 GH12 家族的成员也广泛分布于古菌 细 菌与真菌三类生物中 不同的微生物产生的纤维素酶属于不同的类别 如隶属于丝状真菌的瑞 氏木霉 Trichoderma Reesei 红褐肉座菌 Hypocrea jecorina 的无性型 其分 泌的纤维素酶主要分布于 GH5 GH6 GH7 GH12 GH45 与 GH61 家族 放线菌中的褐色高温单孢菌 Thermobifida fusca 主要有来自 GH5 GH6 GH9 与 GH48 家族的相关纤维素酶基因 而好氧细菌中哈氏 噬纤维菌 Cytophaga hutchinsonii 主要产生 GH5 与 GH9 家族的相关纤维 素酶 8 厌氧细菌中的热纤梭菌 Clostridium thermocellum 主要产生 GH5 GH8 GH9 与 GH48 家族的相关蛋白 同一家族具有相同的催化断 键机制 同一族系 甚至不同族系都可能会具有相同的断键机制 9 表 2 列 5 出了部分主要纤维素酶家族的蛋白结构折叠类型 催化机制及其他主要信息 6 表 2 主要纤维素酶家族的基因序列 拓扑结构 催化机制及其成员信息统计 表 3 纤维素酶的催化机制及应用 3 1 催化机制 纤维素是地球上最丰富的生物资源 最初是在植物和海藻的细胞壁结构 中发现的 同时也可以从其他的途径生产纤维素 比如细菌 纤维素是由 1 4 糖苷键连接 D 葡萄糖单元形成的一条线性高分子链 超过 10000 个葡萄 糖残基 由于纤维素的结构非常紧密 很难通过一些化学方法将其彻底水解 要利用纤维素生产绿色能源是一个难题 而纤维素酶却能高效水解纤维素酶 目前我们了解到 纤维素酶直接作用于纤维素 最开始的两个酶行为是 将其分解为纤维二糖和葡萄糖 这是在内切纤维素酶和外切纤维素酶的协同 作用下实现的 这种纤维二糖随后被纤维二糖酶水解成为葡萄糖 内切葡聚 糖酶和外切葡聚糖酶可以分解水溶性纤维糊精和非晶态纤维素 但是外切纤 维素酶是降解晶态纤维素的最佳酶 10 纤维素酶水解纤维素的催化机制如图 1 所示 11 它揭示了在降解完整纤维素体系过程中观察到 在经过大量水解 后纤维素分子结构几乎没有发生很大变化的原因 可以归结于单个酶分子是 对酶分子的不同部分进行修改 7 图 1 C fimi 酶降解纤维素的示意图 其中 直线表示结晶纤维素 锯齿线表示非结晶纤维素 由示意图可以看 出 Cel6A 是一种与非结晶纤维素具有高度亲和力的非连续性内切葡聚糖酶 同时 Cel5A 是一种引起非结晶纤维素解聚的连续性内切纤维素酶 Cel6B 是 一种进攻纤维素非还原性末端的外切葡聚糖酶 同时 Cel48A 是一种分解纤 维素还原性末端的连续性外切葡聚糖酶 3 2 应用 纤维素酶广泛应用于植物性农产品加工 饮料和调味品的酿造 纺织工 业 纸张回收 清洁剂酶 动物饲料添加剂等方面 随着石化能源的日益枯竭 生物资源由于其资源丰富 可再生性和不增 加温室气体排放等优点 正日益引起政府和社会的重视 采用纤维素酶将生 物质水解为糖 再发酵可产生物液体燃料 如生物乙醇 丁醇和碳氢化合物 等 为解决能源危机展现了新的曙光 若纤维素酶水解生物质产生的乙醇 丁醇或其他糖发酵产品成为主要运输燃料 那么纤维素酶将会成为世界第一 大工业 为降低成本 植物基因工程正致力于研究利用植物自身生产纤维素 酶来讲解纤维素 12 且蛋白质的多样性 需有效地讲解植物细胞壁 并且由 于真菌产酶的多样性 建立一个与真菌产酶活性相当的植物产酶体系是相当 困难的 Saeid Karkehabadi 等人 13 致力于降低生物生产乙醇的成本做了研究 从嗜热菌中发现了一种 61 家族蛋白 它可以提高 T reesei 粗纤维素酶预处理 玉米秸秆的活性 使酶成本降低了数倍 并且 T reesei 菌中含有多种 61 家族 基因 并且 61 家族蛋白结构中不含油类似于纤维素结合位点的区域 具体来说 纤维素在食品行业 一方面主要进行橄榄油以及果蔬汁的榨 取 去除掉果蔬汁以及蔬菜汁的沉淀物 促进谷物水分吸收 去除豆子中的 豆衣 实现谷物蛋白以及淀粉的成功分离等 另一方面 纤维素可以用于提 取纤维寡糖等可溶性糖 脱粒细胞壁 取出有用的蛋白等 在纺织行业中 纺织行业纤维素酶的应用仍然属于比较新兴的应用 主要用于抛光以及打磨 两个阶段 日常应用范围也比较广 主要是能够有效的取出衣物表面存在的 碎纤维 方便家庭日常的洗涤工作 通过抛光以及打磨两个阶段 提高衣物 光泽 在制酒工业中 纤维素酶主要有力于葡萄酒以及啤酒的制造 利用纤 维素酶 能够促进水解制酒过程中葡萄汁以及大麦汁 有效的分解沉淀物 提高过滤的效率 增加酒香 提高酿酒的效率 促进酿酒业的发展 饲料行 业我我国农业的基础 是保证满足十几亿人口大国温饱的关键环节 而纤维 素酶又是其中的重点问题 纤维素酶加入到饲料当中 能够起到很好的补充 作用 增强动物体能 防止动物反刍事件发生 除此以外 还能通过应用在 纤维素物质如去掉谷物壳等中 有效提高动物消化的效率 并且分泌相应的 物质 促进动物体内的粗糙粮食得到消化以及吸收 8 4 总结与展望 纤维素酶作为一种生物工程主要建设工业酶 其成功的提取以及应用 对于保证我国解决能源以及食品问题 促进我国农业发展有着空前意义 纤 维素酶凭借其价格以及成本低廉 应用广泛 使用方便等特点 已经成为人 们关注的热点话题之一 而天然的来自真菌的纤维素酶大多为酸性酶 在碱 性条件下不能有效地发挥作用 而且纤维素酶的活性和热稳定性有限 不能 满足使用的需要 蛋白质工程技术和酶的体外定向进化技术为天然纤维素酶 分子的改造提供了有效的途径 可以在基因水平上 通过定点突变 易错 PCR DNA 改组 DNAShuffling 克隆等手段产生各种各样的突变体 再从 中筛选出符合人们需要的性质改善的突变酶 如耐碱性酶 比活力提高的酶 热稳定性提高的酶等 最后 将该突变酶的基因高效表达 或者引回原宿主 同源置换野生型基因 即获得了经分子改性的高效纤维素酶产生菌 随着基因组学 蛋白质组学 结构组学等技术的迅速发展 以蛋白家族 的序列比对与结构模建为基础 通过分析纤维素酶序列 结构与功能的进化 关系 研究酶分子的活性架构及其持续性催化的分子动态过程 有助于阐明 其催化机制 从而奠定理性设计的理论基础 可以预见的是 随着越来越多 新的基因被克隆出来和新的分子设计理念的出现 微生物酶的应用前景会越 来越好 因此 人们还必须不断的改进现有的纤维素酶分子改造技术 探索 发明新的更高效的文库构建和筛选方法 以期为纤维素酶改造成为更加稳定 更加适应外界环境条件创造更加诱人的前景 9 参考文献 1 袁静明 酶的结构与功能 J 生物化学与生物物理进展 1975 01 47 55 2 Hiroshi Uyama Shiro Kobayashi Enzyme catalyzed polymerization to functional polymers J Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic 2002 19 117 127 3 陈红歌 张东升 刘亮伟 纤维素酶菌种选育研究进展 J 河南农业科学 2008 08 5 7 4 Macromo16cules V6g6tales Cellulases and their interaction with cellulose J CELLULOSE 1994 1 169 196 5 王金兰 王禄山 刘巍峰 等 降解纤维素的超分子机器研究进展 生物化学与 生物物理进展 J 2011 38 1 28 35 6 Dan Peng Zhoulin Lan Chuling Guo et al Application of