【毕业学位论文】（Word原稿）荧光假单孢菌脂肪酶基因的克隆、改造及其在毕赤酵母中的表达动物营养与饲料科学博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士 学位论文 荧光假单孢菌 脂肪酶 基因的克隆、改造及 其 在毕赤酵母中 的 表达 of a of a 要 脂肪酶（ 一种 广泛存在的水解酶，能够催化甘油三酯酯键的断裂。除此之外，脂肪酶还具有多种酶活性。因其催化功能的多样性及 作为一种生物催化剂的优越性，脂肪酶在许多领域中具有广泛的应用。 在动物体内，胰腺 分泌脂肪酶用于消化食物中的脂肪。将脂肪酶作为饲料 添加剂应用于动物养殖中具有广阔的应用前景，首先脂肪酶可以消除植物性饲料原料中的脂质抗营养因子，同时可以弥补幼禽幼畜消化道内脂肪酶的不足。但是已实现产业化生产的脂肪酶产品中， 定性多在中性偏碱范围内，对酸的耐受性较差， 适合于饲料用的品种 很少 ，目前国内外也尚未见有对适合于饲料用的耐酸性脂肪酶的表达研究。本论文以毕赤酵母表达适合于饲料用脂肪酶为研究目标， 对荧光假单孢菌脂肪酶基因进行了克隆、改造并分别将原始基因和改造基因在毕赤酵母中进行了表达， 主要工作包括 以下内容： 1对 发表的荧光假单孢菌脂 肪酶基因序列进行比对，根据两个同源性高的区域序列设计 简并 引物，以基因组 模板 增到基因内部的一段序列，然后应用反向 得了完整的基因序列，已在 册，登录号： 2根据毕赤酵母密码子的偏爱性， 同时综合真核基因表达中影响表达调控的因素， 在不改变氨基酸序列的基础上对荧光假单孢菌脂肪酶基因进行了密码子改造。通过 合酶反应，获得了改造的荧光假单孢菌脂肪酶基因。 3将荧光假单孢菌脂肪酶原始基因和改造基因在毕赤酵母 进行了分泌表达，摇瓶水平 诱导液 酶活力分别 为 91U/密码子改造后表达量提 高 了 2 倍以上 。 4 重组脂肪酶具有优良的酶学性质： 最适 10 范围内，脂肪酶的相对活力都在 60以上； 12 处理 30 仍然保留了较高的酶活力，均在 70以上，说明该酶具有较强的酸碱耐受性；最适作用温度为 50 ，在 35 60 酶相对活力在 60以上；该酶具有较强的耐热性， 60 保温 30 余酶活力依然达到 70；金属离子对脂肪酶酶活力影响不大；重组脂肪酶能够抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解。 综合以上情况，重 组荧光假单孢菌脂肪酶 能够耐受胃液 围内的酸性和胃蛋白酶的作用，在消化道特别是消化的主要部位小肠的 围内具有较高的酶活力；具有较高的热稳定性，在消化道温度范围内具有约 80的酶活力； 重组脂肪酶能够抗 胰蛋白酶的水解， 因此， 荧光假单孢菌脂肪酶非常适合于应用为饲料添加剂 。 关键词：荧光假单孢菌 ， 脂肪酶 ， 基因改造 ， 毕赤酵母 ， 表达 of of at a of of as In of by in an as in of in As pH is t as of In we of is to as 1. on of A CR to of 2. to in in NA a 3. . of in mL 1U/of 4. pH of 10, 0%. in .2 2, 0%, 0 . In 5 0 , 0%. It 0 0 0%. on of It pH of of In of 0%. of to . as 缩略表 缩写 英文 中文 基对 六烷基三甲基溴化铵 d ，天 二胺四乙酸 g h 时 D- 丙基 D硫代半乳糖苷 道尔顿 钟 克酰胺腺嘌呤二核苷酸 放阅读框 丙烯酰胺凝胶电泳 碱度 硝基苯酚 酸对硝基苯酯 分钟转数 s 二烷基磺酸钠 D- 溴 4氯 3吲哚 D半乳糖苷 目 录 第一章 绪 论 . 1 1 脂肪酶的研究进展 . 1 脂肪酶的来源及产脂肪酶微生物的选育 . 2 脂肪酶的结构及催化机理 . 4 脂肪酶的性质 . 6 脂肪酶的生产 . 8 脂肪酶的应用 . 11 2 假单孢菌脂肪酶研究进展 . 15 假单孢菌脂肪酶生化性质 . 15 假单孢菌脂肪酶基因克隆 . 17 假单孢菌脂肪酶基因表达调控 . 18 假单孢菌脂肪酶分泌机制 . 19 3 毕赤酵母表达系统研究进展 . 20 毕赤酵母表达宿主菌 . 20 毕赤酵母表达载体 . 21 外源基因的整合 . 22 外源基因在毕赤酵母中的表达 . 22 毕赤酵母表达系统的优化 . 23 毕赤酵母表达系统的局限性 . 25 4 本研究的意义与目的 . 25 本研究的意义 . 25 本研究的目的 . 28 第二章 荧光假单孢菌脂肪酶基因的克隆 . 29 1 材料与方法 . 29 菌种和载体 . 29 工具酶和生化试剂 . 29 试剂盒 . 29 培养基及溶液配制 . 29 常用仪器 . 31 荧光假单孢菌基因组 . 31 引物设计 . 32 . 33 反向 . 33 目的基因片段的回收 . 34 . 35 受态细胞制备及转化方法 . 35 . 36 重组单克隆的 . 37 2 结果与分析 . 37 3 讨论与小结 . 40 第三章 荧光假单孢菌脂肪酶基因的改造 . 41 1 材料与方法 . 41 菌种和载体 . 41 工具酶和生化试剂 . 41 试剂盒 . 41 培养基及溶液配制 . 41 常用仪器 . 41 基因合成示意图 . 42 引物设计 . 43 基因合成过程 . 43 链延伸反应 . 45 . 45 片段拼接反应 . 46 目的基因片段序列测定 . 46 2 结果与分析 . 46 脂肪酶改造基因 . 47 脂肪酶改造基因 . 49 3 讨论与小结 . 52 第四章 荧光假单孢菌脂肪酶原始基因和改造基因在毕赤酵母中的表达 . 54 1 材料与方法 . 54 菌种和载体 . 54 工具酶和生化试剂 . 54 试剂盒 . 54 培养基及溶液配制 . 54 仪器 . 56 重组表达载体 . 56 重组表达载体 . 57 质粒 . 58 重组表达载体的线性化 . 59 毕赤酵母感受态的制备 . 60 转化毕赤酵母 . 60 重组毕赤酵母的筛选 . 60 重组毕赤酵母的 证 . 61 目的基因在毕赤酵母中的表达 . 61 重组脂肪酶的活力检测 . 62 重组脂肪酶的酶学性质研究 . 64 2 结果与分析 . 66 重组表达载体的构建 . 66 重组毕赤酵母的筛选和鉴定 . 68 重组毕赤酵母的诱导表达 . 70 重组脂肪酶的酶学性质研究 . 72 3 讨论与小结 . 77 关于脂肪酶在毕赤酵母中的表达 . 77 关于脂肪酶的活力测定 . 78 关于脂肪酶的酶学性质 . 79 第五章 结论与工作设想 . 82 1 主要研究结论 . 82 2 本研究的创新点 . 83 3 下一步的工作设 想 . 83 参考文献 . 84 致 谢 . 97 附 录 . 99 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪 论 二十世纪 50 年代人们已经认识到酶制剂在饲料中添加的作用， 但由于其生产成本昂贵 而进展缓慢 ， 到 80 年代由于转基因技术和微生物发酵工业的长足进步，饲用酶 制剂 应用进入了迅猛发展的阶段，不管是在学术研究方面还是在技术应用方面，都取得了举世瞩目的成绩。 酶制剂作为一种安全高效的生物催化剂可以提高畜禽和水产动物的生产性能 ； 通过消除饲料中的抗营养因子，酶制剂能够提高饲料原料特别是非常规饲料原料的利用率，开发新的饲料资源，对缓解饲料资源短缺具有巨大的 作用 ；同时，酶制剂通过提高营养物质特别是氮和磷的消化 利 用，可以 有效的减少由于饲料中某些营养 成分大量排放造成的养殖业环境污染。 因此，饲料酶制剂一直是近 年来国内外动物营养研究的热点之一，也是生物技术在饲料工业和养殖业应用最活跃的领域。 饲用酶制剂的种类有很多，脂肪酶也是其中重要的一种。幼年动物分泌的内源酶较少，成年动物处于病理、应激状态时内源酶也会发生分泌障碍或分泌减少。在饲料中添加蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等会增加消化道内这些酶的浓度，从而加强相应营养物质的消化和利用速度，既保证了畜禽对饲料中营养物质的充分利用，又有利于畜禽产品的整齐度。 相对于其它酶制剂而言，对于脂 肪酶的理论研究和应用研究的投入要少的多， 其中的原因，笔者认为， 主要 是由于脂肪酶的特殊性增加了对其进行研究的难度，因此导致了对脂肪酶的研究和应用要相对滞后。 基于这种现状，对脂肪酶研究进行一些探索性的工作，从而推动脂肪酶在饲料工业中的应用，也是一件非常有意义的工作。 1 脂肪酶的研究进展 脂肪酶（ 广泛存在的一种酶，在脂质代谢中发挥重要的作用。在油水界面上，脂肪酶催化三酰甘油的酯键水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸。除此之外，还有 多种酶活性，例如催化多种酯的水解、合成及外消旋混合物的拆分（ ， 1991； ， 1999）。脂肪酶反应条件温和，具有优良的立体选择性，并且不会造成环境污染，因此，在食品、皮革、医药和洗涤中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 2 剂等许多工业领域中 均 有广泛的应用。近年来，非水相酶学的研究又进一步拓展了脂肪酶的应用领域，利用脂肪酶在有机相 中 催化的各种反应可以合成许多高价值产品。脂肪酶的应用研究正日益增加，采用它进行新产品的开发也正成为众多科学家的研究课题。 脂肪酶的来源及产脂肪酶微生物的选育 脂肪酶是最早被研究的酶类 之一，已有 170 多年的 研究 历史。 1834 年报道兔胰脂肪酶； 1854 年报道胃脂肪酶 ； 1871 年报道植物种子脂肪酶；微生物脂肪酶则在二十世纪初才发现。 脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻子、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他 的 酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体 内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富（ ， 1999）。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用 作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。 据估计，细菌有 28 个属、放线菌 4 个属、酵母菌 10 个属、其他真菌 23 个属共计达 65 个属的微生物产脂肪酶（张树政， 1998） 。 但 实际上，脂肪酶在微生物界的分布远超过这个数目，从脂肪酶的作用来看，更多的微生物中应该有脂肪酶的合成，只是量多少的问题。高产脂肪酶菌株 多 来源于细菌、酵母和霉菌，其中假丝酵母属、假单孢菌属和曲霉属 都 是重要的来源，褶皱假丝酵母最广泛的用于脂肪酶的制备（ ， 1998）。表 1出了一些常见的产脂肪酶的微生物。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 3 表 1见的产脂肪酶的微生物 名 黑曲霉 米曲霉 白地霉 毛霉 戴 尔根霉 少根根霉 米根霉 绵毛状腐质霉 褶皱假丝酵母 解脂酵母 圆弧青霉 粘质色杆菌 多球菌 荧光假单孢菌 自然界中存在的超过 99的微生物是不能培养的，因此从用传统的培养技术分离到的微生物中筛选新的生物催化剂的方法是非常有局限性的。利用免培技术，直接从环境微生物中提取基因组 其克隆到不同的细菌载体中，构建 “库 ”， 再从中进行筛选，是前景广阔的筛选方法（ ， 2003； ， 2004；2004）。尽管在具体操作过程中可能存在一些困难，例 如需对基因片段进行异源表达及筛选宿主等，但是运用该策略已有成功的先例，如 人（ 2004）分离到一种新的淀粉分解酶， （ 2004）分离到一种新的脂肪酶。 对于可培养微生物，可以直接进行菌种的筛选。筛选分离脂肪酶产生菌的方法因应用对象、微生物种类、酶的特性而有所变化，应力求准确、迅速、选择性强且易于自动化。常用的方法是用含有甘油三酯的琼脂平板，酶催化水解产生清晰的环带，也可利用生色底物或产脂肪酶微生物的某些特性。如宋欣等（ 2002）将采集到的土样富集培养后涂布含有橄榄油的初筛平板，根据菌落周围有无透 明圈及透明圈的大小筛选产脂肪酶菌株； 1986）利用生色底物 P 硝基苯辛酸盐、 P 硝基苯肉蔻酸盐和 P 硝基苯棕榈酸盐筛选对不同碳链长脂肪酸具有专一性的脂肪酶产生菌；我国研究者谢舜珍（ 1986）、王美英（ 1989）、陶文沂（ 1990）等采用油同化平板以油脂为唯一碳源进行同化试验，分别筛选出较高酶活菌株；金其荣等（ 1995）以固态氢化油为唯一碳源， 40 培养，筛出一株分泌高温脂肪酶的根霉菌；施巧琴（ 1981）采用脂肪酶水解脂肪后产生的脂肪酸与维多利亚蓝反应呈蓝绿色透明圈平板法筛选出产碱性中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 4 脂肪酶的扩展青霉 。 脂肪酶的结构及催化机理 微生物脂肪酶 少数为脂蛋白 ， 大多 数 为糖蛋白，其糖基部分约占分子量的 2%15%，以甘露糖为主 。脂肪酶的一级结构即氨基酸序列可以通过氨基酸序列测定得到，但是操作繁琐，费用昂贵。目前已知的脂肪酶蛋白的氨基酸序列大多是通过基因克隆、核苷酸序列测定，再通过核苷酸序列推导出来的。 脂肪酶氨基酸序列总体同源性不高。 2000）在收录前人研究成果的基础上，建立了一个脂肪酶蛋白质工程数据库 （ ，其网址是 数据库迄今为止对多达 92种微生物脂肪酶及与其同源的丝氨酸水解酶的序列、结构和功能进行了分类 、 总结和比较研究。通过多序列的比对，并根据其相似性程度的大小， 他们 把上述各种酶划分为 15个超家族 （ 和 32个同源家族 （ 。同源家族内，脂肪酶具有较高的序列相似性，而超家族之间序列相似性很低。所有脂肪酶一级结构中在活性 10个氨基酸较为保守，活性 近的 ， 1988） ，但是 68脂肪酶中的保守五肽序列是 ， 1992）。五氨基酸保守序列根据来源不同有差别，其中 真菌脂肪酶而言，这一序列的保守性更强。例如，霉菌脂肪酶的序列为 母菌脂肪酶 为 敏辰， 2001）。普遍认为保守五肽中的 与 水解机理 的一个过程，是催化 三联体 的成员之一；而 测其作用为增加保守五肽的柔韧性和减少空间障碍以便底物能与催化中心更好地结合和催化水解。 三维结构的研究是研究结构与功能关系的基本点。二十世纪九十年代开始利用 X衍射晶体结构研究技术研究脂肪酶的蛋白质三维结构，目前已有 10多种脂肪酶的三维结构通过 X衍射进行了研究。随着越来越多脂肪酶晶体的立体结构被阐明 （ ， 1990； ， 1990； ， 1994； ， 1999） ，人们发现这些脂肪酶在立体结构上有相似之处，即都有 /水解酶折叠（ 1992），中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 5 这一结构与丝氨酸蛋白酶的结构非常相似。通常的 /水解酶折叠模式为： 由 8个平行的 折叠片层组成一个中心，第三到第八个 折叠之间有 螺旋相连，排列在 折叠片的两侧， 折叠片为左手超螺旋缠绕。 不同来源的脂肪酶的 /水解酶折叠在这个基本模式的基础上有一些变化，其中高分子量脂肪酶和低分子 量脂肪酶有较大的差异。如 6个 折叠片（ ， 1997； ， 1998）； 269 9个 折叠片和 6个 螺旋（ ， 1990； ， 1992） ； 544 11个 折叠片和 17个 螺旋（ ， 1991）。各种脂肪酶的 折叠片的弯曲度差别较大，相应的 螺旋的空间位置也很不同。 脂肪酶的催化活性中心为 一个催化三 联 体（丝氨酸组 氨酸天冬氨酸或谷氨酸），此催化 三联体 的三个氨基酸在空间结构上非常靠近，以高度保守的几何取向位于中央 折叠一侧的 “ 环（ ” 中。在非激活状态下，脂肪酶的活性位点埋藏在一个 “ 盖子 ” 下，使得底物不能靠近活性位点。盖子是由双亲性螺旋构成，如 ， 1990）， ， 1991）， ， 1994）。而与抑 制剂结合的酶或者酶与微胶粒共结晶的立体结构显示，盖子的位置发生了变化，使得酶可以结合底物（ ，1991； ， 1993； ， 1994； ， 2002） 。打开盖子，暴露出一个大的疏水表面，而原先暴露的亲水区被埋藏到了蛋白的内部 （ ， 1993； ， 1994； ， 1993） 。 图 1毛状腐质霉脂肪酶 在关闭状态和激活状态时的三维结构，通过比较可以发现两种状态之间存在的变化。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 6 1毛状腐质霉脂肪酶（ 开放和关闭形式的三维结构 of A) of B) 羧基端的侧链 96， 201， 254， 87， 210（红色）位于外部的疏水区（黄色）外围，打开盖子后催化 三联体 （绿色）变得可以接近。盖子的旋转暴露出位于酶外表面的两性螺旋的疏水残基 。 摘自 ： ， 2002 96, 201, 254, 87, 210 (in at of in in of of at of 脂肪酶的性质 脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及 其他 一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出 其他 一些酶 的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（ 1997；1998）。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。 脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与 温度与 定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适 最适温度、 热 稳定性、等电点和 其他 生化性质方面存在不同（ ， 1990）。总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪 酶更广的作用 作用温度范围，高稳定性和活性，对底物有特异性（ ， 1998； ， 1998） 。 微生物脂肪酶按其最适作用 分为酸性、中性和碱性脂肪酶三类。例如，中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 7 肪酶的最适作用 酸性脂肪酶； 10，为碱性脂肪酶（邬敏辰， 2000）。 微生物脂肪酶的最适作用温度因来源不同也有很大的差异，例如 肪酶最适作用温度为 80 ，超嗜 热矿泉古生菌 1 脂肪酶 对硝基苯酚辛酸酯为底物确定最适温度为 90 （高仁钧等， 2001），为高温脂肪酶。高温脂肪酶均来源于细菌或古细菌，具有独特的高热稳定性的特点，其最适温度在 70 以上，有的甚至可以达到 110 。 肪酶的最适作用温度为 25 ，为低温脂肪酶。 脂肪酶的底物特异性主要表现在位置特异性、脂肪酸特异性和立体结构特异性。 脂肪酶的天然底物是三酰甘油酯，有三个酯键，因此可以发生水解反应的位置就有三个，根据脂肪酶对底物作用 的 酯键位置不同可以将其分为位置特异性脂肪酶和无位置特异性脂肪酶。顾名思义，无位置特异性脂肪酶